全 文 ：武汉植物学研究 1999, 17 (4) : 371～ 374
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
茉莉酸甲酯对中国红豆杉胚性细胞
紫杉醇生物合成的影响Ξ
余龙江　朱　敏　刘幸福　周　莹
(华中理工大学生命科学与技术学院　武汉　430074)
EFFECT OF M ETHYL JASMONATE ON TAXOL
B IOSY NTHESIS OF EM BRYO CELL
L INE IN TAXUS CH IN EN S IS
Yu L ongjiang　Zhu M in　L iu X ingfu　Zhou Y ing
(S chool of L if e S cience and T echnology , H uaz hong U n iversity of S cience and T echnology　W uhan　430074)
关键词　中国红豆杉, 胚性细胞系, 茉莉酸甲酯, 紫杉醇
Key words　T ax us ch inensis, Em bryo cell line, M ethyl jasmonate, T axo l b io syn thesis
紫杉醇 ( taxo l)是一种复杂的二萜类生物碱, 最初是从红豆杉类 (T ax us) 植物的树皮中分离出来的。
紫杉醇作为具有广谱抗肿瘤活性的药物而得到广泛的临床应用, 成为当今世界上有效的抗癌药物之一,
但其天然资源十分稀少, 解决其药源问题就显得非常重要。目前, 普遍认为采用红豆杉细胞悬浮培养生
产紫杉醇是很有希望的途径之一。而提高红豆杉细胞生长速率以及细胞中紫杉醇的含量是实现细胞悬
浮培养生产紫杉醇的两个关键因素, 笔者研究了茉莉酸甲酯 (m ethyl2jasmonate, 简称M J ) 在红豆杉细胞
培养中的代谢调节作用。茉莉酸甲酯是茉莉属 (J asm inum ) 中的素馨花中香精油的有气味化合物, 也是
茉莉宁 ( jasm ine)特殊香味的重要组成。它在各种植物中都有广泛分布。近期发现它在细胞的多种逆境反
应中起信号介导作用, 引起细胞抗逆反应产物的表达〔1～ 3〕, 对多种次生代谢产物的合成具有诱导作用。
笔者探讨了不同剂量的茉莉酸甲酯 (M J ) 在不同培养阶段添加对中国红豆杉 (T ax us ch inensis) 胚性细胞
生长及紫杉醇生物合成的影响, 并通过M J 与乙烯利 (ethylene)及精胺 (sperm ine)的协同作用实验, 探讨
了对紫杉醇生物合成的影响。
1　材料与方法
1. 1　细胞株和培养条件
实验所采用的细胞株为本实验室采用种子诱导并经过了 2 a 继代驯化的中国红豆杉胚性细胞株 E2
(呈颗粒状, 质地紧密)。培养基为本室设计的BM 培养基, 配方如下: KNO 3 1 011 m göL、M gSO 4·7H 2OΞ 收稿日: 1998209228, 修回日: 1999204226。第一作者: 男, 1966 年出生, 教授 (博士) , 从事生物技术及生物化工方面研究。国家科委“八五”、“九五”重点科技攻关资助项目 (85208206202, 962C02203201)。
170 m göL、CaC l2 332. 2 m göL、1ö2M S 的铁盐量, 外加微量元素、有机物、肌醇、蔗糖 40 göL , 激素为
2, 42D 0. 25 m göL , 定容后调 pH 5. 8。
取一培养至对数生长期的 2 L 三角烧瓶的悬浮细胞, 无菌抽滤后按接种密度为 12% 将鲜细胞接入
50 mL 摇瓶中, 培养基装量为 20 mL , 然后将摇瓶置于 24℃恒温以 140 röm in 转速进行振荡培养。分别
以不同浓度M J 在培养的不同时期 (0 d、10 d、20 d)加入培养基; 培养 30 d 时, 收获鲜细胞。所有结果均
为 2 组平行实验的平均值。
1. 2　茉莉酸甲酯实验
以吐温280 为助剂, 配制不同浓度的M J 母液。本实验采用单因子实验,M J 以 10、100、200 Λmo löL
的浓度 (培养基中助剂浓度为 2. 5 ΛL ömL ) 分别在不同时间加入到培养基中, 并分别以含吐温的培养基
以及不加任何助剂和M J 的培养基为对照,M J 采用过滤除菌方式加入培养基中。
1. 3　茉莉酸甲酯与其它生长调节物质协同的正交实验
在 1. 2 实验基础上, 进行了M J 与乙烯利、精胺正交实验。3 种生长调节物质皆在第 12 d 加入 (根据
1. 2 的实验结果) , 以期通过协同作用进一步提高紫杉醇的产量。
1. 4 测定方法
(1) 细胞鲜重 (FW )的测定: 减压抽滤, 并在抽滤过程中用蒸馏水冲洗鲜细胞, 称重。
(2) 紫杉醇含量测定: 见参考文献〔4〕。
2　结果与分析
2. 1　M J 对红豆杉细胞生长的影响
实验结果表明, 吐温对照与空白对照相比鲜重减少, 表明吐温在 2. 5 ΛL öL 浓度下对细胞生长有一
定的抑制作用。此外, 从图 1 可见,M J 对 E2 细胞的生长有明显的影响。以不同浓度M J 在不同培养阶段
加入, 对细胞生长都有不同程度的抑制作用, 且M J 在培养初期和培养至第 10 d 加入, 细胞的生长量与
M J 浓度之间都无明确的相关性; 但在第 20 d 添加M J 时则生物量随M J 浓度的增加而减少; 可见M J 对
细胞生长的抑制作用与细胞的生长状态有关,M J 对稳定期的细胞生长抑制最明显, 这可能和稳定期细
胞内源分裂素显著减少有关, 因为细胞分裂素可以拮抗M J 对细胞生长的抑制作用〔5〕。
图 1　不同浓度M J 在不同时间加入对
红豆杉细胞生长的影响
F ig. 1　Effect of M J added at differen t t im e w ith
differen t concen tration on grow th of T ax us cell
图 2　不同浓度M J 在不同时间加入对
紫杉醇生物合成的影响
F ig. 2 Effect of M J added at differen t t im e w ith
differen t concen tration on b io syn thesis of taxo l
2. 2　M J 对紫杉醇生物合成的影响
以不同的浓度M J 在不同的时间加入, 对紫杉醇产量的影响见图 2。
从图 2 可以看出,M J 加入时间和剂量与紫杉醇产量有明确的相关性。培养开始时 (0 d)加入M J, 这
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时各个浓度的M J 诱导作用都不大; 当M J 浓度为 200 Λmo löL 时, 紫杉醇产量最高, 提高了 15. 1% ; 而第
10 d、第 20 d 加入M J, 均在 100 Λmo löL 处出现最大值, 分别使紫杉醇产量提高了 140. 2% 和 13717%。
这表明M J 浓度有一个最适水平, 且以第 10～ 20 d 添加, 诱导作用显著。
比较图 1 和图 2, 不难发现,M J 对红豆杉细胞生长和紫杉醇生物合成都有影响, 但二者之间并无相
关性, 即M J 诱导作用并未呈现象真菌诱导物作用下的细胞生长和紫杉醇合成呈明显负相关性〔5〕, 表明
二者的诱导机理是不同的。M J 作为小分子信号子, 可直接介导由各种外部诱导子引起的可逆反应, 调节
相关基因表达, 诱导紫杉醇合成,M J 的加入时间和浓度与紫杉醇产量有明确相关性。M J 在对数生长期
初期至稳定期之前加入且浓度为 100 Λmo löL 时, 诱导作用显著。因此兼顾细胞生长与紫杉醇合成, 可选
择细胞对数生长期 (即培养 10 d 以后)加入M J。
2. 3　M J 与其它生长调节物质的协同作用
由于M J 诱导作用下, 细胞生长和紫杉醇合成之间并不存在明确的相关性, 因此可以在发挥M J 对
紫杉醇生物合成诱导作用的同时, 减少M J 对细胞生长的抑制作用, 从两个方面来提高紫杉醇产量。为
此设计了M J 与另外 2 种生长调节物质乙烯利、精胺协同作用的正交实验。正交实验表及实验结果见表
1, 统计分析见表 2。
表 1　正交实验及结果
T able 1　O rthogonal experim ent and resu lts
实验号
No.
M J
(Λmo löL ) 乙烯利Ethylene(m göL ) 精胺Sperm ine(m göL ) 紫杉醇产量Taxo l yield(m göL ) 细胞鲜重F resh w eigh t(göL )
1 0　 0　 0 0. 87 184. 4
2 0 7. 5 1 3. 78 198. 3
3 0 15 10 4. 02 204. 3
4 10 0 10 4. 26 273. 2
5 10 7. 5 0 3. 61 197. 7
6 10 15 1 4. 19 177. 0
7 100 0 1 2. 78 145. 6
8 100 7. 5 10 8. 73 145. 8
9 100 15 0 2. 43 126. 8
表 2　实验结果统计分析
T able 2　Statist ic analysis
项目
Item
试剂
R eagen t
k1 k2 k3 R
M J 2. 89 4. 02 4. 65 1. 76
紫杉醇产量
T axo l yield E thylene 2. 64 5. 37 3. 55 2. 73
Sperm ine 2. 30 3. 58 5. 67 3. 37
M J 195. 7 216. 0 139. 3 76. 6
细胞鲜重
F resh w eigh t E thylene 201. 0 180. 6 169. 4 31. 6
Sperm ine 169. 6 173. 6 207. 8 38. 1
　　从表 2 可见, 各因素对 T axo l 产量的影响由大到小为: R 精胺> R 乙烯利> RM J , 其中, 精胺的影响最显
著。精胺浓度的增加, 促进了细胞生长, 可见精胺协同M J 的诱导作用, 减小M J 对细胞生长的抑制, 使紫
杉醇产量随精胺浓度增加而增加。各因素对细胞生长的影响顺序为: RM J > R精胺> R 乙烯利, 最显著的影响
因子是M J, 高浓度M J 抑制细胞的生长。从实验结果及统计分析都可得出, M J 在 100 Λmo löL , 乙烯利
在 7. 5 m göL , 精胺在 10 m göL 时为最优组合 (实验号 8)。此时紫杉醇产量最高, 达 8. 73m göL , 比对照组
提高了 9. 03 倍。
M J 与乙烯利释放出的乙烯也能协同作用。乙烯作为植物激素, 可与其质膜上的受体结合使质膜上
的M J 受体活化, 从而表现出协同M J 诱导紫杉醇合成。很多研究亦表明, 多胺对细胞生长具有调节作
用, 能延缓细胞的衰老, 维持细胞活性〔6〕, 因此精胺可以减缓M J 对细胞生长的抑制作用。所以M J、乙烯
利、精胺三者协同作用可以在提高紫杉醇含量的同时, 维持细胞的生长活力, 从而进一步提高紫杉醇的
产量, 实验结果也证实了这一点。M irjalili 以及 Yuk im une 等的研究表明〔7, 8〕, 在M J 诱导作用下, 并采用
加入前体、代谢抑制剂等代谢调控手段, 可在此实验基础上进一步提高紫杉醇的产量。
373　第 4 期　　　　　　 余龙江等: 茉莉酸甲酯对中国红豆杉胚性细胞紫杉醇生物合成的影响
参　考　文　献
1　Stock igt J , O b itz P, Falkenhagen H et a l. N atu ral p roducts and enzym es from p lan t cell cu ltu res. P lan t Cell T iss
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2　Parchm ann S, Gundlach H ,M ueller M. Induction of 122O xo2phytodieno ic acid in wounded p lan ts and elicited p lan t
cell cu ltu res. P lan t P hy siol, 1997, 115 (3) : 1 057～ 1 064
3　Boh land C, Balkenho ld T , L oers G et a l. D ifferen tial induction of lipoxygenase isofo rm s in w heat upon treatm en t
w ith rust fungus elicito r, ch it in o ligo saccharides, ch ito san and m ethyl jasmonate. P lan t P hy siol, 1997, 114 ( 2) :
679～ 685
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5　余龙江, 李为, 刘幸福等. 中国红豆杉悬浮培养细胞固定化培养生产紫杉醇. 华中理工大学学报, 1998, 26 (5) : 1～ 4
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T ax us cell suspension cu ltu res. N atu re B iotechnol, 1996, 14: 1 129～ 1 132
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