全 文 ：显,主要是因为 Sb5 子座普遍比 Sb1的大。这可能
是因为青山湖湿润的环境不但有利于多糖合成, 也
有利于竹黄菌的生长,形成较大子座。
2. 9. 3 不同采样点短穗竹上单个竹黄多糖的量比
较: 不同采样点短穗竹上生长的单个竹黄多糖与竹
红菌甲素的量见表 2。
表 2 不同采样点短穗竹上单个竹黄多糖
与竹红菌甲素的量(x s, n= 3)
Table 2 Content of polysaccharide and hypocrellin A in each
S bambusicola stroma parasitizing at B densif lo-
rum from different sampling areas (x s, n= 3)
编号 多糖/ ( mg 个- 1) 竹红菌甲素/ ( g 个- 1)
Sb1 6. 35 0. 14 J j* 10. 62 0. 16 Cc
Sb5 8. 59 0. 16 Ee 9. 23 0. 21 Ee
Sb6 9. 21 0. 19 Cc 8. 40 0. 18 Ff
Sb7 8. 42 0. 20 Ff 9. 23 0. 25 Ee
Sb8 7. 96 0. 11 H h 10. 30 0. 13 Dd
Sb9 6. 89 0. 14 Ii 2. 62 0. 05 Ll
Sb10 4. 50 0. 05 Kk 6. 47 0. 10 Ii
Sb11 7. 88 0. 12 H h 6. 77 0. 13 H h
Sb12 6. 92 0. 08 Ii 5. 31 0. 10 Jj
Sb13 9. 07 0. 09 Dd 3. 22 0. 07 Kk
Sb14 8. 16 0. 18 Gg 16. 60 0. 29 Aa
Sb15 12. 43 0. 21 Aa 7. 48 0. 17 Gg
Sb16 10. 25 0. 23 Bb 11. 22 0. 24 Bb
* 不同大写字母标注的数字表示在 0. 01 水平差异极显著,不同
小写字母标注的数字表示在 0. 05水平差异显著
* Data marked with different capital letters m ean very signif icant
di ff erence at 0. 01 level , data marked wi th dif ferent small let ters
m ean signif icant dif f erence at 0. 05 level
由表 2可见,除个别差异性不显著外, 大多数不
同采样点短穗竹上寄生的竹黄在同一时期不论是
多糖还是竹红菌甲素的量均存在极显著的差异,可见
竹黄中这 2种主要有效成分的量受环境的影响较
大。那么不同采样点短穗竹上单个竹黄多糖与竹红
菌甲素的量之间是否存在相关性, 分析结果表明相
关性系数 R= 0. 143< R0. 01 = 0. 641, 可见两者之间
的相关性不显著, 可能是因为多糖与竹红菌甲素的
合成途径不同。
3 讨论
经查阅国内外文献, 未见有关竹黄菌子座多糖
量的报道。本实验分析比较了不同来源竹黄的多糖
量,并进行了差异性与相关性分析, 不但初步揭示了
竹黄多糖的变化规律, 而且为中药材竹黄的开发利
用提供了一定的理论依据与指导。
在竹黄多糖的测定中, 多糖的提取工艺与测定
方法对结果的准确性至关重要, 而对于竹黄多糖的
提取与分析,很少有现成的文献可供参考, 本实验经
过试验摸索,筛选出了以上的工艺与方法, 经验证其
精密度、重现性、稳定性、回收率等均较理想, 证明试
验方法稳定可行。
参考文献:
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促进剂组合对中国红豆杉细胞悬浮培养紫杉醇合成的影响
李干雄1, 2 ,张京维1, 2 ,骆雪兰1, 2 ,侯云屏1, 2 ,黄巧明1, 2*
( 1 梅州市杉维生物医药工程研究有限公司,广东 梅州 514031; 2 紫杉醇产业工程技术研究开发中心,广东 梅州 514031)
摘 要:目的 研究中国红豆杉 Taxus chinensis 细胞悬浮培养中蔗糖、柠檬酸三铵、水杨酸和氨基酸前体组合对细
胞生长和紫杉醇( tax ol)积累的影响。方法 采用 L9 ( 34 )设计试验,考察了第 9 天添加蔗糖( 10、16、22 g / L )、柠檬
酸三铵( 0、154、1 540 mg/ L) ,第 21 天添加蔗糖( 20、26、0 g/ L)和不同时间组合添加水杨酸及氨基酸前体 4 个因素
对红豆杉细胞悬浮培养和紫杉醇合成的影响。结果 当在细胞培养的第 0 天添加 1 67 mg / L 硝酸银, 第 9 天添加
10 g / L蔗糖 ,第 9 天添加 1 540 mg / L 柠檬酸三铵, 紫杉醇达到最高, 在此最优组合处理时紫杉醇质量浓度达到
39 2 mg / L ,相对于最差组合处理的( 2 1 mg/ L )时提高 18 7 倍。结论 促进剂组合对中国红豆杉细胞悬浮培养的
生长和紫杉醇的合成都有很明显的影响。
1552 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 2009- 11-04 基金项目:中小企业创新基金(国防科发计字[ 2008] 434号) ;山区及东西两翼技术创新项目( 2007915226)作者简介:李干雄( 1972 ) ,男,广东省五华人, 1994毕业于四川大学生物工程系微生物专业,生物技术工程师,主要从事红豆杉植物细胞大量培养生产紫杉醇的研究。Tel: ( 0753) 2183210 Fax: ( 0753) 2183269 E- mail : ganx ion gli@ hotmail com
关键词:中国红豆杉; 促进剂;紫杉醇; 正交设计
中图分类号: Q943 1; S791 49 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 09-1552-04
采用红豆杉植物细胞悬浮培养方法来生产紫杉
醇是生产紫杉醇原料药的一条很有希望的途径, 经
过专家们十多年的研究, 已经证明细胞培养方法生
产紫杉醇中诱导子(如甲基茉莉酮酸、硝酸银、水杨
酸、壳聚糖等)、氨基酸前体 ( Bhe、Lys、Trp、Gly
等)、各种碳源(蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、D-果糖等)和
营养物质(柠檬酸三铵、水解酪蛋白、水解乳蛋白等)
等都对红豆杉细胞生长和紫杉醇积累有明显的影
响[ 1-4] ,以前研究中已经证明, 在细胞培养的前期添
加硝酸银、在细胞培养的中期添加水杨酸、在细胞培
养的后期添加氨基酸前体, 能协同促进中国红豆杉
细胞培养中紫杉醇合成[ 5]。本实验在此基础上, 继
续采用正交实验设计,研究在水杨酸、硝酸银、氨基
酸前体这些促进剂合适的添加时间前提下, 重点研
究柠檬酸三铵的添加浓度和不同时间蔗糖的添加浓
度对红豆杉细胞生长和紫杉醇合成的影响, 并研究
柠檬酸三铵、蔗糖、水杨酸和氨基酸前体的最佳添加
浓度和添加时间的组合效果。
1 材料与方法
11 细胞株和培养条件[ 5] : 供试材料为梅州市杉维
生物医药工程研究有限公司组培实验室诱导筛选并
继代培养保存的高含紫杉醇的中国红豆杉细胞株[ 6] ,
以B5 为基本培养基[ 7] ,添加 1 mg/ L NAA、02 mg/ L
6-BA、30 g/ L 蔗糖、100 mg/ L Vc 和 292 8 mg/ L 谷
氨酸胺作为继代培养基。继代时采用 250 mL 的三角
瓶,内装 50 mL 的继代培养基,接入 50 mL 培养 14 d
的悬浮培养细胞,然后将摇瓶均匀置于( 24 1) 的
恒温室内的摇床上,以120 r/ min转速进行振荡培养,
细胞培养 14 d后作为种子做正交试验。
1 2 正交试验设计
1 2 1 因素和水平:根据 4因素 3水平 L9 ( 34 ) [ 8] 正
交试验表设计试验, 其中因素 A表示第 9天添加蔗
糖的浓度,分别为 10、16、22 g/ L , 因素 B表示第 21
天添加蔗糖的浓度, 分别为 20、26、0 g / L ,因素 C 表
示第 9天添加柠檬酸三铵的浓度, 分别为 0、154、
1 540 mg/ L; 因素 D为2 mg/ L 水杨酸和氨基酸( 10
mg/ L phe、10 mg/ L ly s、15 mg/ L trp、10 mg / L 氨
基乙酸)前体的添加时间,第 组试验在第 17 天添
加 2 mg/ L 水杨酸后第 20天再添加氨基酸前体; 第
组试验在第 26天添加 2 mg/ L 水杨酸后第 30天
再添加氨基酸前体; 第组作为对照组不添加。
1 2 2 因素配制和添加方法:配制浓度为 400 g / L
的蔗糖溶液,灭菌后按表 1设计的时间和浓度添加;
柠檬酸三铵配制溶液后,调溶液 pH 至 5 8,用 0 22
m 过滤器无菌滤过后添加; 水杨酸和氨基酸配制
溶液后各自用 0 22 m 过滤器无菌滤过后添加。
1 3 柠檬酸三铵、蔗糖、水杨酸和氨基酸前体的组
合试验:采用的生产培养基与继代培养基相同, 250
mL 的三角瓶装 100 mL 的生产培养基,无菌滤过接
入 7 g 鲜细胞(相当于0 4 g 干细胞) ,在细胞培养的
0天时添加 1 67 mg/ L 的硝酸银 [ 9] , 根据表 1进行
试验,细胞培养到第 37天收获, 取样检测细胞的生
物量和培养液中的紫杉醇量。
表 1 正交试验设计
Table 1 Orthogonal test design
水平 因 素
A/ ( g L- 1 ) B/ ( g L- 1) C/ ( mg L- 1 ) D/ d
1 10 20 0 17+ 20
2 16 26 154 26+ 30
3 22 0 1 540 不添加
1 4 测定方法
1 4 1 细胞鲜质量的测定:细胞培养物用 120目尼
龙筛网滤过,细胞用蒸馏水冲洗 3次后,再用干纱布
吸干细胞表面水分,在托盘天平上称其质量。
1 4 2 细胞干质量的测定: 鲜细胞置于恒温烘箱
中, 60 烘干至恒重,用分析天平称其质量。
1 4 3 培养液中紫杉醇的测定: 取 10 mL 培养液,
加入等体积的 10 mL 二氯甲烷萃取 3次, 合并萃取
液并减压回收二氯甲烷, 干物质用甲醇溶解定容后
用 HPLC检测。采用Waters HPLC,分离柱是反相
硅胶柱( Nova-Pak C18 , 150 mm 3 9 mm, 4 m) ,流
动相为甲醇-乙腈-水( 29 27 44) , 柱温为 35 ,
体积流量 1 mL/ m in, 洗脱时间 11 min, 在 227 nm
用紫外检测器检测,紫杉醇定量采用外标法,每次进
样量为 5 L,紫杉醇标准品为 SIGMA公司生产。
2 结果与讨论
2 1 正交试验:结果见表 2。
2 2 促进剂对中国红豆杉细胞培养生物量的影响
2 2 1 促进剂对中国红豆杉细胞培养鲜质量的影
响:表 2试验结果表明, A 3B2 C2D 1 组合时细胞鲜质
量最高,即第 9天添加 22 g/ L 蔗糖和 154 mg/ L 的
柠檬酸三铵,第 21天添加 26 g/ L 蔗糖和第 17天添
加 2 mg / L 水杨酸与第 20天添加氨基酸复合液。
1553中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
表 2 中国红豆杉培养正交实验结果
Table 2 Experimental results of cell suspension culture of T chinensis by orthongonal design
组 合
因 素
A B C D
结 果
鲜质量/
( g L- 1)
干质量/
( g L- 1 )
培养液中紫杉醇/
( mg L- 1)
1 1 1 1 1 233 0 9 00 2 10
2 1 2 2 2 297 2 17 60 7 52
3 1 3 3 3 209 6 11 40 39 20
4 2 1 2 3 257 4 17 20 11 50
5 2 2 3 1 298 8 13 20 17 20
6 2 3 1 2 226 8 13 00 17 70
7 3 1 3 2 256 0 15 80 12 50
8 3 2 1 3 250 4 16 60 14 40
9 3 3 2 1 306 4 17 00 6 24
鲜质量( g L- 1) 246 60 248 80 236 73 279 40
鲜质量( g L- 1) 261 00 282 13 287 00 260 00
鲜质量( g L- 1) 270 93 247 60 254 00 239 13
干质量( g L- 1) 12 67 14 00 12 87 13 07
干质量( g L- 1) 14 47 15 80 17 27 15 47
干质量( g L- 1) 16 47 13 80 13 80 15 07
紫杉醇( m g L- 1) 16 27 8 70 11 40 8 51
紫杉醇( m g L- 1) 15 47 13 04 8 42 12 57
紫杉醇( m g L- 1) 11 05 21 05 22 97 21 70
代表水平 1之和的平均值, 代表水平 2之和的平均值, 代表水平 3之和的平均值
indicates average of sum of resu lt s in level 1, in dicates average of sum of resu lt s in level 2, indicates average of sum of result s
in level 3
2 2 2 促进剂对中国红豆杉细胞培养干质量的影
响:表 2试验结果表明, A 3B2C2D2 组合时细胞干质
量最高,即第 9天添加 22 g / L 蔗糖和 154 mg / L 的
柠檬酸三铵,第 21 天添加 26 g/ L 蔗糖、以及第 26
和 30天组合添加 2 mg/ L 水杨酸与氨基酸复合液。
2 3 促进剂对中国红豆杉细胞培养紫杉醇合成的
影响: 表 2 结果表明, A 1 B3C3D3 组合紫杉醇量最
高,细胞培养的第 9天不宜添加过多的蔗糖, 以添加
10 g/ L 蔗糖紫杉醇量最高, 添加蔗糖浓度越高, 紫
杉醇量越低;细胞培养的第 9 天添加柠檬酸三铵效
果最好,以添加 1 540 mg / L 的柠檬酸三铵时紫杉醇
量最高,添加 154 mg/ L 的柠檬酸三铵时与对照比
较反而要低;细胞培养的第 21天以不添加蔗糖时紫
杉醇量最高,添加蔗糖浓度越高, 紫杉醇量越低; 细
胞培养的前期不宜添加水杨酸和诱导子和氨基酸前
体类物质,过早添加水杨酸诱导子和氨基酸前体类
物质时抑制紫杉醇合成; 从正交试验的组合项 3 可
以看出此实验结果, 最优组合时紫杉醇达到 39 2
mg/ L, 比最差组合项 1的 2 1 mg/ L 高 18 7倍。
3 讨论
正交试验结果表明, 不同时间蔗糖的添加浓度、
第 9天添加柠檬酸三铵的浓度、水杨酸和氨基酸前
体的添加时间对红豆杉植物细胞培养的生长和紫杉
醇的合成都有很明显的影响;同时添加蔗糖和柠檬
酸三铵时,培养液中高浓度的蔗糖抑制了柠檬酸三
铵的促进效果,只有在培养液蔗糖浓度较低时, 柠檬
酸三铵促进紫杉醇合成的效果才比较明显;低浓度
的柠檬酸三铵不起作用, 只有较高浓度的柠檬酸三
铵才起到促进作用。试验结果还表明, 水杨酸和氨
基酸前体应该在后期添加好,跟前期试验结果相一
致[ 5 ]。众多研究文献已经证明蔗糖、柠檬酸三铵、水
杨酸和氨基酸前体单独添加时都能明显促进紫杉醇
的合成[ 1-4] ,但本次实验没有发现蔗糖、柠檬酸三铵、
水杨酸和氨基酸进行组合实验时出现协同促进作
用,可能这些因素之间会有比较复杂的相互作用,不
同促进剂浓度和不同促进剂添加时间的组合能影响
紫杉醇的合成。将在此试验的基础上继续深入研究
多种因素组合对红豆杉细胞培养生长和紫杉醇合成
的影响。
参考文献:
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羊开口药材的名实考证
蒋受军1 ,钟小清2 ,吕高荣2 ,张南平3 , 邹节明2* ,肖新月3*
( 1 广西壮族自治区药品检验所, 广西 南宁 530021; 2 桂林三金药业股份有限公司,广西 桂林 541004;
3 中国药品生物制定检定所, 北京 100050)
摘 要:目的 对民间常用中药材羊开口原植物来源进行考证。方法 考查本草文献中羊开口原植物和药用部位
的记载及附图,野外调查羊开口药材原植物的来源, 通过产地药农收集羊开口原植物标本, 核对原植物标本并咨询
分类专家。结果 目前市场上羊开口原植物来源是野牡丹科展毛野牡丹和野牡丹的根,部分地区同时混杂多花野
牡丹和毛稔的根。结论 为更好地制定羊开口新的药材质量标准, 并为羊开口药材收购提供依据, 保证羊开口药
材的质量。
关键词:羊开口; 植物来源;资源调查
中图分类号: R281 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 09-1555-03
2010年版中国药典[ 1] 附录收载羊开口为展
毛野牡丹 (广州植物志又名肖野牡丹) Melastoma
normale DDon 的根 [ 1]。展毛野牡丹收载于南宁
市药物志、福建民间草药、陆川本草、万县中
草药、云南中草药选、广西本草选编等地方性
本草中; 全国中草药汇编、中药大辞典、中华本
草等大型综合性本草对肖野牡丹和野牡丹分别进
行了论述,并对各省地方性本草分别进行了综合论
述。羊开口是 20 世纪 50年代到 70年代从民间用
药整理出来的一味民间药材, 并由于中成药的生产
和利用逐渐成为大宗商品药材。羊开口有野牡丹根
(福建、四川)、痢疾罐(贵州)、白爆牙郎、大金香炉
(广西)、老虎杆(重庆万县)等多种别称。羊开口收
载于广西中药材标准1990 年版, 味甘、酸、涩, 性
温,具有收敛、止血、解毒的功效, 用于泄痢、崩漏带
下、内外伤出血[ 2]。羊开口是三金片系列中成药产
品的重要原料, 年产销量为 2 106 ~ 3 106 kg, 药
材主产于广西、云南、贵州、四川、福建、重庆等省市,
是上述省市酸性土壤的优势植物品种。羊开口药材
产销集中度较高、商业流动性较低,主要用于中成药
生产的原料。为了保证中成药生产及羊开口药材的
质量, 对羊开口商品药材进行原植物来源调查
和考证。
1 羊开口药材植物来源调查、药材性状鉴定及相近
种植物分类检索表
1 1 羊开口药材植物来源调查:笔者通过近几年的
中草药资源调查及对主产区羊开口药材植物来源专
项调查发现,目前羊开口药材的商品主要来源于展
毛野牡丹及同属植物野牡丹 M candidum D Don
的根, 同时在部分产区同属植物多花野牡丹 M
af f ine D Don和毛稔 M sanguineum Sims的根
亦作为羊开口使用。羊开口分布区域比较窄,主要
分布在广西灵川以南, 贵州独山、铜仁以南,重庆万
县以南,四川泸州以南, 福建三明以南, 云南南部和
广东大部分地区的狭窄区域及东南亚部分国家。通
过调查研究产区药农采集羊开口标本,初步鉴定后,
装订标本,并在广西植物研究所标本馆进行标本核
对,并由广西壮族自治区植物研究所李光照研究员
对标本进行最终鉴定。通过对产地实地调查研究和
采集的标本鉴定后, 发现羊开口药材的主要植物来
源为展毛野牡丹和野牡丹的根。在羊开口产地, 羊
开口阳枝(产地习惯将羊开口地上不带茎叶的粗茎
1555中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 9 期 2010 年 9 月
* 收稿日期: 2009- 12-15 作者简介:蒋受军,男,副主任药师,博士研究生。
* 通讯作者 邹节明 T el: ( 0773) 5842588 E- mail: zjm@ sanjin com cn肖新月 T el: ( 010) 67095432 E- mail: xiaox y@ nicpbp org cn