全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(6)：534～538
Journal of Wuhan Botanical Research
硝态氮对黄瓜子叶谷氨酰胺合成酶和
谷氨酸脱氢酶活性的影响
王云华，王志强，张楚富 ，周忠新，马敬坤，欧吉权
(武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室，武汉大学生命科学学院，武汉 430072)
摘 要 ：在硝态氮存在或缺乏的条件下 ，测定了黄瓜(Cucumis sativus I ．)种子萌发和子叶发育过程中子叶可溶性
蛋白质含量以及谷氨酰胺合成酶(Gs)和谷氨酸脱氢酶(NAD(H)一GDH)活性的变化。在子叶发育初期，无论外源氮
存在与否，每对子叶可溶性蛋白质含量和 GS、NADH—GDH、NAD 一GDH活性随发育上升。在外源氮存在下，第 4 d
后，可溶性蛋白质含量虽有所下降，但基本保持恒定；第6 d后，GS和NADH—GDH活性逐渐降低，NAD 一GDH却
相反增高。但在无外源氮条件下，于第 4 d后，可溶性蛋白质水平以及GS、NADH—GDH和NAD 一GDH活性都逐渐
降低。在子 叶发育 的整个过程中，外源氮对 GS和 NAD+-GDH活性有促进作用，尤其是在子叶发育 的后期对
NAD+-GDH活性的促进更为明显 。
关键词：谷氨酰胺合成酶；谷氨酸脱氢酶；硝态氮；黄瓜子叶；发育
中图分类号 ：Q946．5；$642．2 文献标识码：A 文章编号 ：1000—470X(2004)06—0534—05
Effect of Nitrate Nitrogen on Activities of Glutamine Synthetase and
Glutamate Dehydr0genase during Development of Cucumber Cotyledon
W ANG Yun—Hua，WANG Zhi—Qiang，ZHANG Chu—Fu。，ZHOU Zhong—Xin，
MA Jing—Kun。OU ji—Quan
(Key Laboratory of MOE for Plant Developmental Biology，Colege of Life Sciences，Wuhan University．Wuhan 430072．China)
Abstract：The content of the soluble protein and the activities of glutamine synthetase and gluta—
mate dehydrogenase were determined in the development of cucumber(Cucumis sativus L．)
cotyledon at the presence or absence of nitrate．In the early days of the development。the level of
the protein and the activities of GS，NADH—GDH ，and NAD 一GDH in each pair of cotyledons in—
creased whether exogenous nitrogen was existent or not．After 4 days，the level of the protein
was constant roughly，though it was declined little at the presence of the exogenous nitrogen．
The activities of GS and NADH—GDH fell gradually，but NAD 一GDH was raised markedly．At
the absence of the exogenous nitrogen， the levels of the protein， GS， NADH—GDH ， and
NAD 一GDH decreased gradually at the same stage．In the whole course of the development．the
activities of GS and NAD 一GDH increased by exogenous nitrogen．and NAD 一GDH activity was
promoted remarkably in the late stage of the development particularly．
Key words： Glutamine synthetase； Glutamate dehydrogenase； Nitrate； Cucumber(Cucurnis
sativus L．)cotyledon；Development
谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthethase，GS，
EC 6．3．1．2)是高等植物氨同化的关键酶，在植物
氮代谢中起着重要作用叫。GS催化谷氨酸酰胺化生
成谷氨酰胺，这一反应需要 ATP和二价金属离子
收稿日期：2004—02—23．修回日期；2004—05—26。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30270130)。
作者简介：王云华(198o一)．男，硕士研究生．从事植物生化和分子生物学研究。
· 通讯作者(E—mail：cfzhan8：@whu．edu．on)。
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第 6期 王云华等 ：硝态氮对黄瓜子叶谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脱氢酶活性的影响 535
参与。该酶与谷氨酸合酶(GOGAT)构成的循环是
高等植物氨同化的主要途径[1]。GS存在多种同工
酶 ，它们分别由不同的核基因编码 ]。根据GS同工
酶在组织和亚细胞中的定位，可分为胞液型 GS
(GS1)和叶绿体／质体型 GS(GS2)，它们在植物体
内起着非重叠的作用L3]。GS同工酶在不同发育阶段
的时空表达受到许多因素，诸如氮素的类型、光质、
碳代谢物以及逆境等的影响 ]。
NAD(H)一谷氨酸脱氢酶[NAD(H)一glutamate
dehydrogenase，NAD(H)一GDH，EC 1．4．1．2]催化
一 对可逆反应：a一酮戊二酸加氨生成谷氨酸和谷氨
酸脱氨生成 a一酮戊二酸[6]。曾有人认为 GDH是同
化氨的初始酶，但是因为其对氨的高 K ，故该酶在
氨同化中的作用颇有争议。最近则认为 GDH可能
只限制在谷氨酸的代谢中起作用[7]。氨的初始同化
发生在 GS／GOGAT循环中，它承担着无机氮转化
成有机氮的主要作用L8]。GDH的脱氨反应在于使谷
氨酸脱氨产生 a一酮戊二酸，向三羧酸循环提供碳骨
架；在高氨、逆境以及碳骨架受限制时，它的脱氨作
用保证为三羧酸提供充足的碳骨架L9 。。
黄瓜是葫芦科双子叶植物，在种子萌发过程中，
种子以及子叶的贮藏蛋白质降解，产生铵离子、氨基
酸。铵离子被同化成新的氨基酸，为新生组织的发育
提供营养物质。随着子叶的发育和绿化，它从单纯的
贮存器官转变成有光合作用能力的器官。碳素和氮
素的来源从单纯的依靠贮存的营养物质，转成至少
部分依赖于自身的合成和外界的供给。根吸收的外
源氮和子叶同化的碳素起着越来越重要的作用。在
这个过程中，子叶内与此过程相关的酶必定要有一
个大的变化来适应这个过程。笔者旨在研究黄瓜种
子萌发 和子叶 发育过程 中 GS、NADH—GDH 和
NAD+-GDSH等酶的活性变化、蛋白质水平变化以
及这些酶活性变化与外源氮同化的关系。
l 材料和方法
植物材料培养 黄瓜(Cucumis satlvus L．)种
子唐优一号由种子站购买。种子先用 0．1％ HgCI
溶液浸泡消毒 10 min，然后用蒸馏水漂洗干净，于
30℃浸种24 h后散播在双层滤纸上催芽24 h，注意
保持湿润。然后移植到盛有用 pH6．5的营养液浸润
过 的沙子 的搪 瓷盘 中继续培养，搪瓷盘规格为
4O em×30 emx3 em。每隔 1 d补充适量的营养液，
其问用蒸馏水保持湿润。营养液含有13．33 mmol／L
KNO3(无氮组为13．33 mmol／L KC1)，4 mmol／L
CaC12，2．66 mmol／L NaH2PO4，2 mmol／L MgSO4，
0．8 mmol／L H3BO3，0．98 mmol／L CaC12，0．15／~mol／
L ZnS0 ，1．32／~mol／L CuSO4，35．7／~mol／L FeC13，
8．9,umol／L MnC1 。白炽灯下培养，光照强度为
120 mo1．m ·s_。，昼／夜温度为 29～32℃／20～
23℃。分别于播种后的第 1 d(即浸种后第 3 d，此时
子叶部分出土)、第 2 d(此时子叶已完全出土)各取
材1次。以后每隔1 d取材 1次。总发育天数从开始
浸种计算。
酶液的制备 按文献[11]介绍的方法从子叶中
提取酶液，每克鲜重材料加入 3 mL提取缓冲液。
可溶性蛋白的测定 按 Bradford的方法L1 ]测
定可溶性蛋白质含量。总蛋白量以每对子叶中所含
的蛋白的毫克(rag)数计算。
GS活性的测定 按Zhang等的方法进行[1¨。
一 个 GS活性单位定义为每分钟于 37 C催化1 mo1
的 一谷氨酰异羟肟酸( 一glutamylhydroxamate)的
产生所需要的酶量。总GS活性计算以每对子叶每
小时催化产生的 7一谷氨酰异羟肟酸微摩尔(／~mo1)
数表示。
NAD(H)一GDH活性的测定 按照 Loulakakis
和 Roubelakis—Angelakis的方法进行L1引。以每分钟
于 30。c氧化或 还原 1 mo1的辅酶 (NADH 或
NAD )定义为一个酶活性单位。总活性计算以每
对子叶每小时氧化或还原辅酶的微摩尔(~mo1)数
表示 。
每个取样时间段选择生长一致的子叶2～4 g，测
定每克(g)鲜重材料的各项指标(包括子叶数)，然后
按每对子叶计算各项指标。所有实验至少重复3次。
2 结果
2．1 子叶发育过程中可溶性蛋白水平的变化
在子叶发育初期，无论在有氮或无氮条件下，每
对子叶的可溶性蛋白质含量随发育天数的增加而明
显上升，于第 4 d达到最高(图 1)。自第 6 d后，有氮
条件下的蛋白质水平虽有降低，但总体保持相对稳
定，只是在第 14 d后又有所下降；但是无氮条件下
的子叶蛋白质含量则随发育进程而逐步下降，至第
14 d，只相当于有氮条件下同时间的蛋白质水平的
39．3 9／6。
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536 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
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Time after sowing(d)
图 1 不同发育阶段每对子叶可溶性蛋白水平的变化
Fig．1 The change of the soluble protein in each
pair of cotyledons at the different development stages
2．2 子叶发育过程中 GS活性的变化
在子叶部分出土时(即浸种开始后第 3 d)，无论
培养介质中是否有氮，两者的活性基本相同(图2)。
但随着发育的进程，GS活性逐步升高，于第 6 d达
到最高，但两者升高的幅度不同，分别相当于第2 d
的24．4倍和17．7倍。与可溶性蛋白水平相比，其活
性的升高稍显滞后。其后随着发育进程而下降。有
氮和无氮条件下的变化趋势相同，但有氮条件下的
活性相对较高。当发育至第 14 d时，两者的GS活性
分别相当于最高活性的 72．5％和 57．9％。可见外源
氮的存在对 GS活性的变化有着明显的影响。
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 l0 l1 l2 1 3 14 1 5
Time after sowing(d)
图 2 不同发育阶段每对子叶 GS活性的变化
Fig．2 The change of GS activity in each pair of
cotyledons at the different development stages
2．3 子叶发育过程中 NADH—GDH的变化
在子叶发育的前期，无论是在有氮或是在无氮
下，随着子 叶的发育，NADH—GDH 的活性逐步升
高，只是无氮下的活性略高于有氮的活性(图 3)。第
6 d的活性达到最高。在有氮的条件下，子 叶中
NADH—GDH的活性基本保持不变；但在无氮条件
下，其活性则逐步下降。
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图 3 不同发育阶段每对子叶 NADH—GDH活性的变化
Fig．3 The change of NADH—GDH in each pair of
cotyledons at the different development stages
2．4 子叶发育过程中NAD+-GDH的变化
在有氮和无氮条件下，子叶的 NAD+-GDH活
性在不同发育阶段的变化趋势明显不同。在有氮条
件下，随着子叶生长天数的增高，NAD+-GDH活性
逐渐增高，而且从第 8 d后，其活性增长的幅度明显
提高(图 4)。第 14 d的活性是第 3 d的 3．3倍。然而
在无氮条件下，前期 NAD+-GDH活性逐步升高，第
4 d达到最高；随着发育的进行，其活性降低，于第
14 d，其活性只相当于同期有氮条件下的 27 9／6。表明
外源氮的加入对其活性有着很显著的促进作用。
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Time after sowing(d)
图 4 不同发育阶段每对子叶 NAD+-GDH活性的变化
Fig．4 The change of NAD 一GDH in each pair of
cotyledons at the different development stages
3 讨论
在黄瓜种子萌发初期，每对子叶的 GS活性是
比较低的，但随着发育的进行，于第 6 d，即子叶完全
伸展时，达到最大值，然后随着发育天数逐渐下降。
在向日葵种子萌发和子叶发育初期阶段同样观察到
GS活性由低到高的变化L】 。在菜豆中也有类似的
变化趋势[1 。硝酸盐对GS活性有一定的促进作用。
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第 6期 王云华等：硝态氮对黄瓜子叶谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脱氢酶活性的影响 537
这与芥菜子叶发育观察到的硝酸盐促进 GS活性的
现象是一致的L】 。
与 GS活性变化趋势不同，NAD(H)一GDH在
黄瓜子叶发育过程中都维持较高的活性，尤其是在
有氮条件下和发育的后期，NAD+-GDH活性显著
升高。在多种高等植物种子萌发过程中，都观察到
GDH的活性升高[】 。但是，GDH在氨同化中的作
用仍然是有争议的。在玉米中，GDH缺失突变体的
标记和抑制剂研究表明：GDH不催化其加氨方向的
反应psi；也有实验表明 GDH活性不但受高氨的诱
导，而且 Gulati和 Robin发现，衰老、暗处理、盐胁
迫或重金属中毒都会导致 GDH活性的升高[9 。在
这些情况下，GS的活性都是 降低的。因此，推测
GDH可能作为 GS在不利情况下活性降低的一种
补偿。在这种情况下，GDH依赖于NADH的还原氨
基化反应是对 GS／GoGAT氨同化途径的补充。我
们观察到在外源氮存在下，NADH—GDH在黄瓜子
叶发育的后期仍维持较高的水平也许就属于这样的
情况。
尽管 GDH在氨同化中的作用存在不同的看
法，但是其催化脱氨反应的重要性越来越受到人们
的肯定，认为其主要作用在于催化谷氨酸脱氨产生
2一酮戊二酸，向三羧酸循环提供碳骨架。GDH很可
能在植物 C／N比例较低的时候，催化脱氨方向的反
应，使氨基酸脱氨基，产生碳骨架。例如在萌发的种
子和衰老的叶片中即存在这样的作用[5]。在我们的
实验中，在无外源氮的条件下，在发育的前期，储存
糖和储存蛋白降解，碳素和氮素输出，为新生蛋白质
合成提供碳架和氮源。在这一阶段表现出GS活性
和可溶性蛋白水平的升高；当子叶开始光合作用后，
碳素水平升高，而氮素却处于不足状态，子叶可溶性
蛋白水平下降反映了这种变化。
然而，在有外源氮存在下，在子叶发育的后期，
GS活性虽然降低，但 NADH—GDH保持较高水平，
这也许是可溶性蛋白水平仍维持较高水平的原因。
NAD+-GDH活性在整个发育阶段都在上升，这既
反映了子叶发育初期对碳骨架的需要，又反映了发
育后期随着子叶的衰老，光合能力下降，氮素在组织
内的积累，C／N比下降。Aubert和 Melo—Oliveira认
为 GDH可能只是当植物碳素受限制时才显得特别
重要[】 。 ，Miflin等认为 GDH催化可逆反应的两
个方向不但在细胞和亚细胞间，而且在时间和空间
上是分开的L5]。GDH两种不同酶活性的变化也许反
映出代谢上的需要。
参考文献 ：
[1] Miflin B J，Lea P J．Ammonia assimilation[A~．In：
Miflin B J ed．The Biochemistry of Plants．Vo1．5．
Amino Acids and Their Derivatives[M]．New York：
Academic Press．1980．1 69— 202．
[2] Tingey S V，Tsai F Y，Edwards J W，Walker E I ，
Coruzzi G M． Chloroplast and cytosolic glutamine
synthetases are encoded by homologous nuclear
genes which are differentially expressed in vivo[J]．J
Biol Chem ，1988，263：9 651— 9 657．
[3] Edwards F L，Walker G M．Coruzzi G M．Cell—spe—
cific expression in transgenic plants reveals nonover—
lapping roles for chloroplast and cytosolic glutamine
synthetase[J~．Proc Natl Acad Sci USA，1 990，87：
3 459— 3 463．
[4] Lain H M，Coschigano K T，Oli、，eira I C，Melo—O—
liveira R，Coruzzi G M ．The molecular genetics of
nitrogen assimilation into amino acids in higher
plants[C]．Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，
1996，47：569— 593．
[5] Miflin B J，Habash D Z．The role of glutamine syn—
thetase and glutamate dehydrogenase in nitrogen as—
similation and possibilities for improvement in the ni—
trogen utilization of crops[-J]．J Exp Bot，2002，53：
979— 987．
[6] El—Shora H M，Abo—Kassem E M．Kinetic charac—
terization of glutamate dehydrogenase of marrow
cotyledons[J]．Plant Science，2001，161：1 047一
l O53．
[7] Robinson S A，Slade A P，Fox G G，Phillips R，
Rateliffe R G，Stewart G R ．The role of glutamate
dehydrogenase in plant nitrogen metabolism [J]．
Plant Physiol，1991，95：509— 516．
[8] Hodges M．Enzyme redundancy and the importance
of 2-oxoglutarate in plant ammonium assimilation
FJ]．J Exp Bot，2002，53：905—916．
[9] Gulati A，Jaiwal P K．Effect of NaCI on nitrate re—
ductitase，glutamate dehydrogenase and glutamate in
Vignaradiata Calli[J]．Bio Plant．1996．38：177一
l83．
[1O] Robin S A，Slade A P，Fore G G．Philips R，Rad—
cliffe R G，Stewart G R．The role of GDH in plant
nitrogen metabolism[J]．Plant Physio1．1991，95：
5O9— 5l 6．
[11] Zhang C F，Peng S B，Peng x x，Chave A Q，Ben—
nett J．Response of glutamine synthetase isoforms to
nitrogen sources in rice(Oryza sativa I ．)root FJ]．
Plant Science．1997。125：1 63— 170．
维普资讯 http://www.cqvip.com
538 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
[12] Bradford M．Rapid and sensitive method for the
quantitation of microgram quantities of protein utiliz—
ing the principle of protein—dye binding[J]．Anal
Biochem，1976，72：248— 254．
[13] Loulakakis K A，Roubelakis—Angelakis K A．Intra—
celular 1ocalization and properties of NADH—gluta—
mate dehydrogenase form Vitis vinifera I ．：Purifica—
tion and characterization of the major leaf isoenzyme
I-J]．J Exp Bot，1990，41：1 223—1 230．
[-14] de la Haba P，Cabello P，Maldonado J M．Glutamine
synthetase isoforms appearing in sunflower cotyle—
dons during germination[J]．Planta，1992，186：
577— 581．
[15] Le6n E，de la Haba P，Maldonado J M．Changes in
the levels of enzymes involved in ammonia assimila—
tion during the development of Phaseolus vulgaris
seedlings[J]．Physiol Plant，1990，80：2O一26．
[1 6] Sehumidt S，Mobr H．Regulation of the appearance
of glutamine synthetase in mustard(Sinapis alba L．)
l173
1,18]
[19]
1,2o]
cotyledons by light，nitrate and ammonium [J]．
Planta。1989，177：526— 534．
Srivastava H S，Singh R P．Role and regulation of I 一
Glutamate dehydrogenase activity in higher plants
I-J]．Phytochemistry，1987，26：597—610．
Magalhaes J R，Ju G C，Rich P J，Rhodes D．Kinet—
ics of Nitrogen一1 5一labeled ammonium ion assimila—
tion in Zea mayslJ]．Plant Physiol，1990，94：647—
656．
Aubert S。Blingny R，Douce R，Gout E，Ratcliffe R
G，Roberts J K M．Contribution of glutamate dehy—
drogenase tO mitochondrial glutamate metabolism
studied by C一13 and P-31 nuclear magnetic resonance
I-J]．J Exp Bot，2001，52：37—45．
Melo—Oliveira R．Oliveira 1 C．Coruzzi G M．Ara—
bidopsis mutant analysis and gene regulation define a
non—redundant role for glutamate dehydrogenase in
nitrogen assimilation I-J]．Proc Nat Acad Sci USA，
】996。93：4 7】8— 4 723．
维普资讯 http://www.cqvip.com