全 文 ：首都师范大学学报(自然科学版)第 19卷　第 2期
1998 年 6 月
Journal of Capital Normal University
(Natural Science Edition)
Vol.19 , No.2
June　1998
收稿日期:1996-10-30
＊国家自然科学基金资助项目
＊＊现通讯地址为北京农业大学农学系
满江红鱼腥藻 glnA基因上游调控区的克隆
及其序列分析＊
高志环＊＊　刘祥林　印莉萍　吴晓强　邱泽生
(首都师范大学生物系)
摘 要
　　以满江红鱼腥藻(Aac)提取总 DNA 为模板 , 通过 PCR技术 , 扩增得到其谷氨酰胺合成酶基因
(glnA)上游区.经酶切得到 409 bp 的片段 ,并将其连接到 pBluescript Ⅱ ks+上测序.将测序结果与
Anabaena 7120 调控序列比较 ,有 98.2%的同源性.在上游调控中也具有 nif-like 和 E.coli-like启动
子 ,值得注意的是 , 调节蛋白 VF1 的结合位点正好位于 nif-like启动子上.所克隆的片段不但对蓝
藻固氮 、泌氨的基因调控研究具有意义 , 也对表达载体的构建具有实用价值.
关键词:满江红鱼腥藻 , 谷氨酰胺合成酶基因 , 上游调控序列.
中图分类号:Q949.22.
谷氨酰胺合成酶(GS)是生物体氮代谢和氨转运的关键酶之一.在高等植物同化氨途径
中 ,它是第一个酶.在固氮蓝藻中 ,它的作用更为突出.固氮酶把氮还原为氨 ,GS 要迅速催化将
NH+4 转给 α-酮戊二酸生成谷氨酸 ,再通过 ATP 供能进一步还原为谷氨酰胺 ,供藻细胞合成
利用.
GS的分子生物学研究已在多方面展开 ,在植物 、动物 、微生物中都有研究报道.目前 ,世界
上研究 GS的焦点在于:(1)GS作为氮代谢的关键酶 ,是从无机氮(包括固氮)转化为有机氮的
门户;通过研究 GS来研究 、调控植物氮代谢;(2)GS 是抗除草剂(膦化麦黄酮 PPT)的关键 ,它
的活性高低与抗性有直接关系;(3)GS基因的表达有组织器官专一性 ,又受环境和发育因子的
影响 ,这与其启动子有密切的关系;(4)GS基因家庭各成员的功能及其相互之间的关系[ 1] .
本文利用基因工程的方法 ,将蓝藻 Anabaena azolla GS 基因(glnA)的启动子克隆于大肠
杆菌中 ,并测序 ,与蓝藻 Anabaena SP .7120 glnA 启动子部分序列比较 ,探讨它可能的启动模
型 ,为进一步研究该启动子特征和人为调控 GS(反义 RNA 技术)打下基础 ,也为开发利用启
动子构建实用载体提供了第一手材料.
1　材料与方法
1.1　蓝细菌的培养和纯化
1.1.1　蓝藻的培养
满江红鱼腥藻(A .azollae)是植物所施定基先生惠赠.用 BG-11无氮培养基于英国 Gal-
lenlamp型光照冷却旋转培养箱中培养 ,转速 130r/min ,光强 3 000 1x ,培养温度 30±1 ℃, 14 d
换一次培养液.若用通气培养 ,7 d换一次培养液.
1.1.2　蓝藻的纯化
配制含 1.5%琼脂的 BG-11无氮固体平板.在超净工作台上用接种环取少量蓝藻悬液 ,在
固体平板上划线 ,然后置于 2 000 1x 、25 ℃恒温光照培养 , 20 d后 ,从平板上挑取单菌落重新划
线 ,重复 3次.在光学显微镜下检查纯化情况.
1.1.3　藻体的收集
用日立 20PR-52D型高速离心机 12 000g ,10 min ,倒掉上清 ,取藻体于-20 ℃冰箱中保存
备用.
1.2　蓝藻总 DNA的提取
(1)称量一个离心管的重量 ,加入藻培养物 , 10 000g 离心 5 min ,弃上清 ,称重确定细胞
重;(2)用饱和 NaI悬浮细胞:1 g 细胞需要 2 ml NaI(2 g/ml H2O)37 ℃20 min;(3)用水洗细
胞 ,稀释 NaI , 10 000g 离心 5min ,弃上清;(4)用 8 ml TES(Tris-EDTA-SODIUM)重新悬浮细
胞 ,用 18G 针头的注射器吸注数次 ,使之充分悬浮;(5)每克细胞加入 1.25 ml溶菌酶(50 mg/
ml Tris-HCl)混匀 , 37 ℃20min;(6)每克细胞加入 1ml 10%的十二烷基肌氨酸钠 ,缓慢颠倒离
心管 ,37 ℃20 min;(7)加入等体积的平衡酚 ,在摇床上缓慢摇振 60 min;(8)离心 10 min
(10 000 g),转移上相液 ,在上相液中加入等体积的氯仿 ,摇床上摇 30 ～ 45 min;(9)离心 10min
(10 000 g),吸取上相液 ,加入 1/10体积的 3 mol·L-1的醋酸钠和 2 ～ 2.5倍体积的 100%乙
醇 ,振荡均匀 , -20 ℃下放置过夜;(10)离心 10 min(12 000g),弃乙醇;(11)用 70%的乙醇洗
涤 ,12 000g 离心 5 min ,弃去乙醇;(12)用无菌水溶解 DNA ,加入 50μg/ml的蛋白酶 K 保温 1
h;(13)用酚 、酚∶氯仿 、氯仿各抽提一次 ,用 95%的乙醇沉淀 DNA ,70%的乙醇洗涤 ,溶于无菌
水中.
1.3　总 DNA的酶切与检测
参考文献 2 、3中酶切与溴化乙锭染色检测方法.
1.4　满江红鱼腥藻 glnA gene前半部分的 PCR及 PCR产物的检测
引物是根据 Anabaena7120 g lnA gene[ 5]的序列设计的 ,其序列为:
primer1∶5 tactg c ctg cagcat tcct tcttc 3
　　　　(横线处为 pstⅠ的识别位点)
primer2∶3 tt tgg taag ttaatcgaagc　　5
引物对所在位置如图 1 ,其中 R为 EcoRⅠ酶切位点 , ※为引物所在位置.
按参考文献 2 、3中提供的方法.
循环参数:94 ℃　30 s 、50 ℃　60 s 、72 ℃　120 s , 30个循环.
1.5　满江红鱼腥藻 glnA上游调控区的克隆
(1)用限制性内切酶 EcoRⅠ和 PstⅠ分别切割 PCR产物和载体 pBluescript Ⅱ ks+.
55第 2 期 高志环等:满江红鱼腥藻 glnA 基因上游调控区的克隆及其序列分析
图 1　引物位置示意图
(2)将两种酶切产物混合 ,经过 promega的 MagicTM PCR Preps DNA 纯化系统纯化 ,得到
不含蛋白质的 DNA混合物 ,其中包括切开的 pBluescript Ⅱ Ks+质粒 、glnA 基因的上游区片
段.
(3)取上述混合物8μl ,加入 T4DNA连接酶 5个单位与5X buf fer 4μl ,加水至20μl.4 ℃连
接过夜.
(4)转化及筛选
A.感受态细胞的制备(氯化钙法)及转化
参照文献 3
B.重组子的筛选(兰白筛选)
从平板上挑取白色菌落(10个),分别在含有抗生素的培养基的试管中 37 ℃振荡培养过
夜 ,第二天用碱法提质粒 ,在 0.8% agarose gel上 100 V 电泳一小时 ,在紫外灯下观察结果 ,选
取大小符合要求的质粒进行酶切(EcoRⅠ),从中选出两个质粒再次用双酶切(EcoR Ⅰ &Pst
Ⅰ).然后进行 Southern杂交.
Southern杂交参照文献[ 2 ,3] .
1.6　测序
重组质粒的提取纯化:
用碱法提取重组质粒 DNA ,用 RNA酶去除 RNA ,酚 、酚∶氯仿 、氯仿各抽提一次 ,电泳 ,检
查 DNA 的纯度并估计 DNA的量.
测序使用 ABI公司 370 DNA SEQUENCER自动分析仪测得.
2　结果与讨论
2.1　蓝藻总 DNA的提取
利用 NaⅠ-溶菌酶-十二烷基肌氨酸钠结合法提取 DNA ,是利用 NaⅠ有高度的溶解度 ,使
细胞处于高渗状态而脱水 ,使细胞壁松动 ,这样有利于溶菌酶作用于蓝藻细胞壁.这种方法比
较温和 ,有利于提取完整的 DNA.
2.2　满江红鱼腥藻 glnA gene上游区的 PCR
PCR的引物是根据 Anabaena 7120的 glnA gene序列设计的 , 5 端加入了 PstⅠ的酶切位
点 ,PstⅠ的切点在蓝藻 g lnA 基因中缺失 ,因此十分有助于下一步将 PCR产物酶切 ,连接到质
粒上.
从图 2 可以看出 ,引物的专一性很强 ,只有一条产物带出现 ,且分子量基本符合要求(约
1 kb).
56 首都师范大学学报(自然科学版) 1998 年
图 2　满江红鱼腥藻 glnA gene
上游区的 PCR
2.3　满江红鱼腥藻 glnA gene上游区的克隆 、转化与筛选
pBluescript ks+质粒含有 lacZ gene 的调控区及前端 146个氨
基酸的编码区 ,能与受体菌产生 α互补作用 ,在 IPTG 的诱导下
产生半乳糖苷酶使菌在生色底物 X-gal存在下形成蓝色菌落.将
外源基因插入到 lacZ 序列中 ,使该基因失活不具互补作用 ,产生
白色菌落.因此 ,白色菌落可能为重组子.
根据Anabaena 7120 的 DNA 酶切位点推测 ,满江红鱼腥藻
g lnA 基因上游的 409 bp和 860 bp 处可能具有 EcoRⅠ的酶切位
点.如果用它来切割 PCR产物 ,可能会得到三条片段:409 bp 、451
bp 、219 bp.由于 409 bp和 451 bp两条片段大小十分接近 ,很难通
过电泳把它们分开纯化 ,因此 ,用 PstⅠ和 EcoR Ⅰ双酶切后 ,以二
者的混合物与 PBluescript Ⅱ Ks+连接.从 4 号菌的质粒单酶切
(Pst Ⅰ o r EcoRⅠ)和双酶切(PstⅠ &EcoRⅠ)结果以及 Southern
杂交结果看 ,4号菌的质粒能双酶切出一小片段(约 409 bp),而单酶切只有一条带 ,为所需阳
性克隆.见图 3.
图 3　(A)重组质粒酶切 、电泳与(B)S outhern杂交
P:Pst Ⅰ酶切;E:EcorⅠ酶切;P+E:PstⅠ &EcoRⅠ双酶切;M:λ/ EcoRⅠ +HindⅢ Marker
2.4　序列分析
序列测定的结果进一步证实 4号菌为内含 409 bp的满江红鱼腥藻 glnA基因上游的阳性
克隆.与 Anabaena 7120 glnA gene上游区序列比较 ,同源性为 98.2%.
在该序列中也存在 nif-like promoter 和 E.coli-like promoter ,值得注意的是 ,VF1调节蛋白
的结合序列与 nif-like promoter重叠 ,说明 VF1因子的作用与 nif-like promoter功能的关系极
其密切.glnA gene上游调控区序列为:
CTGCAGCATT CCTTCTTCTC CCAATCTT TG CTATCTATGG TTTGATATTA AT TTGGTTGC
ACTACGCACC CAGTAAATTT TTGTGCTATT AAAAATAGAT TCGGCACAAA AACAATCTAT
CTGT TACTTA AGGATT TTAT GCCAAAGTTG ACCCCTATGA GATTAAGTTT CTCCCTT TTG
TGCAGATGTC GAAAGAAAGG T TAATATTAC CTGTAATCCA G ACGTTCTGT AACAAAGACT
A CAAAACCAT CTAATGTTTA GAA TCTAGGA TATTTCAGGT GTGTCATCAA CTTTGTTCCG
CTCAGTAGGG TTTAGATGCT TTGGCAGATT CTGGTTTGAA T TTAAGAAAT TGGCAGAGAA
GGAGTAACAA TGAC
＊＊＊为 nif-like 启动子 , ＊＊＊为 E.coli-like 启动子 ,斜体为 VF1识别序列
57第 2 期 高志环等:满江红鱼腥藻 glnA 基因上游调控区的克隆及其序列分析
谷氨酰胺合成酶在 Anabaena azolla 的氨转运过程中起关键作用 ,它在营养细胞和异形细
胞中都存在 ,但在不同的环境中使用不同的启动子.在氨存在的培养基中 ,两个启动子都启动 ,
但主要是 E.coli-like promo ter启动.nif-like promoter启动很微弱.在无氨的培养基中生长时 ,
基本上利用 nif-like promo ter[ 5] .
g lnA gene的调节可能是通过一种VF1蛋白因子来调节的.VF1因子是由 bif gene表达产
生的[ 6] .VF1能和 glnA gene的 nif-like启动子结合 ,调控其启动.bif基因的表达是受到什么信
号调节? 它与 glnA基因的调控关系如何 ?有待我们进一步探究.
现已知道 VF1能与 nif gene 、glnA gene 、xisA gene 上游调节区等结合 ,说明可以调节这三
个基因的表达 ,而这三个基因的表达与满江红鱼腥藻的固氮和氨利用以致向胞外泌氨有直接
关系 ,它们三者的表达关系将是我们今后要研究的问题.同时可利用所克隆的调节区构建具蓝
藻启动子的穿梭载体 ,具有实用价值.
参 考 文 献
1　印莉萍 , 刘祥林 ,林忠平.植物谷氨酰胺合成酶基因以及基因表达.生物工程进展 , 1995 , 15(2):36 ～
41
2　(美)J萨姆布鲁克 , E F 弗里奇 , T 曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南.第二版 ,北京:科学出版社 , 1992.
3　卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术.北京:高等教育出版社 , 1993
4　Golden J W , Robinson S J ,Haselkorn R.Rear rangement of nitrogen fix ation genes during heterocy st differ-
entia tion in the cyanobacterium Anabaena .Nature , 1985 , 314(4):419～ 423
5　Tumer N E , Robinson S J , Haselkorn R.Different promoters for the Anabaena glutamine sy thetase gene
during g rowth using molecular o r fixed nitrogen.Nature , 1983 , 306:337 ～ 342
6　Taifen Wei , T S Ramasubramanian , Frances P U et al.Anabaena SP strain PCCC 7120 bifA Gene Encod-
ing a Sequence-Specific DNA-Binding Protein Cloned by In V ivo T ranscriptional Interference Selection.J
Bacteriol , 1993 , 175(13):4025 ～ 4035
7　Chastain C J , Brusca J S , Ramasubrumanian T S et al.A sequence-specific DNA-binding factor(VF1)from
Anabaena SP strain PCCC7120 vegetativ e cells binds to three adjacent sites in the XisA upstream region.
Journal of Bacterio logy , 1990 , 172(9):5044～ 5051
Cloning and Nucleotide Sequence of Leader
Region of glnA from Aac
Gao Zhihuan　Liu Xianglin　Yin Liping　Wu Xiaoqiang　Qiu Zesheng
(Department of Biology , Capital Normal Universi ty)
Abstract
The total DNA derived from Anabeana azol la(Aac)was used as template and the up-stream
of g lnA gene was obtained by PCR.The derived 409 bp element w as linked to pBluescriptⅡ KS+
plasmid af ter digested w ith restriction endonulease.The sequence result indicated that this glnA
gene promoter has 98.2%homology w ith the one obtained from Anabaena 7120.In addi tion , it
contained the E.coli-like and nif-like promoters in up-st ream .Noteworthly , the binding site of
regulatory pro tein VF1 is right on nif-like promoter.This cloned fragment is valuable for not only
the research of regulatory genes in the N2-fixing and secreting NH+4 of Arabeana azolloa but also
for the construction of expressive vectors.
Key words:Anabeana azol la , glutamine synthetase gene (glnA), Upstream regulatory se-
quence.
58 首都师范大学学报(自然科学版) 1998 年