全 文 ：武汉植物学研究 2001, 19( 5) : 416～420
Journal of Wuhan Botanical Research
压片法检查蓝藻液泡

郭厚良1　赵以军2　吴红艳2
( 1.武汉大学生命科学学院, 武汉　430072; 2.华中师范大学生命科学学院, 武汉　430079)
摘　要: 鱼腥藻 7120( A nabaena sp. PCC 7120)在含 0. 1 mol/ L NaCl的条件下培养 4 d, 90%
以上细胞液泡化。若在正常条件下培养, 1个多月之后部分细胞开始液泡化,随着培养时间延
长, 液泡化细胞比例逐渐提高。液泡化藻丝材料在玻片上经手指轻轻施压, 细胞破裂,液泡从
细胞破裂处释出。所释放液泡完全透明, 大小不等,可在相差显微镜下显示,个别液泡可弹至
细胞外远处。无机盐诱导的液泡化和细胞衰老引起的液泡化之间具有明显的平行性。
关键词: 蓝藻; 液泡; 压片法
　　中图分类号: Q949. 22　文献标识码: A　文章编号: 1000-470X( 2001) 05-0416-05
Determination of Vacuoles from the Blue-green
Algae by Squash Method
GUO Hou-Liang
1
, ZHAO Yi-Jun
2
, WU Hong-Yan
2
( 1. Col leg e of L if e S ci ences, W uhan Unive rsity, Wuhan　430072, Ch ina;
2. Col leg e of L if e Sc iences, C entral China Normal Univ er si ty, Wuhan　430079, Chin a)
Abstract: The blue-green alg a A nabaena sp. PCC 7120 w as g row n in the medi-
um containing 0. 1 mol/ L NaCl for 4 d and over 90% of cells became vacuola-
ted. If they were g row n in the common condit ion for over month, only a part
of cell s began vacuo lation. The cultures were dropped on slide and a f ilter pa-
per was put on the cover slip to absor b the surplus w ater. A light pressure on
the cover slip w as made by a thumb to break some vacuolated cells. Some vac-
uo les w ere released f rom the vacuolated cells. The vacuoles w ere fully t rans-
parent, varied in size, they have no t be showed under general microscope but
under phase contrast micr oscope. Tw o kinds of cell vacuo lations by salt induc-
ing or by ag ing have par al lelism.
Key words : Blue-gr een algae; Vacuoles; Squash method
蓝藻是否有液泡或是否能形成液泡至今还是一个不清楚的问题。这一问题在20世纪

收稿日期: 2001-01-02,修回日期: 2001-05-10。基金项目:国家自然科学基金资助项目(批准号: 39870083)。
作者简介:郭厚良( 1940- ) ,男,教授,主要从事细胞工程研究。
70年代以前曾进行过许多研究, 但最终没有形成一个统一的看法。许多研究者在蓝藻的
细胞学工作中都发现蓝藻细胞内存在一种泡状结构,多数人将这种泡状结构称为液泡
( Vacuoles[ 1 5] )。但其他一些人则另有所称, 如称为液泡状内含物( Vacuole-like inclu-
sions[ 6] ) , 膜状内含物( M embranous inclusion[ 7] ) ,泡状体( Vesicle[ 8] )。另有一些研究则发
现异常条件引起类囊体膨胀为液泡式结构( Vacuole-like structure[ 9] )。对于这些研究形成
了两种对立的看法:一种认为蓝藻细胞在走向衰老时会形成液泡 [ 10] ; 另一种则认为,所谓
蓝藻液泡可能只是一种人工假象[ 11]。遗憾的是, 这方面的研究在 20世纪 70年代以后中
断,于是蓝藻究竟有无液泡就成为一个悬而未决的问题。植物和真菌液泡的研究表明,要
深入研究液泡,分离液泡是一个先决条件。植物和真菌的液泡均在 20世纪 60年代借助原
生质体得到分离 [ 12, 13] , 而蓝藻原生质体(球)技术则长期不能过关[ 14] ,这可能是蓝藻液泡
研究工作停顿的重要原因。最近十多年来, 我们在蓝藻原生质球研究方面进行了长期持续
不断的努力,在原生质球制备[ 15]、培养再生[ 16]和融合 [ 17]方面都取得了进展,正是在原生
质球工作中逐渐接触和认识到了蓝藻液泡。先经电镜检查出无机盐诱导形成的液泡 [ 18] ,
随后又发现了细胞液泡 [ 19] , 在此基础上采用原生质球途径进行了液泡分离, 取得成
功[ 20 , 21]。新近,我们又找到了检查蓝藻液泡的一种新方法——压片法,这一方法能完全直
观地显示液泡在细胞破裂时从细胞释放的过程,从而进一步证明了蓝藻液泡的存在。
1　材料和方法
本试验主要用鱼腥藻 7120( A nabaena sp. PCC 7120) ,这是一种具异形胞的丝状固氮
蓝藻(图 1: 1) ,引自中国科学院水生生物研究所。采用 Allen氏液体培养基作静止培养,
间或振荡, 培养在恒温光照培养箱中进行, 24 h连续光照,光照强度 2 000 lx , 培养温度
28℃±0. 5℃。
1. 1　无机盐诱导处理
将材料培养 4 d,加入 NaCl至 0. 1 mol / L ,在含盐条件下继续培养, 在显微镜下检查
细胞液泡化出现。
1. 2　液泡的压片检查
分别对无机盐诱导的液泡化材料和正常培养 1个月以上的藻丝材料作压片处理。压
片时,取藻丝悬浮液 1滴置于载玻片,加盖玻片后用滤纸敷于盖玻片之上,以手掌将滤纸
轻压,令滤纸吸去多余水份,然后再用大拇指在盖玻片上轻压一下,除去滤纸,置于相差显
微镜下观察。
1. 3　显微摄影和照片洗印
由于液泡不能在普通光学显微镜下显示,观察及显微摄影均在 Olympus 相差显微镜
下进行,使用高反差显影液冲洗胶片和洗印照片,并将照片输入电脑作背景处理以进一步
增大反差,最后通过电脑用 Epson 照片打印机打印全套照片。
2　结果和讨论
2. 1　NaCl诱导液泡的压片检查
藻丝材料在含 NaCl的条件下培养 4 d之后, 90%以上细胞液泡化(图 1: 2)。与正常
细胞相比较, 液泡化细胞体积增大, 形态球形化, 细胞形态球形化表明细胞壁受到影响。
417　第 5期　　　　　　　　　　　　郭厚良等: 压片法检查蓝藻液泡
1.未处理藻丝,×800; 2. NaC l诱导的液泡化藻丝,×800; 3, 4.经压片处理液泡化细胞破裂释放
液泡,× 800; 5. 培养 1个月零 12 d的藻丝, × 800; 6.压片后释放液泡, 材料培养 1 个半月,
×800; 7.培养半年以上的藻丝,×800; 8.培养半年以上的细胞通过压片释放液泡,×800
1. Unt reated t richome,×800; 2. Vacuolated t rich om e by NaCl in duct ion, ×800; 3, 4. Releas ing
of vacu oles f rom vacuolated cell s by squash,×800; 5. T richom e grow n for one mon th and 12 d,
×800; 6. Releas ing of vacu oles fr om cells grow n for 1 month and 15 d,×800; 7. Trichome grow n
for over 6 month s,×800; 8. Releasing of vacuoles f rom cel ls grow n for over 6 months , ×800
图 1　压片法显示蓝藻液泡
Fig. 1　Sh ow ing the vacuoles of b lue-green algae by squash method
　压片试验表明,液泡化细胞对外部压力不能承受,很容易受压破裂。如操作适当,使大多数
细胞保持完整,少数细胞发生破裂,就可以发现液泡从破裂的细胞释出(图 1: 3, 4)。这种
液泡有的比较大, 有的则很小,大小很不一致。如果对盖玻片施加的压力太大,例如,用大
拇指施压 3次以上,或使用铅笔头对盖玻片敲击, 正如作植物根尖压片那样,将会引起细
胞全部破裂, 而液泡也被压破。如果多数细胞保持完整,少数细胞被压破,大量未破裂的细
胞就起到一种支撑作用,使释放的液泡不受压力而得到保护。
2. 2　细胞液泡的压片检查
对正常培养的细胞进行显微检查注意到,藻丝细胞在培养 1个多月后开始出现细胞
液泡化(图1: 5)。随着培养时间的延长,液泡化细胞比例逐渐提高,到培养半年以上后,细
胞大多数液泡化, 液泡化程度也比较高,与无机盐诱导的液泡化极为相似(图 1: 7) ,培养
1个多月和半年以上 2种材料经压片处理均可引起细胞破裂和释放液泡(图 1: 6, 8)。
在学术交流时总有人提出, 由电镜所检查到的泡状体(液泡)是否只是一种人工假象?
通过原生质球破裂释放的泡状体(液泡)是否并非液泡,而是原生质体等等。虽经解释,但
仍有人持怀疑态度。此处借助压片法直观地显示液泡从细胞释出,既未经电镜技术处理,
418 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　　第 19卷　　
不存在电镜操作中的假象, 也未作原生质球分离处理,完全排除原生质球或原生质体。因
此,压片法检查蓝藻液泡为蓝藻液泡的真实存在提供了一个更为简捷的证明方法。此法既
可以检查无机盐诱导形成的液泡,也可以检查自身的细胞液泡,用于其他蓝藻可得到一样
的结果。
虽然初步的研究已经表明较老的材料细胞液泡分离率较高, 年轻的材料细胞液泡分
离率低 [ 19]。但通过压片法检查液泡释放并不能确切检查液泡的释放频率,即不能检查能
释放液泡的细胞占所检查的全部细胞总数的比例,这主要有 4个方面的原因: 第一,压力
较轻,细胞破裂少,大多数细胞不能得到检验。压力过大,细胞可达到几乎全部破裂,但液
泡也跟着被压破, 故无法统计。第二, 如果属细小的液泡, 细胞压破后裹在粘稠的细胞质中
不能立即释放,初看之下,细胞似乎并未释放液泡,其实不然。第三,较大的液泡有时会在
细胞破裂时被弹出细胞,因此看上去附近无液泡的破细胞并非就没有释放液泡。第四,一
个细胞破裂时释放的液泡数目和大小是不确定的, 液泡数目和破细胞数目并不能确立一
种对应关系。由于这样一些原因,压片法对液泡的释放只能作定性检查,而不能作定量测
定;同时,也不能用于液泡的分离。
2. 3　无机盐诱导液泡化和细胞衰老过程的平行性
我们发现, 特定无机盐诱导蓝藻引发的细胞学过程和蓝藻细胞自然衰老的细胞学过
程之间存在明显的平行性。第一,无机盐诱导和衰老都引起蓝藻细胞液泡化,并通过压片
法可靠地检查到液泡的真实存在。不同的是, 无机盐诱导的液泡化进程很快,在 1～2 d之
内就明显出现。而衰老引起的液泡进程缓慢, 培养 1个多月才慢慢出现, 而且发展很慢,液
泡化细胞比率较低。第二,伴随液泡化都发生细胞体积的明显增大和形态的球形化。第三,
2种细胞对机械压力的敏感性较之对照年轻细胞明显提高, 表明细胞壁结构在一定程度
上发生损伤。这种平行性强烈地暗示无机盐诱导引起的生物学过程类似细胞衰老,这一点
为探讨无机盐诱导的生理机理提供了线索。
近年来, 植物细胞的程序化死亡引起了许多研究者的注意。如果将衰老引起蓝藻细胞
液泡化和随之而来的细胞解体界定为由基因顺序表达引起的细胞程序化死亡,那么,由无
机盐诱导的蓝藻细胞液泡化应视为提前启动了细胞程序化死亡过程。多次重复试验已经
确定, 在 0. 05～0. 1 mo l/ L NaCl条件下培养鱼腥藻 7120,随着液泡化的发展, 细胞解体
破裂, 表现为一种快速的细胞凋亡,液泡化细胞的 DNA 降解、细胞凋亡以及分离液泡中
相关的蛋白酶活性均已检测到。与蓝藻细胞自然衰老过程不同的是,由无机盐诱导的蓝藻
细胞液泡化具有不确定性。随着培养条件的变更,液泡化可能逆转。应属于一种可控制的
细胞凋亡,这方面的问题有待深入研究。
参考文献:
[ 1 ]　Geit ler L. Versu ch einer Losu ng des Heterocys tem- Problems . S ber A kad Wiss W ien, Mat-Nat K 1 I , 1921,
130: 223 245.
[ 2 ]　von Zas t row E M. Uber die or ganis at ion der Cyanophyceenzelle. A rch Mikrobiol , 1953, 19: 174 205.
[ 3 ]　Draw ert H, Metzner-K
ster I. Fluorescenz-und elek t ronenm ik-rosk op isch e U ntersuch ungen an B egg iatoa alba
und Thiethr ix niv ea . A rch Mikr obiol , 1958, 31: 422 434.
[ 4 ]　Jen sen T E, Bowen C C . Organ izat ion of the cent roplasm in N ostoc p runif or me. L ow a Acad S ci Pr o, 1961, 68:
86 89.
419　第 5期　　　　　　　　　　　　郭厚良等: 压片法检查蓝藻液泡
[ 5 ]　Peat A, Whit ton B A . En vi ronmen tal effect s on the s t ructure of the blue-green algae, Chlorogloea f r itschi i.
A rch Mikr obiol , 1967, 57: 155 180.
[ 6 ]　Pankrat z H S, Bow en C C. Cytology of blue-gr een algae, 1. Th e cell s of Symp loca muscor um. A mer J Bot,
1963, 50 : 387 399.
[ 7 ]　Echl in P. Int ra-cytoplasmic m embr anous inclus ion s in the blue-green algae, A nacy stis nidulans. A rch M ikrobi-
ol , 1964, 49 : 267 274.
[ 8 ]　Edw ards M R, Ber ns D S, Ghiors e W C, e t al . U lt ra-st ructure of the thermophil ic blue-green alga, Sy nechococ-
cus l iv id us Copeland. J Phycol, 1968 4 : 283 289.
[ 9 ]　Findley D L, Walne P L , Holton R W. The effect s of l ight intensity on th e u lt ras t ructure of Chlorogloesa
f ri tschii M itr a grow n at h igh temperatu re. J P hycol , 1970, 6 : 182 188.
[ 10]　Desikach ary T V. Cyanophyta. New Delhi : Ih dian Council of Agricultural Research, 1959.
[ 11]　Carr N G, Whi tton B A. T he Biolog y of Blue-green Algae. L on don: Blachwell Scient if ic Publ ications , 1973.
142.
[ 12]　Cockin g E C. A meth od for th e isolat ion of plant protoplast s and vacuoles . N ature, 1960, 4 741 : 962 963.
[ 13]　In dge K J . Th e isolat ion and propert ies of the yeast cel l vacu ole. J G eu Microbiol, 1968, 51 : 441 446.
[ 14]　郭厚良.蓝藻原生质球研究的现状及存在问题.武汉植物学研究, 1988,6 : 173 178.
[ 15]　郭厚良.青霉素- 溶菌酶法分离蓝藻原生质球,植物学报, 1990, 32 : 510 513.
[ 16]　郭厚良,金传荫,宋文贞.丝状固氮蓝藻柱胞鱼腥藻原生质球的培养再生.植物学报, 1996, 38 : 637 640.
[ 17]　郭厚良,陈贤均, 金传荫. PEG诱导的柱胞鱼腥藻 ( Anabaena cy lind ri ca)原生质球融合.武汉大学学报(自然科
学版) , 1996, 42 : 459 462.
[ 18]　郭厚良,黄开耀,易平,等. KCl 诱导柱胞鱼腥藻形成液泡.水生生物学报, 1998, 22 : 198 199.
[ 19]　郭厚良,金传荫,浦秋文,等.鱼腥藻 PCC 7120细胞液泡的初步研究.水生生物学报, 1999, 23 : 363 367.
[ 20]　郭厚良,易平,浦秋文, 等.鱼腥菏 sp. PCC 7120 液泡的诱导和分离.武汉大学学报(自然科学版) , 2000, 46 :
246 248.
[ 21]　郭厚良,金传荫,浦秋文,等.鱼腥藻 PCC 7120原生质球和液泡的同步诱导.水生生物学报, 2001, 25 : 92 94.
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