全 文 ：南京农业大学学报 2010，33 ( 6) : 38 － 42
Journal of Nanjing Agricultural University http:
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/ /nauxb. njau. edu. cn
收稿日期: 2010 － 06 － 03
基金项目: 国家科技重大专项重点课题项目 ( 2009ZX08004 － 011B)
作者简介: 王新卫，硕士研究生。* 通讯作者: 乔玉山，副教授，主要从事果树育种与生物技术研究，E-mail: qiaoyushan@ njau. edu. cn。
王新卫，章镇，朱月林，等． 神秘果素基因合成及其液泡积累表达载体 DC-miraculin 的构建 ［J］. 南京农业大学学报，2010，33 ( 6 ) :
38 － 42
神秘果素基因合成及其液泡积累表达
载体 DC-miraculin的构建
王新卫，章镇，朱月林，高志红，乔玉山*
( 南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095)
摘要: 在不依赖神秘果 ( Synsepalum dulcificum Daniell) 植物资源的条件下，根据已报道的神秘果素基因序列合成 24 条
寡核苷酸引物，通过重叠延伸 PCR法合成了神秘果素全基因。为使神秘果素导向液泡积累，利用菜豆蛋白 C末端四肽的
液泡定位功能，在人工合成基因的 3末端加入了编码液泡定位短肽的核苷酸序列。将该基因序列插入植物表达载体
YH4215，成功构建了神秘果素植物双元表达载体，命名为 DC-miraculin。载体上的神秘果素基因由双 CaMV35S启动子控
制，转基因植物的报告基因为 gusA，抗性筛选标记为潮霉素抗性基因 hpt。
关键词: 神秘果素; 基因合成; 液泡; 载体构建
中图分类号: Q812 文献标志码: A 文章编号: 1000 － 2030 ( 2010) 06 － 0038 － 05
Synthesis of miraculin gene and construction of its plant expression
vector DC-miraculin with miraculin accumulated in vacuole
WANG Xin-wei，ZHANG Zhen，ZHU Yue-lin，GAO Zhi-hong，QIAO Yu-shan*
( College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)
Abstract: The miraculin gene was synthesized from 24 chemical synthesized oligo primers based on the reported nucleotide
sequence of miraculin by overlap extension PCR method，though the lack of gene template． In order to direct the miraculin to accu-
mulate in vacuole，the nucleotide sequence of C-terminal tetrapeptide of phaseolin with sufficient information for vacuolar sorting
was fused to 3 terminal of the miraculin gene，and the modified gene was inserted into the plant expressing vector YH4215，con-
structing a new vector designated DC-miraculin for expressing miraculin in plant． Miraculin gene in this vector was under the control
of double CaMV35S promoter，and gusA and hpt were the reporter gene in transgenic plant and hygromycin resistance gene as
selected marker，respectively．
Key words: miraculin; gene synthesis; vacuole; vector construction
神秘果 ( Synsepalum dulcificum Daniell) 是山榄科 ( Spotaceae) 植物，原产于非洲热带，其果实中
含有的神秘果素 ( miraculin) 是一种变味蛋白，果肉在口中咀嚼后，再吃酸味食物时人的味觉却是甜
的，它也因此而得名。神秘果素最早由 Kurihara等［1］分离出来，1989 年 Theerasilp等［2］测定了其氨基酸
序列，1995 年 Masuda等［3］克隆了神秘果素基因。神秘果素本身没有甜味，但在酸性条件下具有强烈的
甜味诱发活性。据测定，0. 4 μmol·L －1神秘果素诱发 0. 02 mol·L －1醋酸溶液的甜度相当于 1 mol·L －1
蔗糖甜度的 40 万倍［4］，低浓度的神秘果素就能达到增甜的效果。因此，神秘果素成为一种新兴的低热
量甜味剂。
目前利用基因工程即生物反应器工业化生产神秘果素和用转基因作物新品种生产功能性食品成为研
究的主攻方向之一。神秘果素在大肠杆菌［5］、烟草和酵母［6］、莴苣［7］、米曲霉［8］、西红柿［9］、草莓［10］
等原核或真核生物上获得了表达，但表达产物活性各异。在上述生物中，Yano 等［11］认为西红柿是一种
可稳定表达神秘果素的植物。转基因西红柿表达的神秘果素与天然神秘果素活性相同［9］。这表明具有
功能活性的神秘果素的表达可能存在物种差异性，这种物种差异性是否与受体植物无法为神秘果素提供
保持活性的稳定环境有关还无从得知。
第 6 期 王新卫，等: 神秘果素基因合成及其液泡积累表达载体 DC-miraculin的构建
神秘果素在酸性条件下稳定并保持活性，酸性条件也是神秘果素发挥变味功能的环境［4，12］。植物细
胞器中液泡内的 pH最低，通常在 5. 5 ～ 6. 5 左右，可为外源表达神秘果素提供稳定的环境。本研究在
不依赖神秘果植物资源的条件下，根据 GenBank 的神秘果素基因序列，合成了编码神秘果素全基因。
同时依据神秘果素在酸性条件下稳定并能发挥变味功能的特性，在合成的神秘果素基因末端添加了菜豆
蛋白 C末端的液泡定位序列［13］，构建了期望在液泡中积累神秘果素的植物双元表达载体，既为生物反
应器生产神秘果素和培育转基因作物新品种提供了基因来源，又为神秘果素的外源稳定表达研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株及载体 大肠杆菌 ( Escherichia coli ) DH5α 和植物双元表达载体 YH4215 ( 登录号为
AY178048) 由笔者所在实验室保存; pMD19 Simple T 克隆载体购自 TaKaRa公司。
1. 1. 2 主要生化试剂 限制性内切酶 BamHⅠ和 SacⅠ及 Taq DNA聚合酶均购自 TaKaRa公司; T4 DNA
连接酶购自 Promega公司; DNA回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自 Axygen 公司; 高保真 Pfu DNA
聚合酶、dNTPs等购自北京天根生化技术有限公司; DNA 标准品购自北京全式金基因技术公司; 引物
由上海赛百盛基因技术有限公司合成。
1. 2 方法
1. 2. 1 引物设计 根据 Masuda 等［3］报道的基因序列 ( 登录号为 D38598 ) 用软件 GenSearch 和 Primer
Premier 5. 0 设计用于基因合成的寡核苷酸 ( 表 1) 。
表 1 用于神秘果素基因合成的寡核苷酸序列
Table 1 Oligo nucleotide sequence used for gene synthesis of miraculin
引物编号 Primer No． 序列 ( 5-3) Sequence ( 5-3) 长度 /bp Length
p1 ATGAAGGAATTAACAATGCTCTCTCTCTCGTTCTTCTTCG 40
p2 CTAAGCAGTGGGTTGGCCGCTGCTGCCAACAATGCAGAGACGAAGAAGAACG 52
p3 CAACCCACTGCTTAGTGCAGCGGATTCGGCACCCAATCCG 40
p4 AGTTTCTCTCCGTCTATGTCAAGAACCGGATTGGGTG 37
p5 AGACGGAGAGAAACTCCGGACGGGGACCAATTATTACATTGTGCC 45
p6 CCGCCATGGTCGCGGAGCACCGGCACAATGTAA 33
p7 CCGCGACCATGGCGGCGGCCTTACAGTATCCGCCACCACC 40
p8 GGTGGACAAACGAAGGTGCCGTTGGGGGTGGTGGCG 36
p9 CTTCGTTTGTCCACCCAGAGTTGTCCAAACACGAAAGGAGGTCGA 45
p10 TGGAAAGAAAGCGAGGGGGCGATCGTGGTCGACCTCCTT 39
p11 CTCGCTTTCTTTCCAGAGAACCCAAAGGAAGACGTTGTTCGAGTCT 46
p12 AAATTGATGTTGAGATCGGTGGAGACTCGAAC 32
p13 TCTCAACATCAATTTCTCGGCGTTCATGCCCTGTCGTTGG 40
p14 TGTCGAGCCGCCACACGGTGGAACTGGTCCAACGACAG 38
p15 GTGTGGCGGCTCGACAAATACGATGAATCCACGGGGCAGTACTTCGT 47
p16 TTTCCTTTGACACCGCCGATGGTCACGAAGTACTG 35
p17 CGGTGTCAAAGGAAACCCAGGTCCCGAAACCATTAGTAGCTGG 43
p18 AACCACTACCACAAAACTCCTCAATCTTAAACCAGCTACTAA 42
p19 TTTGTGGTAGTGGTTTTTACAAGCTTGTTTTCTGTCCCACCGTTTGTGGT 50
p20 TGCCCACATCTCCGCATTTTACTTTGCAGGAACCACAAACGG 42
p21 GCGGAGATGTGGGCATTTACATTGATCAGAAGGGAAGAAGGCGTTTGGCT 50
p22 TTAGAAGTATACGGTTTTGTTGAACTCGAATGCGAATGGTTTATCG 62
p23 TTTGGATCCATGAAGGAATTAACAATGCT 29
p24 GGAGCTCTTAGTAAACAAAGGCGAAGTATACGGTTTTGT 39
1. 2. 2 目的基因的合成及克隆 制备引物混合物: 配制各引物浓度为 10 pmol·μL －1，再分别制备引物
混合物Ⅰ ( 含引物 p1 ～ p12，其中 p1 和 p2 浓度为 1 pmol·μL －1，其余均为 0. 5 pmol·μL －1 ) 和引物混
合物Ⅱ ( 含引物 p11 ～ p22，其中 p11 和 p22 浓度为 1 pmol·μL －1，其余均为 0. 5 pmol·μL －1 ) 。
第 1 轮 PCR扩增: 根据 Pfu DNA聚合酶使用说明，按 50 μL反应体系配制反应混合物，以 2 μL混
合物Ⅰ为模版扩增神秘果素基因片段 F1，以 2 μL混合物Ⅱ为模版扩增片段 F2。反应参数为: 94 ℃预
变性 4 min; 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 个循环; 72 ℃延伸 5 min。琼脂糖凝胶电泳检测并回
收目标片段。
第 2 轮 PCR扩增: 取浓度较高的回收片段 F1 和 F2 各 2 μL混合为模版，以 p23 和 p24 为引物，按
照 Pfu DNA 聚合酶使用说明配制 50 μL PCR 反应体系进行扩增。反应参数为: 94 ℃预变性 4 min;
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94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30 个循环; 72 ℃延伸 5 min。
基因克隆与序列测定: 取回收的目标片段 15 μL，配制 20 μL的 Taq酶 PCR反应体系，进行目标片
段加“A”反应。反应程序为: 72 ℃ 10 min，4 ℃ 5 min。取加“A”的反应产物适量与 pMD19 Simple
T载体用 T4 DNA连接酶连接，进行 T/A克隆。DNA 测序由北京华大基因技术有限公司完成。
1. 2. 3 合成基因的序列分析 将测序序列与参考序列进行 Blast 比对分析。测序正确的克隆命名为
pMD19 st-miraculin-C。
1. 2. 4 植物双元表达载体的构建 对质粒 pMD19 st-miraculin-C 和植物双元表达载体 YH4215 分别进行
BamHⅠ /SacⅠ双酶切，酶切产物 72 ℃加热10 min，各取适量进行连接。连接产物进行转化、菌体筛
选、质粒提取和酶切鉴定。
1. 2. 5 其他操作 DNA连接、转化、质粒提取、酶切鉴定、感受态制备等参照试剂盒操作说明或标准
的分子克隆步骤完成［14］。
2 结果与分析
2. 1 基因合成策略
利用软件 GenSearch将全长 663 个碱基 ( 含终止密码子) 的神秘果素基因拆分为 22 条序列较短的
寡核苷酸，通过高保真 Pfu DNA聚合酶介导的重叠延伸 PCR 反应，先合成基因的 2 个片段，再通过 2
个片段的重叠延伸合成全基因 ( 图 1) 。后续的研究结果表明，这种策略是可行和正确的。
图 1 含 3末端修饰序列的神秘果素基因合成策略及技术路线
Fig. 1 Synthesis strategy and technique path for miraculin
gene with 3 terminal sequence modified
p1 ～ p24 同表 1; F1 和 F2 为神秘果素基因片段 1 和 2; F1 － f 和
F2 － r分别为 F1的正链和 F2的负链; 实线和虚线分别表示片段的正链和
负链。p1 － p24 are the same as Table 1; F1 and F2 stand for fragment 1 and 2
of miraculin gene; F1-f and F2-r stand for plus strand of F1 and minus strand
of F2，respectively; real line and broken line stands for plus strand and minus
strand，respectively．
图 2 PCR扩增结果及克隆鉴定
Fig. 2 PCR amplificaton and clone identification
F1、F2. 基因片段; F. 3端带有修饰序列的神秘果素基
因; 1、2. 以不同克隆菌液为模版的 PCR 产物; M. DNA 标
准品
F1，F2. Gene fragment; F. Miraculin gene with 3 terminal
modified; 1，2. PCR products based on different bacterial clones;
M. DNA marker
2. 2 PCR扩增结果及克隆鉴定
第 1 轮 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，以混合物Ⅰ和混合物Ⅱ为模版的 PCR得到明亮条带
且大小与期望值相符的 F1 片段和 F2 片段 ( 图 2 － a) 。回收 F1 和 F2 后混合作为第 2 轮 PCR 反应的模
版，经引物 p23 和 p24 扩增，得到了期望大小的 F片段 ( 图 2 － b) 。引物 p23 和 p24 除含有构建植物双
元表达载体酶切位点外，p24 还含有编码 AFVY 4 个氨基酸的核苷酸序列。AFVY 4 个氨基酸残基序列作
为菜豆蛋白的 C末端定位信号，可以将分泌表达的蛋白导向液泡积累。为了鉴定带有液泡定位信号的
神秘果素基因是否合成成功，F片段进一步被克隆到 pMD19 Simple T 载体，菌液 PCR 确定阳性重组子
( 图 2 － c) ，提取重组质粒进行序列测定。
2. 3 合成的修饰基因序列分析
测序结果表明，载体中的插入序列除了具有正确的 3端的修饰序列外，其余序列和作为设计模版
的神秘果素基因序列完全相同 ( 图 3) 。这表明神秘果素基因被成功合成，含有正确插入序列的质粒被
命名为 pMD19 st-miraculin-C。该序列的 5端和 3端引入了 BamHⅠ和 SacⅠ酶切位点以便于表达载体的
构建。氨基酸序列 N端 29 个氨基酸残基为前体神秘果素的信号肽序列，C 端引入了液泡定位的 4 个氨
基酸残基 AFVY。
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第 6 期 王新卫，等: 神秘果素基因合成及其液泡积累表达载体 DC-miraculin的构建
图 3 修饰神秘果素基因的序列及其两端的限制性位点
Fig. 3 Sequence of modified miraculin gene and restrictive sites in its two terminals
斜体并带下划线的碱基序列为引入的 BamHⅠ和 SacⅠ酶切位点。灰色部分的氨基酸残基为前体神秘果素的
信号肽序列，带双下划线的氨基酸残基为引入的 C末端信号序列，带框的核苷酸序列为其对应的密码子。
Italic and underlined sequences denote the BamHⅠ and SacⅠsites，respectively; amino acid sequence with gray de-
notes signal peptide of mirculin precursor; amino acid residues with double underlined and nucleotide sequence in frame
denotes C-terminal signal peptide and their corresponding codons，respectively．
图 4 DC-miraculin 的酶切鉴定
Fig. 4 Identification of DC-miraculin by restrictive digestion
1. DC-miraculin 酶 切 产 物 Digestion product of DC-miraculin;
M. DNA标准品 DNA marker
2. 4 载体的构建及鉴定
BamHⅠ和 SacⅠ限制性内切酶分别双酶切
质粒 pMD19 st-miraculin-C 和植物双元表达载体
YH4215。将 pMD19 st-miraculin-C酶切产物琼脂
糖凝胶电泳后回收680 bp基因片段，回收片段
与酶切的 YH4215 连接，连接产物转化大肠杆
菌 DH 5α，菌液 PCR 检测阳性克隆。阳性克隆
菌液提取质粒，质粒用 BamHⅠ和 SacⅠ双酶切
进行鉴定。结果表明 ( 图 4) ，基因片段 miracu-
lin-C成功插入到植物双元表达载体 YH4215，
含有插入片段的质粒被命名为 DC-miraculin
( 图 5 ) 。该表达载体的神秘果素基因由双
CaMV35S启动子控制，转基因植物的报告基因
为 gusA，抗性筛选标记为潮霉素抗性基因 hpt。
图 5 DC-miraculin表达载体 T-DNA区示意图
Fig. 5 The diagram of T-DNA regions of expression vector of DC-miraculin
3 讨论
3. 1 神秘果素基因人工合成
多数具甜味功能的植物资源来自于国外，我国在对这些植物的特异基因进行研究时往往受植物资源
的限制而多采用全基因人工合成的方法，如甜味蛋白 Brazzein［15 － 17］、Thaumatin［18］和 Monellin［19］。采用
基因人工合成获得目标基因，一是不受基因资源限制，二是可获得与报道基因一致的序列，便于研究结
果间的比较，还可以对基因进行修饰。国外进行转基因研究的神秘果素基因，其基因来源多参考 Masu-
da等［3］的序列，这是因为该基因的表达产物功能较为清楚。基于此，本研究在不依赖天然神秘果植物
资源的条件下，利用高保真 DNA聚合酶介导的 PCR扩增合成了神秘果素全基因，为进一步通过生物反
应器生产神秘果素和培育转基因作物新品种奠定了基础。
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3. 2 神秘果素在液泡中的积累
神秘果素在酸性条件下稳定并能发挥功能活性。目前报道的神秘果素转基因研究均未对神秘果素基
因进行修饰，转基因植物表达的神秘果素一般按其自身的信号肽定位在细胞间质中积累［20］。不同受体
植物所表达神秘果素功能活性各异，这是否与受体植物细胞间隙的 pH值有关，还有待研究。液泡作为
细胞中内环境 pH值最低的细胞器，其 pH值一般在 6. 5 以下，可为外源表达的神秘果素提供相对稳定
和发挥功能活性的环境。液泡分选信号融合到报告蛋白上，报告蛋白能够靶向液泡积累［21］。本试验在
合成神秘果素基因时，在基因的 3端引入了编码菜豆蛋白 C 末端信号序列即编码 AFVY 氨基酸序列的
核苷酸，可使该基因在细胞中表达的神秘果素导向液泡积累。菜豆蛋白 C 末端四肽 AFVY 作为 C 末端
液泡分选信号可将带有分泌型信号肽的蛋白分选入液泡中［13］，进入液泡后 C 末端四肽将会在蛋白酶作
用下被水解掉［22 － 23］。因此，理论上基因的修饰并不会影响表达的神秘果素基因产物的功能。
神秘果素全基因合成和其液泡积累表达载体 DC-miraculin的构建，为生物反应器生产神秘果素和培
育转基因作物新品种提供了新的基因来源。目前，该基因表达载体以果树为受体的遗传转化正在进行中。
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责任编辑: 范雪梅
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