全 文 ：第 8卷　第 2期　　　　　　　　　　　　草地学报　　　　　　　　　　2000年　6月
Vo l. 8　No. 2　　　　　　　　　　ACT A AGREST IA SINICA　　　　　　June　2000
几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达及其酶对
柱花草胶孢炭疽病原菌的抑菌效果*
蒋昌顺　邹冬梅
(中国热带农业科学院农牧研究所,海南省, 儋州市 571737)
Segenet Kelemu
( T opical Fo rages Patho lo gy Labo r ator y , Internat ional Cent er fo r T ropica l Agr iculture,
A . A . 6713, Cali, Co lombia)
摘要: 构建了几丁质酶基因植物表达载体, 该基因在大肠杆菌中能表达 35kD的蛋白质。几
丁质酶粗提物在体外对柱花草胶孢炭疽病原菌有极显著的抑菌效果。
关键词: 几丁质酶; 基因表达; 炭疽病原菌; 抑菌作用
中图分类号: S 435. 4; S543. 9 　文献标识码: A 　文章编号: 1007-0435( 2000) 02-0107-08
柱花草属( Sty losanthes spp. )包括 44个种和亚种, 天然分布在中南美洲、热带北美洲、
非洲、东南亚和印度等地。这些种适于北纬 30°到南纬 30°的干旱和低肥力区域( Edye 等,
1984)。柱花草具有多种用途:养牛青饲料、制作干草粉、果园间作、土壤固氮、恢复丢荒地及
水土保持等, 并已在澳大利亚、印度尼西亚、马来西亚、菲律宾、印度及非洲、中南美洲等国家
和地区种植利用( Cameron等, 1996)。在我国华南热带地区利用柱花草制作家畜所需干草
粉,在果园推广种植柱花草, 累计达 10万 hm 2, 种植区域包括广东、广西、云南、贵州及福建
等省区( Jiang , 1995)。
由胶孢炭疽病原菌( Colletotrichum gloeosp or ioid es)引起的炭疽病是柱花草推广利用的
主要限制性因素( lenne 等, 1982)。柱花草炭疽病自 1937年首次在巴西报道以来( MAG,
1937) , 该病已传布至所有种植区,并在美国佛罗里州南部、哥伦比亚、澳大利亚及我国华南
热带地区造成了严重危害, 导致种子及干物质减产、营养成份下降( Chakraborty 等, 1997;
Jiang, 1995)。该病原菌具有高度遗传和致病多样性, 且新的生理小种已能危害原来比较抗
病的栽培种如:格拉姆柱花草( S. guianensis cv. Graham )、库克柱花草( S. guianensis cv .
Cook) ( Chakr aorty 等, 1996)。因胶孢炭疽病原菌生理小种高度的遗传和致病多样性, 而难
以获得长期的柱花草抗病性( Kelemu等, 1996) ,目前生产上仍采用多菌灵、苯莱特等化学方
法防治柱花草炭疽病( Jiang , 1995)。因此,有必要在该寄主与病原菌系统中,进一步探索高
效、低成本的柱花草炭疽病防治方法。
几丁质酶具有水解
- 1, 4- 几丁质的作用, 而几丁质则是真菌、昆虫等多种有机体的
收稿日期: 1999-12-09;修回日期: 2000-04-06
* 本项目得到国家外国专家局和国际热带农业中心资助,已于 1998 年 1月至 1999年 5月在国际热带农业中心完
成。
结构成份,因此,几丁质酶在抵抗植物真菌病害中起到重要作用( Collinge 等, 1993)。利用几
丁质酶基因防治一些重要作物的真菌病害已有报道( Lin 等, 1995)。本研究探索利用水稻几
丁质酶基因( Huang 等, 1991)防治柱花草炭疽病。
1　材料和方法
1. 1　研究材料
1. 1. 1　水稻几丁质酶基因( Huang 等, 1991)由美国堪萨斯州立大学 S. Muthukrishnan博
士提供,该基因编码 35kD的几丁质酶, 被克隆在质粒 pBSKS-Gll ( R)上。
1. 1. 2　双元载体 pCAMBIA2301( Rober ts 等, 1997)由澳大利亚国际农业分子生物学应用
中心 R. Jef ferson 博士提供。该双元载体既可在大肠杆菌中表达, 又可在植物细胞中表
达。　　　　
1. 1. 3　大肠杆菌 DH5
、胶孢炭疽病原菌分离物 ( Colletot richum gloeosp orioides
CIA T16000)取自国际热带农业中心热带牧草项目饲料病理实验室收集保存的菌种。
1. 1. 4　实验所用的酶: H indⅢ、BamHI、去磷酸化酶( CIP )、T 4DNA 连接酶购自美国生命
技术公司。
1. 1. 5　DNA 回收试剂盒及蛋白质电泳所需试剂为美国加州 BIO-RAD 实验室的产品。
1. 1. 6　质粒提取所需的试剂盒购自德国 QIAGEN 公司。
1. 1. 7　其它化学药品均为 SIGMA 公司产品。
1. 2　大肠杆菌转化
大肠杆菌 DH5
的感受态细胞制备及其质粒转化按照 Inoue( 1990)的方法进行。转化
后的细胞被涂在含有相应抗生素的 LB固体培养基上。
1. 2. 1　质粒 pBSKS-Gll( R) ,使用 100
g/ mL 的氨苄青霉素筛选。
1. 2. 2　质粒 pCAMBIA2301及其重组质粒使用 50
g/ mL 卡拉霉素筛选。
1. 2. 3　使用 X-gal和 ITPG 进行
互补筛选。
1. 2. 4　所有转化后的 DH5
细胞在 37℃条件下过夜培养。
1. 3　几丁质酶基因植物表达载体的构建
1. 3. 1　少量质粒的制备则采用碱裂解法( Sambrook等, 1989)。
中量质粒 DNA 抽提按照 Marko 等( 1982)的方法进行。用 H ind Ⅲ分别消化 30
g 的质
粒 pBSKS-Gll ( R)和 pCAMBIA2301,直至完全酶切。取 1
g 的酶切样品进行 0. 8%的琼脂
糖胶电泳, 以验证质粒酶切完全。酶切完全之后, 质粒 pCAMBIA2301分别用酚/酚:氯仿:
异戊醇( 25∶24∶1)抽提,并用异丙醇沉淀, 70%酒精洗盐, 再溶解在 1×T E 中。对质粒
pCAMBIA 2301进行去磷酸化。使用 DNA 回收试剂盒,从酶切后的质粒 pBSKS-Gll( R)上
回收一个 1. 5Kb 的 DNA 片段, 该片段包含一个 1. 1Kb 的水稻几丁质酶基因和一个
CaMV 35S的启动子。
1. 3. 2　连接反应按照以下方法进行: 1
g 的 DNA 回收片段, 0. 25
g 的去磷酸化质粒
pCAMBIA 2301, 1
L 的 T 4DNA 连接酶, 10倍的连接缓冲液 1
L 及无菌双蒸水充分混匀至
总体积 10
L,反应于 15℃进行 16h,之后, 取少量连接样品电泳以检测连接效率。用连接产
物转化大肠杆菌 DH5
。然后从转化子中提取重组 DNA, 并分别用限制性内切酶 H indⅢ、
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BamHI酶切鉴定。
1. 3. 3　所有 DNA重组技术均按标准规程操作
1. 4　几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达及含几丁质酶的粗提物制备
按照文献 ( Sambrook等, 1989; Shapira 等, 1989) 并略加修改, 从重组质粒转化后
的大肠杆菌 DH5
中制备蛋白质、几丁质酶粗提物及含几丁质酶的无菌滤液。培养后的大
肠杆菌用裂解酶处理, 以 5000转/分离心 30m in, 上清液通过 0. 22
m 的滤膜, 最后用浓
缩管Centricon-10分离出几丁质酶的无菌滤液。对制备的蛋白质进行 10%SOS-聚丙烯凝胶
电泳。　　　
1. 5　几丁质酶粗提物体外对胶孢炭疽病原菌抑菌活性鉴定
1. 5. 1　几丁质酶粗提物的抑制胶孢炭疽病原菌活性的试验按照 Kelemu 等( 1995)和
Mauch等( 1988)的方法进行。从培养后 7d的菌种盘上收集该菌孢子,并悬浮在无菌的双蒸
水中,调整孢子悬浮液的光密度 OD 600= 0. 02。取 50
L 孢子悬浮滤涂在含有 Nutrient Agar
培养基的盘上, 然后用无菌滤纸盘(直径为 0. 6cm )吸附经浓缩的几丁质酶粗提物(含 0.
24
g 几丁质酶)并放在含有胶孢炭疽病原菌孢子的盘里,在 28℃培养 48～72h,观察几丁质
酶粗提物抑真菌活性。
1. 5. 2　含有几丁质酶的无菌滤液( 0. 1单位/ mL 的几丁质酶)检测胶孢炭疽病菌的抑菌效
果,取 100mL 无菌滤液放入体积为 250mL 的带臂的三角瓶中,并加 1mL 胶孢炭疽病原菌
孢子悬浮液( OD600= 0. 05) ,在 28℃条件下,以每分 200转摇活培养。从试验开始至第8d,每
天测定 OD600值,以评价无菌滤液的抑真菌活性。试验设立不含几丁质酶粗提物的处理为对
照。
2　结果与分析
2. 1　几丁质酶基因植物表达载体
连接产物转化大肠杆菌 DH5
并从中提取重组 DNA, 并分别用限制性内切酶 H ind
Ⅲ、BamHI 酶切鉴定, 最后获得两个几丁质酶基因表达载体, 命名为 pCAMBIACH1和
pCAMBIACH2,它们均带有几丁质酶基因,但克隆的方向相反(图 1)。
2. 2　几丁质酶基因在构建的植物表达载体上表达
通过 10%SDS聚丙烯凝胶电泳结果表明,几丁质酶基因在所构建的两个植物表达载体
pCAMBIACH1和 pCAMBIACH2上均能表达出 35kD的几丁质酶, 表达水平达 0. 1单位/
mL。但在 pCAMBIACH1上表达较弱(图 2) ,说明基因克隆的方向不同,其表达程度存在差
异。
2. 3　浓缩的几丁质酶粗提物对胶孢炭疽病原菌的抑菌活性
从含 pCAMBIACH1和 pCAMBIACH2的大肠杆菌中分别制备浓缩的几丁质酶粗提
物,在含柱花草胶孢炭疽病原菌的培养基上,均表现出抑菌活性, 但后者的抑菌活性高于前
者(图 3) , 进一步的研究表明,后者的抑菌活性是前者的 2. 2倍(图略)。说明几丁质酶粗提
物抑菌活性的大小与几丁质酶基因克隆的方向有关。
109第 2期 蒋昌顺等:几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达及其酶对柱花草胶孢炭疽病原菌的抑菌效果
图 1　几丁质酶基因植物表达载体 pCAMBIACH1 和 pCAMBIACH2的构建
F ig . 1　Const ruction o f the chitinase-gene-expressing vector s pCAMBIACH1 and pCAM BIACH2
2. 4　含有几丁质酶的无菌滤液对胶孢炭疽病原菌的抑菌活性
含有几丁质酶的无菌滤液对胶孢炭疽病原菌的抑菌效果试验结果表明,含有几丁质酶
的无菌滤液对胶孢炭疽病原菌有极显著的抑菌活性(图 4) ,其中, 来自 pCAMBIACH2的含
几丁质酶无菌滤液对胶孢炭疽病原菌的抑菌活性最大(图 5)。
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图 2　几丁质酶基因在大肠杆菌中表达产物的 10% SDS-聚丙烯凝胶电泳
Fig. 2　P ro tein ex tracts fr om E scherichia coli DH5
tr ansformants separ ated on 10% SDS
po ly acry lam ide gel by electr ophor esis
　　泳道 1、2、3的蛋白质提取物分别来自含有质粒 pCAMBIA2301、pCAMBIACH1和 pCAMBIACH2的大肠杆菌;泳道
4、5、6的蛋白质提取物分别来自含有质粒 pCAMBIA2301、pCAMBIACH1、和 pCAM BIACH2的大肠杆菌培养液。MW
为蛋白质的分子量。黑色箭头所示为几丁质酶基因表达产物
Lanes 1, 2, and 3= protein ext ract s f rom cel ls of E . col i DH5
with p lasmids pCAMBIA2301, pCAM BIACH 1, an d
pCAMBIACH2, respect ively. Lan es 4, 5, and 6= pr otein ext ract s f rom th e cul tu re supernatant of E . col i DH5
w ith plas
mids pCAM BIA 2301, pCAMBIACH1 and pCAMBIACH2, respect ively. Protein m olecular weight ( MW) siz es are sh ow n
图 3　几丁质酶提取物对柱花草胶孢炭疽原菌的抑菌效果
F ig . 3　Inhibition of Colletotrichum gloeosp or ioides g rowt h by crude prepar ations o f chitinase
　　B、C盘的几丁质酶提取物分别来自含有质粒 pCAMBIACH2和 pCAM BIACH 1的大肠杆菌细胞, A 盘为对照
( A ) Crude preparat ions w ithout chit inas e f rom E scheric hia col i DH5
, containin g only the vector pCAMBIA2301;
( B) Cru de preparat ions of chit inase f rom E. c oli DH5
, containing th e plasm id pCAMBIACH2; ( C) cr ude preparat ions of
ch itin as e fr om E . col iDH5
, containing the plasmid pCAMBIACH1
111第 2期 蒋昌顺等:几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达及其酶对柱花草胶孢炭疽病原菌的抑菌效果
图 4　柱花草胶孢炭疽病原菌在含几丁质酶无菌滤液中的生长曲线
F ig . 4　Optical densit y( OD600) of Colletotrichum gloeosp or ioides cult ur es in the pr esence o f cell-
free cult ur e filtr ates of chitina se and no-chitinase clones
图 5　含几丁质酶的无菌滤液对胶孢炭疽病原菌的抑菌效果
F ig . 5　Inhibition of Colletotr ichum g loeosp orioides gr ow th by cell-free cult ur e filtr ates of chitinase
　　C和 D的几丁质酶无菌滤液分别含有 pCAMBIACH1、pCAM BIACH2的表达产物; A 和 B为对照
　　T ub C and D contain products of pCAMBIACH1、pCAMBIACH2; tube A and B are cont rols
3　结论与讨论
3. 1　室内抑菌试验结果表明,含几丁质酶的粗提物( 0. 1单位/ mL 的几丁质酶)对柱花草胶
孢炭疽病原菌有显著的抑菌活性,但核糖体失活蛋白酶基因所表达的产物尚无此功能(本研
究尚未发表的资料)。
3. 2　笔者将探索利用含几丁质酶的粗提物在柱花草生产田对胶孢炭疽病原菌的抑菌效果,
如果同样具有显著的效果, 则含有几丁质酶的粗提物将有望代替目前柱花草生产上主要使
用的多菌灵、苯莱特等农药,同时为含几丁质酶的粗提物工厂化生产创造条件。
3. 3　准备将水稻几丁质酶基因导入柱花草植株中, 最终获得转几丁质酶基因的抗炭疽病柱
花草植株。目前,已完成柱花草的组织培养研究(蒋昌顺等, 1998)。上述工作,将为热带牧草
柱花草的育种和利用带来光明前景。
112 草　地　学　报 2000年
参 考 文 献
1　蒋昌顺,黄惠德, 邹冬梅.等, 1998.热研二号柱花草组织培养研究[ J] .草地学报, 6( 1) : 33～37
2 　Cameron D F , Chakrabo rt y S, Manner s J M , Edye L . 1996. P ro tecting stylo fr om anthr acno se [ J] .
T ropical G rassland, 1: 130～131
3　Chakrabor ty s S, Cameron D F , Boland R, Kelemu S, Fernandes C D , Charchar M J D A . 1996. R isk o f
ser ious anthr acno se damage to sty lo cultivar s[ J] . T r op Grassl, 30( 1) : 129～130
4　Chakrabo rt y S, Per ro tt R , Cha rchar M J D A , Fernandes C D, Kelemu S . 1997. Biodiv ersity, epidemioloy
and virulence o f C . gloeosp or ioides, Ⅱ: G enet ic and pathogenic diver sity in iso lat es o f C . g loeosp orioides
fr om eight species of S ty losanthes[ J] . T r op G rassl, 31: 393～401
5　Co lling e D B, Kragh K M , M ikekesen J D, N iesen K K , Rasmussen U , Vad K . 1993. Plant chitinases
[ J] . P lant J, 1: 31～40
6　Edye L A , Cameron D F . 1984. Pr ospects for S ty losanthes improvement and utilizat ion. In: Stace HM ,
Edye LA , eds. The bio lo g y and agr onom y o f Stylosanthes [ C] . A cademic Press, Nor th Ryde, NSW,
Austr alia, 571～587
7　Huang J K , Wen L , Sw egle M , T ran H C, T in T H, Naylor H M , M ut hukr ishnan S, Reeck G R . 1991.
Nucleo tide sequence of a r ice genomic clone that encodes a class I endochitinase[ J] . Plant Mol Biol, 16:
479～480
8　I noue W. 1990. High efficiency tr ansfo rmat ion pro cedure for E . coli. [ J] . Gene ( Amst ) , 96: 23～28
9　 Jiang G . 1995. U tilization and st udies o f Sty losanthes in China [ J] . T rop Crops Res, 3: 64～ 70 ( In
Chinese. )
10 Kelemu S, Thomas R J, Mo reno C X, Ocampo G I. 1995. Stra ins o f Bradyrhizobium from tropical for ag e
legumes inhibit Rhizoctonia solani AG-1 in v itr o [ J] . Austr alas P lant Pathol, 24: 168～172
11 Kelemu S, Badel J L , Mo reno C X, M iles J W . 1996. V irulence spectrum o f South Amer ican isolates o f
Collectortr ichum gloeosp or ioid es on selected S. g uianensis geno type[ J] . P lant Dis, 80( 12) : 1355～1358
12 Lenne J M , Sonoda R M . 1982. Effect of anthracnose on yied of the tr opical for age legume St ylosanthes
hamat a[ J] . Phy topatho lo gy , 72: 207～209
13 Lin W, Anuratha C S, Datt a K , Pot rykus I , M uthukr ishnan S , Dat ta S K . 1995. Genetic eng ineering o f
r ice fo r r esistance t o sheath blight[ J] . Bio techno lo gy , 13: 686～691
14 MAG ( M inist
r io da Agr icultur a) . 1937. Info rm acao s sobro algumas plantas for r ageir as. R iode Janeiro
15 Marko H. 1982. Medium scale alka line plasmid prepar ation pro cedure [ J ] . Annu Biochem , 121: 382～
383
16 Rober ts C. 1997. Acomprehensive set o f m odular v ect or s for advanced manipulations and efficient
t ransformation of plants by both A grobacter ium and dir ect DNA uptake methods pCAMBIA vect or
r elease manual, v ersion 3. 05[ M ] . CAMBIA . Canber r a. Aust ralia, 1～6
17 Sambrook J, F ritsch E F , M aniatis T . 1989. Molecular cloning : a labo rat or y m anual[ M ] . 2nd ed. Cold
Spr ings Harbo r Labor ato ry Press, New York
18 Shapir a R , O rdentlich A , Chet I, Oppenheim A B. 1989. Contro l o f plant diseases by chitinase expr essed
fr om cloned DNA in Escher ichia coli[ J] . Phy topat ho lo gy , 11: 1246～1249
113第 2期 蒋昌顺等:几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达及其酶对柱花草胶孢炭疽病原菌的抑菌效果
Chitinase Gene Expressing in Escherichia coli DH5

and Its Products Inhibiting on the Growth of
Colletotrichum gloeosporioides in Vitro
Jiang Chang shun　Zou Dongmei
( T r opical Field Crops and Animal Husbandry Research Institute, Chinese Academy of
T r opical Ag ricultura l Sciences, Danzhou City , Hainan Prov ince 571737)
Segenet Kelemu
( T opical Fo rages Patho lo gy Labo r ator y , Internat ional Cent er fo r T ropica l Agr iculture,
A . A . 6713, Cali, Co lombia)
　　Abstract : Chinase gene expressing vecto rs for plant tr ansformation w ere constr ucted, 35kD prot ein
w as expr essed by chitinase gene in Escherichiacoli DH5
. I n vitr o crude preparat ion o f chinase has efficient
inhibition on the g row th of Colletotr ichum gloeosp or ioides, w hich caused Sty losnathes ant hr acnose disea se .
　　Key words: Chinase gene ; Expressing in Escher ichia coli; Inhibition on Colletotrichum g loeosp orioides
gr owth
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