全 文 ：武汉植物 学研究 2007，25(2)：143—148
,／ourna／of Wuhan Botanical Research
基于 ITS序列探讨法落海的系统分类学地位
薛华杰 ，王年鹤2，陆长梅 ，孙明义2，谷口雅彦 ，马场 江
(1．南京师范大学生命科学学院，南京 210097；2．江苏省中国科学院植物研究所。南京 210097；
3．大阪药科大学。日本大阪 569—1094)
摘 要：为研究法落海的系统分类地位 ，检测了法落海以及当归属和独活属共 l2种代表植物的核糖体 DNA ITS序
列，并结合 GenBank中独活属 4种代表植物的 ITS序列 ，以羌活属的羌活(Notopterygium incisu,n)作为外类群，应用
序列特征、遗传距离与系统树分析等方法对法落海的系统分类地位进行 了分析。结果表明，依据不同的 ITS区序
列会得出不同甚至截然相反的结论 ：若依据 ITS1序列，法落海应该归属到当归属；若依据 ITS2序列，法落海应该归
属到独活属。进一步分析法落海与当归属、独活属植物ITS区序列的碱基组成时发现，法落海在 ITS1区拥有当归
属植物的序列特征，而其ITS2区拥有独活属植物的序列特征。综上分析，支持法落海是介于当归属与独活属之间
的一个分类群的系统分类观点。
关键词：法落海；ITS序列；碱基比较 ；系统分类地位
中图分类号：Q949．763．3 文献标识码 ：A 文章编号：1000-470X(2007)02-0143-06
Phylogenetic Position of Anegelica apaensis／Heracleum apaense Based on
Evidence from ITS Sequences of Nuclear Ribosomal DNA
XUE Hua-Jie ，WANG Nian—He ，LU Chang—Mei ，SUN Ming—Yi ，MASAHIKO Taniguch ，KIMIE Baba
(1．School oftore sc妇 。NanfingNormal ，Nanjing 210097。China；2．Institute Botany。Jiangsu and The Chinese
Academy Sc／ences，Nanjing 210014，China；3．Osaka Universio"ofPharmaceut／ca／Sc／ences。Osaka 569—1094。Japan)
Abstract： e phylogenetic positon of Angelica apaensis／Heradeum apaense(A apaens／s was used in the
~Howing)，which belongs to Angelicinae in Umberliferae，is controvemiM．To clear its phylogenetic posi—
tion，I (intemal transcribed spacer)sequences from A．apaens／s and 16 other species in these two gene—
ra(4 of them were from GenBank)were used to compute their genetic distances and to construct phyloge．
nefic trees，Notopterygium incisum was used aS the outgroup．Analysis on different ITS regions resulted in
contradictory conclusions：analysis on Ⅱ l sequences indicated that A．apaens／s should belong to Ange—
lica．while an alysis on ITS2 sequence suggested that it belongs to Heracleum．Further studies demonstrated
that A．apaens／s possessed base sequ ence characters similar to plan ts in Angelica in n1sl region．but had
base sequ ence characters similar to plan ts in Heracleum in I1 region．Therefore．results of this study
support the view that A．apaens／s is a transitional taxon betw een Angelica and Heracleum．
Key words：Anegelica apaensis／Heracleum apaense；I ；Base comparison；Phylogenetic po sition
当归属(Angelica)是伞形科(Umberliferae)芹亚
科(Apioideae)前胡族(Pedcedaneae)当归亚族(An—
gelicinae)中最大的一个分类群，而独活属(Herac／e—
am)是前胡族 (Pedcedaneae)环翅芹亚族 (Tordyli．
nae)中最大的一个分类群。中国的横断山脉和四川
省是这两属共同的分布中心L1】。分析经典的分类
指标发现这两属关系比较密切，而在这两属问的分
类上最具争议的物种当为法落海(又名阿坝当归)。
法落海是我国特有种，在《中国高等植物图鉴》中法
落海被归属到当归属，并定名为 Angelica apaensis
Shan& Yuan J
，在《中国植物志》上法落海则被归
属到独活属，并改名为 Heracleum apaense(Shan&
Yuan)Shan&T．S．Wang ，而在最新出版的《Flora
of China)中法落海重又被划分到当归属，并被更名
为Angelica apaensis R．H．Shan&C．Q．Yuan，但同时
又特别指出“进一步的研究有可能会将之归属到新
的属 。之所以法落海的分类地位一直不能确定，
主要是因为法落海的形态与化学特征有些与当归属
收稿日期：2O06—10—16，修回日期：2006—12-05。
基金项目：国家自然科学基金资助项 目(30270097)。
作者简介：薛华杰(1982一)，男，硕士研究生，从事植物学研究。
· 通讯作者(Author for correspondence．E-mail：luchangmei@njnu．~du．cr1)。
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的相似，有些与独活属的相似，有些特征又介于当归
属与独活属之间 引。
近些年来，分子分类与系统学技术被广泛应用
于用经典的分类系统学难以确定的问题 ¨n J。而
其中的核基因组的ITS区(包括 ITS1和 ITS2)具有
长度保守性和核苷酸序列的高度变异性，使得这些
区的DNA序列较为容易排序，而相对其它常用的片
段(如matK、rbcL等)，它的高度变异性又使得该序
列比较适合于属间或种间的分类研究 引¨。而且迄
今为止尚未见到应用 DNA序列对法落海的系统分
类地位进行研究的报道。
我们选取法落海、当归属的 11种代表植物以
及独活属的5种代表植物为研究对象，以羌活属
的代 表植物羌 活 (Notopterygium inc~um Ting eX
H．T．Chang)作为外类群，根据各植物的 ITS
序列，并结合前人研究成果探讨法落海的系统分
类地位。
1 材料与方法
1．1 材料
实验所用材料(包括 3属 14种代表植物)(见
表 1)均由江苏省中国科学院植物研究所的王年鹤
研究员采集并鉴定，另有 4个独活属植物的ITS序
列来自GenBank。凭证标本保存在江苏省中国科学
院植物研究所标本馆(NAS)，以备查验。材料采集
地等信息详见表 1。
1．2 实验方法
1．2．1 植物总 DNA的提取 植物总 DNA采用了
DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen，Valencia，CA)试剂盒
提取。DNA浓度和质量采用分光光度法和电泳检
测。提取的高质量基因组DNA直接用于PCR扩增。
1．2．2 ITS区片段扩增与纯化 采用 ITS 通用引
物进行 PCR扩增。具体序列为 ITS4：5’．GGAAG．
TAAAAGTCGTAACAAGG．3’和 ITS5：5’．TCCTCCG．
表 1 用于rrs序列分析的植物材料来源、凭证标本与 GenBank登录号
Table 1 Taxon and voucher numbers used for this study and their GenBank accession numbe rs
·法落海以下拉丁文均采用A．apaens／s；··表示外类群．，
·A·apa~ ／s represents Angelif~a apaensls R．H·Shah＆C．Q．Yuan／Herac／eum apaense(Shah＆Yuan)Shah＆T．S．Wang in the folowing；
·· Representsthe outgmup．
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第2期 薛华杰等：基于ITS序列探讨法落海的系统分类学地位 145
C I’rA I’ TATGC-3’【H J。按 反 应 程 序 (预 变性
95℃ 5 min，变性 94℃ 1 min，复性54℃ 1 min，延伸
72℃ 1 min，30个循环后延伸 72℃ 10 min)进行
PCR扩增，得到核糖体 DNA的ITS片段(包括ITS1、
5．8 S和rrs2)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，
所需要的条带用 QIAquick Gel Extraction Kit(Qia—
gen，Valencia，CA)对 PCR产物直接纯化。
1．2．3 DNA测序与 rrs序列确定 纯化后的PCR
产物经 ABI 377 DNA自动测序仪(PE AppHed Bio—
system，USA)检测。所测各属各分类群的 ITS序列
始末端的决定，均参考了 GenBank中各相关属植物
的ITS序列。它们各自的ITS序列已被 GenBank收
录，具体登录号见表 1。其中属于 18S与 26S的部
分片段已被删除。
1．2．4 数据分析 所得序列用 Chstal X程序进行
同源性排列，并经手工校正。利用 Mega 3．1软件对
序列进行分析，计算出长度、GC含量和遗传距离，最
后用 PAUP4．0 beta 10 win软件对序列进行统计和
分支分析，碱基处理作 Fitch性状(无序)，缺隙作缺
失(missing)状态分析。分别应用邻接法、最大简约
法与最大似然法构建ITS基因树。邻接树的构建使
用 Kimura距离 ；最大简约树的构建使用启发式搜
索，树二等分再连接分支交换(TBR)，各种核苷酸替
代同等加权；最大似然树的构建使用 HKY模式。所
有自展分析(bootstrap)重复 1000次，以检验树拓扑
结构的可靠性。
2 结果与分析
2．1 法落海、当归属与独活属间不同 I1S区的序
列长度与 GC百分含量比较
法落海、当归属以及独活属植物的 ITS序列的
长度和 GC含量相近(详见表 2)；虽然三者在 ITS2
区段没有显著差别，但在 ITS1区段，法落海在序列
长度与 GC含量上与当归属植物的更为接近。
表 2 法落海、当归属与独活属间不同ITS区的序列长度与GC含量比较
—
Table 2 Comparison oflen
—
gths and G & C contents am
—
on
—
g A．apaensis，Angelica，an d Heracleum on diferent ITS regions
2．2 基于不同 ITS区序列分析法落海、当归属与
独活属间的遗传距离
虽然ITS1和ITS2在核基因组中紧密相连，但在
使用PAUP 4．0中的partition—homogeneity test对所有
检测植物的ITS1和ITS2的序列进行 了分析时发现，
P值为0．01，远小于0．05，显示两者相差较大。为此。
以下分析均将基于ITS1和ITS2两段序列分别进行。
除外类群羌活(IV．inchum)外，所有涉及植物的
ITS序列经排序后，其 ITS1和 ITS2区的序列长度分
别为218 bp和 223 bp(包括 gap)。屈良鹄等【1 通
过对不同植物类群的 ITS序列分析比较得出：被子
植物大多数属内的遗传距离值为0．012—0．102。属
间遗传距离值为0．096～0．288。本研究中，虽然当
归属(Angelica)植物的属内遗传距离值大于独活属
(Herac~um)植物的属内遗传距离值，但这两属属内
与属间的遗传距离值都符合屈 良鹄等 的计算结
果 ¨。而法落海与两属间的遗传距离值，其计算结
果因选取不同的ITS区而有所不同：若根据 ITS1区
序列计算，则法落海与当归属之间的遗传距离值
(0．051)远小于法落海与独活属之间的遗传距离值
(0。185)；而依据 ITS2区序列计算，法落海与独活属
之间的遗传距离值(0．008)更远小于法落海与当归
属之间的遗传距离值(0．237)。这显示依据不同的
ITS区序列分析会产生不同甚至截然相反的结果。
表 3 基于不同 ITS区序列分析法落海、当归属和
独活属间的遗传距离
Table 3 Genetic distance comparison am ong A．apaensis
，
Angelica，and Heracleum on diferent ITS regions
2．3 基于不同ITS区序列构建的分子系统树的比
较与分析
分别根据 ITS1序列与 ITS2序列，以羌活(Ⅳ-
inchum)作为外类群通过邻接法、最大简约法和最
大似然法构建 NJ(neighbor-joining)树、MP(maxi．
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146 武 汉 植 物 学 研 究 第25卷
mum parsimony)树和 ML(maximum likelihood)树，共
得到6个系统树，具体见图1和图2。虽然不同系
统树的构建依据了不同的计算方法，但比较这些系
统树可见：依据相同序列运用不同计算方法构建的
系统树则在拓扑结构上相近(如图 1中的 A—C、图
2中的A—C)，而依据不同序列运用同种计算方法
构建的系统树在拓扑结构上却有较大差别(如图1、
Ⅳ．incisidm ’
A．apaensi$’’
A．kangdingensis
A．maowenensis
A．dahurica
A．omeie，坫is
A．gigas
A．cartilaginomarginata
．keiskef
A．japonica
A．morii
A．potymorpha
A．sachalinensis
H．sphondylium
H．aconitifolium
1t．stenopterum
1t．1anatum
H．moelendorfii
图2中的2个 A图、2个 B图和2个C图)。在6个系统
树中，当归属与独活属的植物均各 自归到两大分支，
两属间没有出现交叉现象。分类上有歧义的法落海
在系统树中的位置依据所选取ITS区的不同而有较
大的变动：在以ITS1序列构建的3个系统树中(图1：
A—C)，当归属植物被分成两组，法落海与其中同样
来源于四川的康定当归 (Angelica kangdingensis)和
|Ⅳ．incisidm’
A．apaensis’’
A．kangdingensis
A．maowenen$is
A．dahurica
A．omeie，坫is
A．gigas
A．cartilaginomarginata
A．keiskei
A．japonica
A．morii
A．polymorpha
A．sachalinensis
H．sphondylium
H．aconitifolium
H．stenopterum
H．1anamm
II．moelendorfi~i
N．inCist硼 ’
A．apaensis’’
A．kangdingensis
A．maowenensis
A．dahuric口
A．omeie，坫is
A．cartilaginomarginata
A．keiskei
A．japonica
A．morii
A．gigas
A．polymorpha
A，sachalinensis
H．sphondylium
H．aconitiyo“tlm
H．stenopterum
H lanatum
H．moelendo~ i
图 1 根据邻接法(A)、最大简约法(B)和最大似然法(C)构建的ITS1严格一致系统树
(1000次的重复抽样分析的 自展值在分支上方。 ·表示外类群，料 表示法落海。以下表示都如此图)
Fig．1 Strict c n8ensls trees const~cted On ITS1 8ecItlence8 by the neighbor-joining(A)，the ma】‘im岫 parsimony(B)and
the maximLlm likelihood(C)methods(Bootstrap VOgUeS of 1000 replicates are shown near branches．|Represents
the outgroup； ||Represents A．apaen~／s．Folowing figures are the sanl~．
Ⅳ．incisum ’
H．sphondylium
H．aconitifolium
A．apaensis’’
H．1anatum
H．moelendor~i
H．stenopterum
A．omeie，坫is
A．cartilaginomarginata
A． is t
A．gigas
A．japonica
A．morii
A．dahurica
A．kangdingensis
A．maowenensis
A．pob,morp~
A．sachalinensis
∞
一
I
8l厂
L
99
厂
Ⅳ incis棚 ’
H．sphondylium
H．aconiJ 如Bum
A．apaensis’’
H lanatum
H．moelendorfi~i
H．stenopterum
A．cartilaginomarginata
． keiskei
A．dahurica
A．omewnsis
A．kangdingensis
A．maowenerK~i$
Apolymorpha
A．sachalinensis
A．gigas
A．japontca
A．morii
N． Clsidm ’
H．sphondylium
A．apaensis’’
H．aconitifolium
H lanatum
II．moelendorfi~i
H．stenopterum
A．cartilaginomarginata
A．keiskei
A．gigas
A．japomca
A．morii
A．kangdingensis
A．maowenetl$ts
A．po!ymorpha
A．sachaliner~is
A．dahurica
A．ome／e，坫／s
图 2 根据邻接法【A)、最大简约法【B)和最大似然法(C)构建的ITS2严格一致系统树
Fig．2 Strict consensus tlees constructed on ITS2 sequences by the neig~abor-joining(A)，the maximum
parsimony(B)and the maximum likelihood(C)methods
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第2期 薛华杰等：基于ITS序列探讨法落海的系统分类学地位 147
茂汶当归(A．maowertens／s)构成当归属分支内部的
一 小分枝；在以ITS2序列构建的3个系统树中(图
2：A—C)，法落海又无一例外地位于独活属分支的
内部。以上结果再一次显示依据不同的ITS区序列
分析法落海的系统位置会得出不同甚至是截然相反
的结果。
2．4 法落海、当归属与独活属植物 ITS序列特异
性位点上的碱基组成比较
在将当归属与独活属植物以及法落海的 ITS序
列(包括ITS1与ITS2)经ClustalX程序进行对位排序
后，分析它们的碱基组成时发现：在ITS1区的2o个位
点和ITS2区的26个位点上，所检测的当归属植物的碱
基相同，独活属植物的碱基也相同，但当归属与独活
属植物在这些位点上的碱基却截然不同(详见表4)；
而在这些位点上，法落海在ITS1区段与当归属植物的
完全一致，在ITS2区段则与独活属植物的完全一致。
表 4 法落海、当归属和独活属 ITS1和 ITS2序列特异性位点上的碱基比较
Table 4 Comparison of nueleotide acids at special sites ofITS1 and ITS2 regions among A．apaens／s，Angelica and Heracleum
·位点序号计算包括 gap。
· Sites w哪 counted including gaps．
3讨论 表5T 较
法落海是我国的特有种，前人在对其系统位置
进行研究时，多半是从分生果与花粉的形态、染色体
核型以及化学成分等方面考虑。但正如表 5所示：
在经典分类学、核型以及化学成分等方面，法落海部
分特征与当归属植物的类似，部分特征又与独活属
植物的一致，这使得法落海的系统位置一直摇摆不
定，因此有研究者提出法落海可能是介于当归属与
独活属之间的过渡类型的这一观点⋯。但要确定
法落海的分类地位，仍需要寻找新的分类学证据。
characters am ongA．apaens／s，Angelica an d Heradeum
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我们试图从 ITS序列角度讨论法落海的系统分
类学地位。分析结果表明：无论从长度(表2)、遗传
距离(表 3)还是系统树分析(图 1、图 2)，基于不同
的 ITS区分析法落海的系统分类地位均得出不同甚
至截然相反的结论：若依据 ITS1序列分析，法落海
与当归属植物的亲缘关系相近，应该归属到当归属；
若依据 ITS2序列分析，法落海与独活属植物的亲缘
关系更近，应该归属到独活属。但分析它与已检测
的当归属、独活属植物 ITS序列的碱基组成时发现，
在一些特殊位置上，当归属属内与独活属属内植物
的碱基完全一致，但两属问在这些位点上的碱基却
截然不同；而法落海在ITS1区却拥有当归属植物的
序列特征，在ITS2区却拥有独活属植物的序列特征
(表4)。这就是为什么依据不同的ITS区分析会得
出不同的结论的原因所在。法落海在不同ITS区分
别拥有当归属与独活属的序列特征，说明在遗传关
系上，法落海是介于当归属与独活属两属之间的一
个分类群。由于尚未发现 ITS1序列、ITS2序列分别
与法落海的完全一致的当归属和独活属相应的植
物，因此，在进化关系中法落海是在两属问的过渡类
群，还是两属中某两个种的杂交后代，这还需要寻找
进一步的遗传学证据。
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