全 文 ：武汉植物学研究 2006，24(6)：536～540
Journal of Wuhan Botanical Research
曼地亚红豆杉细胞系的建立与评价
杨秦，李丽琴，付春华，余龙江
(华中科技大学生命科学与技术学院，武汉 430074)
摘 要：红豆杉(Taxus)细胞内紫杉醇的含量低且不稳定，限制了利用细胞培养大规模生产紫杉醇的产业化进程。
以紫杉醇含量较高的曼地亚红豆杉 (Taxus med／a)为试材，诱导得到 了曼地亚红豆杉愈伤组织 ，在添加抗坏血
酸(vc)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、活性炭(activated carbon)的改良B5培养基上，15次反复继代培养后获得了高产
紫杉醇的细胞系。对新建立的曼地亚红豆杉细胞系(MC)与同期诱导的东北红豆杉细胞系(NC)及实验室继代多
年的中国红豆杉细胞系(sc)在细胞生长周期、紫杉醇含量和细胞死亡率等方面进行了分析比较。结果表明，sc的
生长量达5．9倍，高于MC和NC的3．6和4．2倍。在初始接种量相近的情况下，MC的悬浮培养细胞在一个周期
内紫杉醇产量可达 9．5 m L，经过茉莉酸甲酯(MJ)诱导后可达到41 ms／L。
关键词：红豆杉；细胞培养；生长周期；紫杉醇
中图分类号：Q943．1 文献标识码：A 文章编号：1000—470X(2006)06·0536—05
Establishment and Assessment of Taxus media Cel Line
YANG Qin，LI Li·Qin，FU Chun·Hua，YU Long·Jiang
(Colege ofLife Science and Technology，Huazhong University ofScience and Technology 。Wuhan 430074。China)
Abstract：Taxolin Taxus cel iS little and unstable．which prevents the industriMizafion process of pro．
ducing taxol by cell culture．Using Taxus med／a as materia1．the med／a Cauus was accrued．After sub—
culturing on solid modified B5 medium for 15 time，and supplied with VC，PVP and activated carbon，
cel line with the ability of high taxol production was attained．Cel growth cycle，taxol content and cell
death rate of media(MC)， cuspidate(NC)which was successfuly established at the salle time and
chinensis(SC)which was subcuhured for several years in the lab was studied．The results show that
the biomass of SC reaches the peak of5．9 times．which iS higher than that of NC and MC．W ith the salne
initial inoculation weight，taxol production of MC reached at 9．5 mg／L，and that could reach at 41mg／L
after induced by MJ．
Key words：Tazus；Cel culture；Growth cycle；Taxol
紫杉醇(taxo1)最初是从短叶红豆杉 (Taxus
brevifolia)的树皮中分离出的具有抗癌活性的二萜
类生物碱⋯。从红豆杉属植物的树皮中提取紫杉
醇是目前紫杉醇来源的主要途径，然而这种方法严
重破坏了红豆杉野生资源。因此，研究人员一直致
力于解决紫杉醇的来源问题。红豆杉细胞培养大规
模生产紫杉醇是公认的最有希望解决紫杉醇供应紧
张问题的途径之一‘2 J。由于红豆杉细胞 内紫杉醇
的含量很低且不稳定，长期以来没能很好的应用到
大规模生产中。马玺等认为，得到高产紫杉醇的红
豆杉细胞株是工业化生产紫杉醇的关键因素之
一
。 曼地亚红豆杉 (Taxus med／a)是北美太平洋
沿岸的一种灌木，其三年生树叶中紫杉醇的含量高
达O．017％ ～0．051％，高于云南红豆杉树皮中的含
量 J。以紫杉醇含量高的外植体作为诱导材料，可
能获得紫杉醇产量高的细胞系，因此诱导曼地亚红
豆杉愈伤组织并进行继代筛选可能是获得高产细胞
系的一个良好途径。但是迄今为止，国内尚未有曼
地亚红豆杉高产细胞系的报道。因此我们以紫杉醇
含量高的曼地亚红豆杉作为诱导材料，建立高产紫
杉醇的曼地亚红豆杉细胞系，并对其进行评价。
1 材料与方法
1．1 材料
以曼地亚红豆杉(Taxus media vat．hicks)和东
北红豆杉(Taxuscuspidate)的嫩茎、茎尖和叶片(采
收稿13期：2006-04-25，修回13期：2006-07-28。
基金项 目：国家 863计划 (102—12-06-01)湖北省新世纪人才项目资助。
作者简介 ：杨秦(1981一)，女，硕士，从事植物生物技术研究。
· 通讯作者(E—mail：yldo玎西i8Ig@mail．hust．edu．cr1)o
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第 6斯 杨 妻等 曼地亚红豆杉细胞系的建立与评价
于2003年7月)为孱导材料．分别用 75％乙醇消毒
10 s，双氧水消毒5 min．0 5％ Hgcl2消毒 8 mln，无
菌水漂洗5次．切成 1～2 cm长的小段，接种在 Ms培
养基上进行愈伤组织诱导。用于麻伤组织诱导的MS
培养基中含蔗糖 30吕／L，二氯苯氧乙酸0 2,W／L，
“-蔡乙酸13 5 m L．pH为5 8
1 2 继 代培养
待愈伤组织形成后转入改照B5培养基 中继代
培养．该培养基含水解乳蛋白0 5 I ，蔗糖30 L，二
氯苯氧己酸0 1 me／L，6一苄氩基嘌呤0 5 m,VL．d-荣
乙醴0 5 mg／L，pH为5 8。培养温度为(24±1)℃．
暗培养，每隔30 d挑取疏松透明的愈伤组织继代一
次 改臣B5培养基中反复多次加入抗坏血酸 、聚
乙烯吡咯烷酮、活性炭等进行抗褐变培养，并参照文
献[6]进行条件培养，直至最终得到稳定增殖的细
胞系 。
I 3 细胞生 长周期
取新 建立 的曼地 亚 红豆 杉细 胞 系(MC)、东北
红豆杉细胞系(NC)和本实验室继代了多年的分散
性良好的中国红豆杉(Taxu~ ⋯ )细胞系(SC)
的鲜重细胞各 10 g，分别接种于 l00 mL的固体和液
体培养基中．每4 d称其细胞鲜重和干重，以28 d为
1个周期。液体培养基为继代所用的改 良B5固体
培养基 去掉琼脂组 成。
细胞鲜重的称量以用蒸馏水冲洗细胞后抽滤至
完全无水分滤出为准 细胞干重的称量以新鲜细胞
放人柏℃烘箱里烘至恒重为准 干鲜重的比值为
烘干后的细胞重量与新鲜细胞重量之比。所有实验
均重复 3次。
I 4 紫杉醇含量测定
每4 d取液体悬浮培养的3种红豆杉细胞系进
行紫杉醇含量的测定。另设一实验组在液体悬浮培
养第 12 d．在3种红豆杉细胞中分别加人 100 Ismol／
1 的茉莉酸甲酯(MJ)进行诱导，每4 d取一次样分
析。使用HPLC测定细胞中紫杉醇含量，具体方法
参见文献 [7]：将鲜细胞冷冻 干燥 至恒 重 称取
l00 mg干 细胞，用 3 mL CH OH—cH2CI2混合液
(1：1)浸泡，超声处理 10 min，取出浸提液，向其中
加入CH2CI2 2．0mL、水8 0 mL、(NH )2SO 饱和溶
液1 0 mL．振荡萃取．收集 CH cl 层液体．40 下真
空干燥．最后用 1 0 ml CH OH重新溶解菰干残留物
后进行 HPLC检测 HPLC仪为法国Gilson公司全自
动高教液相色潜仪．包惜柱为c—I8厦相柱，柱温为
250c，流动相为甲醇 永 =7：3，流速为1．0 mL／min，
紫杉醇标准品由美国NCI提供。
1 5 细胞 死亡的测 定
经砌 诱导的实验组细胞每4 d取样分析其细
胞死亡率．参见文献[8]进行：取细胞悬浮液在砂芯
漏斗过滤，I g细胞在0 n5％Eva地Blue浸泡10 min．
用蒸馏水洗至无色，在4 mL I％ SDS(50％甲醇配成)
5o 保温30 min．加人2 mI_蒸馏水稀释 震荡后在
8000 r／min离心 3 rain 取 上清夜 ，以6OO砌 处 的吸
光值为细胞死亡率 E⋯ Blue对衰老或死亡的细
胞具有很好的染色效果．而对健康或活力高的细胞基
本不染色．因此，常用于鉴定细胞的死亡程度
2 结果 与分析
2 1 愈伤组织的诱导和细胞系的建立
幼嫩的外植体在接种后 10 d左右即开始发生
愈伤组织．出愈率达到 100％．愈伤组织一般出现在
茎段的两端或是四口处以及叶腋问，初生愈伤组织
多为淡黄或淡绿色．必须及时继代转到继代培养基
中，否则会迅速褐化．向培养基分泌棕色物质并最终
死亡。继代过程中向培养基反复添加活性擞的抗褐
变教果优于抗坏血酸和聚乙烯吡咯烷酮．添加条件
培养液对于细胞的生长有明显的促进作用，继代 l5
次后得到了生长活跃、颗粒疏松、分散性良好的细胞
系。图I即为新建立的曼地亚红豆杉细胞系(MC)
^ 盟地亚红豆栏婀吡茉(MCj，B 东北 豆# 胞系(NC)；c 中目虹豆杉 胞采(sc)
A “media ¨ r¨e(MC)．D 唧 出 cellne( c)；c m f 1lline(sc
圈 1 3种红豆杉细胞系离体培养
Fig．1 HcI r ‰ cel ⋯ in m cultlvatlon
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武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
东北红豆杉细胞系(NC)和本实验室继代了多年的
中国红豆杉细胞系(SC)。
2．2 3种细胞系的生长周期
2．2．1 细胞鲜重的生长
在固体和液体培养条件下，3种细胞系均能持
续分裂和生长增殖。无论是固体培养还是液体悬浮
培养，均以中国红豆杉细胞系(sc)倍增率最高，分
别为5．5和5．9(见图2：A，B)。新建立的曼地亚红
豆杉细胞系(MC)和东北红豆杉细胞系(NC)的倍
增率在固体培养的条件下为 3．3和4．1，在液体悬
浮培养的条件下分别为 3．6和4．2。3种细胞在 2
种条件下培养均呈典型的s型生长曲线。
但在固体培养的条件下，MC和 NC进入指数生
长期的时间基本上滞后于 sC 5 d，液体培养的条件
下也滞后 3 d，进入平台期的时间则相对较为一致。
这可能是由于两种新建细胞系离体培养继代的时间
少于中国红豆杉，在较短的适应离体环境的过程中，
根据外界环境的变化和营养成分的改变而迅速启动
细胞分裂增 殖的相关基 因和酶类的表达较 sC
迟钝。
培养天数 (d) 培养天数 (d)
Cultur~days Cultur~days
图 2 3种细胞系固体培养(A)和液体
培养(B)鲜重的生长曲线
Fi 2 ．I1le growth curve of cel fresh weight ofthree
cell lines in solid state cultivation(A)and in
liquid state cultivation(B)
2．2．2 细胞干重的增长
从图2中可以看出，在液体悬浮培养和固体培
养两种情况下，MC的细胞鲜重在 28 d的生长周期
内均明显低于 sC和NC。但 MC在整个生长周期的
前期和中期，其干鲜重的比值是最高的，在后期略低
于sc，但始终高于NC(见图3：A，B)。经过计算可
以得出MC的最高干鲜重比为 1／15．35，NC和sc
的依次为 1／22．96，1／23．02，这说明MC的细胞中
胞质含水量最少。对 3种细胞进一步在光学显微镜
下观察，随机选取 3种细胞各 100个，测量其细胞大
小 ，3种细胞大小并无 明显差异 ，细胞直径约为
29 。说明 MC细胞中细胞壁、细胞核和其他细
胞器占有较大的比例，这可能与 MC褐化程度较 NC
和sC要严重、细胞在生长过程中还要产生大量的
酚类化合物和其他次生代谢产物有关。
是羔
雪
图 3 3种细胞系固体培养(A)和液体
培养(B)干重的增长曲线
Fig． 3 The growth curve of cel dry weight of three
cel lines in solid state cultivation(A)and in
liquid state cultivation(B)
2．3 MJ诱导前后 3种液体悬浮培养细胞紫杉醇
产量和细胞死亡率
从细胞培养的第4 d开始检测紫杉醇，sC在悬
浮培养的4～16 d均未检测到紫杉醇，而 MC和 NC
在培养的第4 d即可检测出紫杉醇，并随着培养天
数的增加紫杉醇的含量逐渐提高(图4)。到培养的
第28 d，MC的紫杉醇产量达到 9．7 mg／L，约为细
胞干重的0．054％，高于sc经MJ诱导 12 d的紫杉
醇含量(3．1 mg／L)。用 MJ诱导 12 d的 MC紫杉醇
产量高达41 mg／L(图5)，约为细胞干重的0．23％。
l
墨
g
一 j
0 5 10 15 20 25 30
培养天数 (d)
Cultur~days
图 4 三种细胞系液体悬浮培养紫杉醇产量
Fig．4 Th e taxol production of three cel lines
in liquid state cultivation
40
so
— j
4 8 12
MJ诱导天数 (d)
Trcatancnt days
图 5 MJ诱导后的紫杉醇产量
Fig．5 Th e taxol production after inducing by MJ
∞ ∞ ∞ 如 ∞ m
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第6期 杨 秦等：曼地亚红豆杉细胞系的建立与评价 539
实验结果表明，sC中紫杉醇含量远低于 MC，同
时诱导培养的NC中紫杉醇含量也低于MC。本实
验室在2000年曾报道，中国红豆杉细胞系在诱导成
功一年左右时，紫杉醇含量为 20—45 g／ 。其
结果与本实验成功诱导的东北红豆杉细胞系的紫杉
醇产量接近，而远低于曼地亚红豆杉细胞系，说明不
同种的红豆杉细胞系中紫杉醇含量并不相同。而且
一 般外植体的紫杉醇含量越高，得到的细胞系中紫
杉醇的含量也越高。
除了来源于不同的红豆杉物种的原因外，可能
还与不同的离体继代培养时间有关。本实验室的
sC在不断继代过程中已逐渐适应了外界的生长环
境，呈现出良好的生长状态。而紫杉醇是红豆杉为
了防御外界侵袭而产生的一种植物抗毒素，是受植
物防御基因调控的次生代谢产物 。¨。，长期在适宜的
环境下生长，细胞中启动紫杉醇合成的与植物防御
相关的基因可能会发生关闭。sC中紫杉醇含量低
的原因可能也正是由于该细胞系在长期继代的过程
中逐渐适应，逐渐驯化，从而紫杉醇含量也逐渐
下降。
经 MJ诱导后，悬浮培养的MC的细胞死亡率较
NC和 SC高，且随着 MJ诱导时间的增加，细胞死亡
率也在逐渐增加(见图6)。紫杉醇本身也是一种强
烈的凋亡诱导剂，可通过调控细胞的基因表达和一
些酶的合成诱导细胞发生凋亡 ¨ 。从而导致了生
长快的细胞系中紫杉醇含量较低，而生长慢的细胞
系中紫杉醇含量高⋯l2】。本实验建立的 MC生长
较 sC慢，但紫杉醇含量远高于后者。两步培养是
解决细胞生长与紫杉醇合成矛盾的有效方法 引。
通过诱导筛选得到高产紫杉醇的细胞株系，不仅能
在第一步迅速积累最多的生物量，也能在第二步生
产培养过程中通过添加各种前体物质和诱导子陕速
提高紫杉醇的产量。
僻
U
恳
MJ诱导天数 (d)
Treatment day
图6 经MJ诱导后的 3种悬浮培养细胞系的死亡率
Fig．6 Cdl death rate of three kinds of cdl
line inducing by MJ
3 讨论
新诱导建立的细胞系和继代多年的细胞系无论
是在细胞的生长周期、紫杉醇含量和细胞死亡率上
都有明显的区别。本研究报道的MC是国内首次成
功建立的曼地亚红豆杉悬浮培养细胞系，1个培养
周期内紫杉醇的总产量不仅远高于 sC，也高于本实
验室同期建立的东北红豆杉细胞系，同样也高于唐
丽娟报 道 的紫 杉醇 总 产量 为 0．127 mg／L 和
0．487 mg／L的细胞系【】引、甘烦远等报道的紫杉醇产
量为0．02％的细胞系 ¨。近些年来，一些筛选出
的高产细胞 系紫杉醇 含量达到 了细胞 干重 的
0．1％ 一0．3％ 口引
。 本研究中的 MC在培养 1个周
期后，紫杉醇含量达到细胞干重的0．054％，且 MC
在生产较多紫杉醇的同时能够保持细胞旺盛的分裂
增殖，在受到 MJ诱导刺激后又能迅速地促进与紫
杉醇合成相关的植物防御基因的启动，使紫杉醇的
产量迅速提高。MC是目前得到的非常有希望进行
大规模产业化培养的高产紫杉醇的红豆杉细胞系。
Jaziri M等 ’¨ 提出若不经常更换高产细胞系，
则紫杉醇的产量也会下降且极不稳定。梅兴国
等L1引提出高产细胞系的稳定性问题 ，一般可分为两
种情况：一种是细胞系能够多年稳产高产，另一种是
细胞系高产性不稳定，这些细胞系大多必须经过反
复不断的筛选才能稳产高产。由于紫杉醇是一种抗
有丝分裂剂，在有丝分裂过程中，干扰了细胞的正常
分裂，使红豆杉细胞染色体数目发生变异，高产紫杉
醇的红豆杉细胞系应属于第二种情况。因此，稳定
地保存并不断地筛选高产紫杉醇细胞系已成为细胞
培养实现工业化生产最基础、最重要的任务。在今
后的研究中，我们将继续利用 MC的良好性状，利用
合理的生产培养基，添加合适的前体物质和诱导子
进一步提高紫杉醇的产量，为进行大规模的工业化
生产奠定基础。
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账号：6510003042610002517 电话：010-62214715。62214665 传真：010-62214866
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