全 文 ：第 4 卷 第 1 期
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1
草 地 学 报
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1 9 9 6 年
1 9 9 6
根癌农杆菌介导的 1一磷酸甘露醇脱氢
酶基因转化百脉根的研究 ’
陈 燕 李 聪 苏加楷 黄文惠
(中国农业科学院畜牧研究所 , 北京 10 0 94)
陈受宜 刘风华
(中国科学院遗传研究所 , 北京 1。。10 1)
摘要 : 本文以百脉根子叶外植体为受体材料 , 通过根癌农杆菌介导的方法 , 导入外源目的
基因 1一磷酸甘露醇脱氢酶(m tl D )基因和 n Pt 一 I 基因 , 建立了转化系统 , 获得转基因植株 , 转化
频率为 9 . 7% 。 转化处理的外植体再生植株的茎段在含卡那霉素的分化培养基上膨大 , 再生成
苗和植株 . 抗性植株的形态正常 , 移入盆栽后生长良好 . PC R 扩增与扩增产物的S ou ther n 杂交
证明外源基因已整合到百脉根基因组上 。
关键词 : 百脉根 ; 根癌农杆菌 ; 基因转化 ; 再生植株
1 前言
利用基因工程技术进行牧草育种 ,对于改良牧草的品质 , 提高其抗逆性状都具有重要的
意 义 。 文献曾报道紫花首楷(De ine ko 等 , 1”2 ) 、百脉根 (虞建平和邵启全 , 1”0) 、 白三叶
(V o isey 等 , 2 9 94 )和柱花草(M a n n e rs 和 W a y , 29 8 9 )等豆科牧草已相继用土壤农杆菌介导的
方法进行外源基因的转化研究 ,并获得再生植株。豆科牧草耐盐基因工程的研究是其中一项
重要内容 。
1
一磷酸甘露醇脱氢酶基因(D av is 等 , 1 98 8) 是继脯氨酸合成酶基因(P ro BA C ) 、甘氨酸甜
菜碱醛脱氢酶基因之后新发现的又一类与耐盐性有关的调渗基因 。 百脉根是温带地区重要
的豆科牧草 , 抗逆性强 ,饲用安全 , 特别是其细胞再生性在豆科牧草中是最好的 , 并已建立由
外植体直接分化不定芽的高频率再生系统(吕德杨等 , 1 9 86 ) 。因此是研究外源基因表达的理
想受体材料 。
本研究将 1 一磷酸甘露醇脱氢酶基 因通过根癌农杆菌 (A g动a ct eriu m tu m efa ‘洒: : 简称
A
.
t
.
)介导转化百脉根 ,而且首次报道该基因用于豆科牧草转化获得工程植株的研究结果 。
旨在以 A . t . 为介导研究 m d D 基因在百脉根中的转化表达水平 , 并为其它豆科牧草的外源
基因转化与耐盐机制的研究提供依据 。
2 材料与方法
2
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1 菌种及其培养
根癌农杆菌 (A . t . )菌株为 A G LI , 其非致瘤性 Ti 质粒 pBi n4 38 中含有 K a m r 标记基因
, 本研究由国家科委 8 63 计划资助
草 地 学 报 1 9 9 6 年
n Pt
一
l 和外源 目的基因 1一磷酸甘露醇脱氢酶基因、
图 1 所示为该质粒的 T 一D N A 区 。 (由中国科学院遗传研究所提供 )
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图 1 pB in 4 3 8 T 一D N A 区简图
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一
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菌株在附加卡那霉素 50 m g / L 的 LB 培养基上培养 。 在 26 ~ 28 ‘C下振荡培养至对数生
长期 , 即可用于感染 。
2. 2 植物材料
里奥百脉根 (Lo tu : 。or n ic ul at “: L . CV . Leo )种子由本所饲料室提供 。
种子经 70 %酒精表面消毒 10 分钟 , 0 . 1 %升汞消毒 30 分钟 , 无菌水洗 4 次后播种于
M S 培养基 。 萌发后 5 ~ 8 天 ,取其展开的子叶进行转化处理 。
2
.
3 转化与培养方法
取百脉根无菌苗子叶 , 横切两半后 , 浸入稀释菌液中(M S : 原根癌农杆菌菌液为 3 :
1 )
, 轻摇 。 30 分钟后用滤纸吸干子叶表面上多余的菌液 , 接入 M S + 6 一 BA 0 . lm g / L 的固体
培养基中 。共培养 3 天后转入附加卡那霉素的分化培养基 (M S + 6 一BA 0 . lm g / L + 卡那霉素
25 m g / L + 头抱霉素 3 0 m g / L )中进行转化体的筛选培养 。以后每 3 周转接 1 次 , 并将卡那霉
素增至 1 0 o m g / L 。 继代 3 次以上 。 取再生苗上不含生长点的茎段再次接入附加卡那霉素的
分化培养基中进行筛选培养 。 培养条件为 26 ~ 28 ℃ , 每日光照 12 小时 , 光照强度为 2 0 0 0
fu x
。 再生苗超过 3c m 时 , 切下并转入无激素M S 培养基中诱导生根 。 生根后移栽至花盆中 。
2
.
4 转化体的分子鉴定
提取转化的百脉根再生植株的 D N A 作为模板 , 进行 m tl D 基因的 PC R 扩增 。 引物是根
据 m d D 基因已知序列 (D av is 等 , 1 9 8 8) 人工合成的 , 分别为 :
引物 1 : 5 , A G A G G A T CC A G G T T A A T A CT A T G A AA G 3’
引物 2 : 5 , A CT G A T CG C T G A C A A A G G T A C CA G C C 3 ‘
循环参数为 :
9 4 C洲 狡护
7 2 ℃ 翎 骊 万 - 5 3 ℃
(循环次数 35 次)
提取 pB in 4 3 8 质粒 , 并以”P 标记作探针 , 对扩增产物进行 S o u the r n 杂交 , 参照 M a n ia t is
等人的方法 (1 9 5 2 ) 。
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3 结果与分析
3
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1 子叶外植体的转化与卡那霉素杭性植株的再生和移栽 。
5~ 8 日龄的百脉根子叶外植体 , 经根癌农杆菌感染 , 共培养 3 天后 , 转入附加卡那霉素
的分化培养基中。 2 周后外植体膨大 , 在切 口处出现突起的愈伤组织和不定芽 , 或仅有绿芽
而无明显的愈伤组织 。 再生芽丛生 , 外观正常 。 4 周后的统计分化率为 9 . 7 % (30 /3 1 0 ) 。 经
多次继代后取再生苗茎段接入附加卡那霉素的分化培养基中 , 2 周后切口膨大 , 分化出再生
芽 , 再生芽密集丛生 。
再生芽发育成苗 , 高 3c m 以上时切下 , 接入无激素M S 培养基中 , 3 周后 , 多数苗能正常
生根 。 4 周后 , 移栽入花盆中 。 再生植株成活并生长良好 。
与此同时 , 将对照接入附加卡那霉素的分化培养基中。 4 周后并无芽的分化 。 切口处褐
化 、坏死 。 外植体逐渐死亡 。 这表明 25 m g / L ~ IOOm g / L 的卡那霉素浓度能有效地抑制非转
化组织的生长和再生 。
3
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2 转化休的分子鉴定结果
转化处理的百脉根再生植株 (R 。代 )经检菌无农杆菌污染后 , 提取其核 D N A 作为扩增
m t1 D 基因的模板 。 结果在 120 、 60 、 Zong 三个模板浓度下扩增出大小约为 1 . o gk b 的特征带 ,
与 pBi n 43 8 的 m dD 基因大小相同 。 而对照组则无此扩增产物出现(图 2 ) 。 扩增产物由凝胶
So
u th e r n 转移至 N C 膜后 , 以”P 标记 p B in 4 38 质粒作探针进行 S o u the r n 杂交 , 结果 m tlD 转
化组出现 1 . o gk b 的阳性杂交带 。 这与阳性对照结果一致 。 而阴性对照没有相应的杂交信号
(图 3 ) 。 这样 , PCR 扩增及扩增产物的 S ou ther n 杂交结果均证明 A G L I 菌中的 m d D 基因已
整合到转基因百脉根 R 。代核基因组内。
4 讨论与小结
4
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1 本文介绍了一种简单有效的豆科植物转化 、再生方法 。 以常规的根癌农杆菌转化程序
同百脉根较强的体细胞全能性相结合 , 提供一个研究外源基因在豆科植物中表达的实验系
统 。该方法取材容易、操作简便 , 且较目前其它几种新技术的重复性好 , 并能避开原生质体培
养的困扰 , 可以作为豆科转化的“模式”植物 ; 同时 , 利用这一系统首次将外源 目的基因 m d D
成功导入百脉根中并获得工程植株 。为进一步开展百脉根的品种改 良、耐盐机制的研究打下
了基础 。
4
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2 采用 PC R 技术结合 Sou ther n Bl ot 对于微量 、快速检测外源基因是一个灵敏而可靠的
方法 (傅荣昭等 , 1” 4 ) 。 实验证明 , 在 PC R 技术中反应条件的掌握对实验成功率影响极大 ,
尤其是植物 D N A 模板浓度 。 本实验设置 30 0 、 1 20 、 60 、 20 和 sn g 多个植物 D N A 模板浓度 ,
结果表明 , 以 60 ~ 1 2 o n g 为最佳 。 浓度过低 , PCR 效率低 , 浓度过高则易引起异位引导 , 出现
非靶序列的扩增 。 在 S o ut he m Bl ot 中 , 对探针标记这一步骤 , 为避免同位素对人体的不利影
响 , 作者曾多次尝试用光敏色素标记的方法 , 该方法用于微生物材料非常有效 (康耀卫 ,
1 9 4 )
, 但实验证明用于植物材料的效果并不理想 。 分析其原因可能是由于植物的基因组相
当庞大 , 外源基因含量相对极低 , 光敏色素标记探针灵敏度不够所致 。
本实验对 m d D 转基因百脉根进行了初步鉴定 , 确定了外源基因的导入 。 而对于外源基
因的表达及后代的遗传性鉴定等工作则有待进一步研究。

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