全 文 ：武汉植物学研究 2006，24(6)：569～573
Journa／of Wuhan Botanical Research
珍稀濒危蕨类植物东方水韭的遗传多样性
陈进明，王青锋
(武汉大学生命科学学院植物系统学与进化生物学研究室，武汉 430072)
摘 要：采用 ISSR分子标记对珍稀濒危蕨类植物东方水韭和中华水韭 4个 自然居群共72个样品进行了 DNA多
态性分析。从65个随机引物中筛选出11个有效引物，共产生98条DNA片段，其中68条为多态性条带，多态位点
百分率(PPL)为 66．33％。东方水韭两个居群的多态位点百分比率(PPL)较低(8．16％和 7．14％)。中华水韭两个
居群的PPL也较低(9．18％和23．47％)。中华水韭物种水平上的PPL(51．02％)高于东方水韭(9．18％)。AMO-
VA分析结果表明，东方水韭遗传变异中主要存在于居群内(94．74％)，而中华水韭绝大部分的遗传变异却存在于
居群间(86．71％)。东方水韭和中华水韭个体间UPGMA聚类结果表明：同一物种的个体完全能聚在一起 ，中华水
韭的两个居群也能明显分开，而东方水韭两居群的个体并不能完全聚在一起。探讨了可能造成上述居群遗传结构
模式的主要因素，同时提出今后工作中需重点解决的问题。
关键词：蕨类植物；东方水韭 ；中华水韭；遗传多样性 ；ISSR
中图分类号：Q347 文献标识码 ：A 文章编号：1000．470X(2006)06．0569．05
Genetic Diversity in the Rare and Endan gered Fern Isoetes orientalis
CHEN Jin-Ming，WANG Qing—Feng
(Laboratory ofPlant跏 ter删 and Evolutionary Biology，CoR e ofLife Sciences，Wuhan University，Wuhan 430072，China)
Abstract：ISSR markers were used to measure genetic diversitv of 72 individuals from four natural popu．
1ations of Isoetes orientalis and L sinemis．two rare an d endangered fem species in China．A total of 98
DNA fragments were scored from the 1 1 ISSR primers and 66．33％ percentages of polymorphic loci
(PP )was found．Low．1evel genetic diversi~within both，．orientalis(8．16％ and 7．14％)and，．
sinensis populations(9．18％ and 23．47％ )was detected in the present study．AM0VA analysis indica．
ted that for，．orientalis most of the variance(94．74％ )resided within populations and for L sinensis a
greater amount of variation(86．71％ )resided between populations．UPGMA cluster indicated that the
individuals from two diferent species were distinct to each other．For L oriental~ the individuals for dif-
ferent po pulations did not chster together．UPGMA cluster an alysis also showed that there was distinct
genetic diferentiation between po pulations of L sinensis．The probable causes that have contributed to the
current paRem of genetic structure were discussed an d the suggestions on the future protection of the
／soetes species were also given in the present study．
Key words：Fern ；Isoetes orientalis： sinensis；Genetic diversity：ISSR
东方水韭(／soetes orientalis)为中国一特有种，隶
属于 水 韭科 (Isoetaceae)的 孑遗 属——水 韭 属
(Isoetes)，具有异型孢子，为多年生沉水植物。东方
水韭曾经被误认为是中华水韭( sinensis)，这可能
是由于该植物在外观、生境以及大孢子表面为网络
状与中华水韭极其相似 J。然而，通过查阅标本以
及对孢子大小和形态的进一步研究表明，两者之间
存在一定的差异(东方水韭的大小孢子均比中华水
韭的要大，而且大孢子具有不规则的网络纹饰突起，
而中华水韭具有较少的突起)，同时该植物的染色
体的数 目(2n=66)与中华水韭(2n=44)完全不同。
据此，刘虹等 将分布于浙江松阳的中华水韭作为
中国一特有新种，并命名为东方水韭( orientalis)。
东方水韭居群较少，目前仅在浙江松阳境内海拔在
1200 m左右的山沟水流较慢的浅沼泽地带发现两
个 自然居群，其中一居群只剩 2O株植物左右，而另
一 居群也不足400株。东方水韭和分布在中国的其
他水韭属植物一样，濒临灭绝。东方水韭已被列为
国家一级重点保护野生植物 。
尽管植物的遗传变异水平与其适应性和进化潜
收稿日期：2006-04-30；修回日期：2006-06．12。
基金项目：国家自然科学基金资助项 目(30370098，305701l1)。
作者简介：陈进明 (1975一)，男，博士，讲师，研究方向为植物系统学与进化生物学(E-mal：jmchen@whu．edu．on)。
+ 通讯作者(Authorfor corespondence．E-mail：q aIlg@whu．edu．ca)。
维普资讯 http://www.cqvip.com
570 武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
力密切相关 ，检测植物群体的遗传变异水平关系到
物种保护和复壮策略和措施的制定 ’引。然而，对
于珍稀濒危植物东方水韭的保护目前尚缺乏基本的
遗传学信息，开展东方水韭现存居群的保护工作已
迫在眉睫。
由于 DNA分子标记能提供整个基因组上多个
位点的遗传学信息，因此这些标记已经成为鉴定具
有较近亲缘关系的植物类群以及揭示植物居群遗传
结构 的有力 工具 J。近年来，ISSR(inter-simple
sequence repeat)分子标记由于操作简便、迅速、稳
定、检测位点数 目多等优点而被广泛应用于植物亲
缘关系的鉴定以及居群遗传多样性的研究中 J。
我们选择 ISSR分子标记对东方水韭和中华水韭居
群进行遗传多样性的比较研究，一方面揭示这两种
水韭遗传差异，为鉴定东方水韭和中华水韭提供遗
传学资料，同时检测东方水韭的遗传多样性水平，为
科学合理的保护和抢救这一珍稀濒危植物资源提供
依据。
1 材料与方法
1．1 材料
东方水韭(Isoetes orientalis)检测材料于2003年
5月采 自浙江松阳两居群(SY．1和 SY-2)，共采集
26个植株，其中在 SY-1居群取 18个样品(编号：
SY⋯1 1 SY-1-18)，在 SY-2居群取 8个样品(编号：
SY-2-1一SY-2-8)。中华水韭 ( sinensis)材料 于
2003年7月分别取 自浙江建德(JD)和安徽休宁
(XN)自然居群，共采集46个植株，其中在JD居群
共取23个样品(编号：JD．1一JD-23)，在 XN居群取
23个样品(编号：XN-1一XN-23)。本研究共采集了
72个植株的幼叶样品，样品用硅胶快速干燥，带回
实验室用于 DNA提取。
1．2 方法
1．2．1 DNA提取与 IsSR-PCR扩增
参试材料 DNA的提取采用改良的CTAB法-9 J。
ISSR-PCR反应体系 (25 )含有 15．5 双
蒸水，2．5 L(2．5 pxnoL／L)dNTPs，2．5 L 10×
PCR bufer(含 M )，0．5 (2 U／ )Taq Polymer-
ase，1 引物 (25 pmo1)，3 模板 (20 ng／ )。
PCR反应在 PTC-100TM扩增仪上进行，反应参数
为：94oC预变性 5 min；94oC变性 30 S，55oC复性
1 min，72~C延伸 2 min，共 35个循环；72oC延伸
10 min。反应产物在 1．5％的琼脂糖凝胶上 ，100 V
稳压电泳，溴化乙锭处理后置于紫外光灯下检测，用
凝胶成像系统拍照，将图像存人计算机待分析。
十聚体寡核苷酸随机引物购自上海 SBS Gene-
teeh公司，PER试剂购于武汉天源生物公司。本实
验共选用了65个引物。随机选取 8个(东方水韭和
中华水韭各 4个)DNA样品进行引物筛选，每个引
物对8个 DNA样品重复扩增两次。依据扩增结果，
对比可重复性、多态性后 ，筛选确定了扩增效果良好
的 11个引物，其序列见表 1。
表 1 用于检测东方水韭和中华水韭遗传变异的
n 个有效引物名称及其碱基序列
Table 1 Name and base sequences of11 efective primers
used for detecting genetic variation in
Isogres orientalis and sinensis
引物 序列
Primeis sequences(5’一3’)
(AG)8C
(AG)8G
(GA)8T
(GA)8C
(GA)8A
(cA)8T
(AC)8C
(AC)8G
(AG)8(C／G)T
(AG)8(C／G)C
(GA)8(C／G)T
1．2．2 数据统计分析
ISSR．PCR产物电泳图谱中的每条 DNA谱带作
为 1个单位，如果有带则定为“1”，没有带则定为
“0”。采用 POPGENE Version 1．31软件 对东方
水韭和中华水韭各个居群以及物种水平分别计算了
多态位 点百分 率 (percentage of polymorphic loci，
P )、基因多样性(日)以及 Shannon指数(，)¨ 。¨
为了了解遗传多样性的分布，本文根据欧几里
德遗传距离矩阵 分别对东方水韭和中华水韭居
群间、居群内以及两物种间的分子变异进行分析
(AMOVA)。以上分析采用 WINAMOVA 1．55软
件-】引。该软 件 的输 入 文 件 由 AMOVA．PREP软
件 制作。显著性检验是通过 1000次置换完成。
为了了解东方水韭和中华水韭个体间的亲缘关
系，我们根据 Nei-Li相似性系数 采用 NTSYSpe
2．O2软件 对两物种所有样品进行 了 UPGMA
聚类。
2 结果
从65个随机引物中筛选出 11个引物进行扩
增，共得到 98条带，其中65条表现出多态性，占总
8 9 O 1 2 6 6 7 4 5 O O O 1 1 1 2 2 3 3 4镐
B B B B B B B B B B B
S S S S S S S S S S S
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 6期 陈进明等：珍稀濒危蕨类植物东方水韭的遗传多样性 57l
带数的66．33％，平均每个引物扩增的DNA带数为
9．0条。位点分子量范围均在 200～2000 bp之间。
东方水韭两个居群以及物种水平上的多态位点百分
比率( )均较低 (<10％)。中华水韭两个居群
的 也较低(9．18％和 23．47％)，而物种水平上
的 稍高(51．02％)。东方水韭和中华水韭各个
居群及各个物种基因多样性与其 Shannon指数的结
果基本相符(表2)。
表 2 东方水韭和中华水韭的遗传多样性
Table 2 Genetic diversity in populations of
L orientalis andL sinensis
类群 居群 {}l 基因多样性shartn0n指数
Tara Population PP
百
L H I (％)
注 ：括号 内为标 准误 。
Note：Numbers in parentheses are standard deviations．
用 AMOVA对东方水韭两个居群的分析结果表
明，两个居群间的基因分化系数 Gs =0．0526，即总
的变异中有5．26％的变异存在于居群间，居群内的
遗传变异占总遗传变异的94．74％。对中华水韭两
个居群的 AMOVA分析结果表明绝大部分的遗传变
异存在于居群间(86．71％)，居群内只占 13．29％。
中华水韭和东方水韭两物种间的基因分化系数为
Gs =0．6522(表 3)。中华水韭和东方水韭各居群
间和居群内以及两物种间的变异均极显著(P<
0．001)。
表 3 东方水韭和中华水韭居群分子变异的
oVA分析结果
Table 3 The AMOVA analy8es of the genetic variances among
popMations of L orientalis and L sinensis
类群
Taxa
方水韭两居群的个体并不能完全聚在一起(图 1)。
遗
．
盘
1．68 1．26 0．84 0．42 0．00
图 1 东方水韭和中华水韭 72个个体的 UPGMA聚类图
Fig．1 Dendro~am of L orientalis and L sinensis
individuals using the UPGMA clustering method
Sou
异来源
。
变
Va
异
ria
组
nc
分
e ％ in totalof vafiafi 3 讨论 Srce 0n J pL
component variation
采用 UPGMA法对东方水韭和中华水韭共 72
个个体进行聚类结果表明：同一物种的个体完全能
聚在一起，中华水韭的两个居群也能明显分开，而东
水韭属植物在中国的分布范围以及种群数量日
益减少，濒临灭绝 ’¨”J。近年来，采用分子标记技
术对水韭属植物遗传多样性的研究已经展开[】 -23]。
陈进明等 ¨采用 RAPD对濒危植物中华水韭进行
了遗传多样性研究，结果表明居群内遗传多样性较
低(P 在0．81％ ～12．90％之间)。Chen等 · 1]
采用 RAPD和 ISSR分子标记，对中国特有且濒危的
水韭属植物高寒水韭进行遗传多样性分析，结果显
示其居群内遗传多样性也较低(RAPD标记的PPL
∽一∽tl ll一∽ ∽ 一 0∞叫
维普资讯 http://www.cqvip.com
572 武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
在 8％ ～26％之间；ISSR标记的 P 在8％ ～35％
之间)。我们采用 ISSR分子标记对濒危蕨类植物
东方水韭和中华水韭进行了遗传多样性研究，结果
显示东方水韭和中华水韭各个居群遗传多样性水平
与上述水韭属植物相似，即居群内遗传多样性水平
较 低 (东 方 水 韭 现 存 两 居 群 的 P 为
8．16％和7．14％；中华 水 韭 两 居 群 的 P 为
9．18％和23．74％)。陈嫒嫒等 采用等位酶标记
技术对中华水韭休宁居群进行了遗传多样性研究，
结果显示中华水韭休宁居群具有较高的遗传多样性
水平(A=1．7，P=55．56％，He=0．201)，认为中华
水韭的克隆繁殖特性以及异源多倍体起源等使得该
种所积累的变异、固定杂合及有性生殖而产生的杂
合性等通过克隆繁殖而被有效固定下来，从而使中
华水韭居群具有较高的遗传多样fgTg平。Kang等 ]
采用 AFLP分子标记技术对中华水韭也进行了遗传
多样性研究 ，结果揭示出中华水韭居群具有中等水
平的遗传多样性水平(I=0．192，P=35．2％)，认为
在该研究中样本量较小可能使该种的遗传多样性水
平有所偏低。近年来，由于人类的活动，中华水韭和
东方水韭的栖息地的生境特征发生了明显的变化，
如水体碱化、硬化和富营养化以及底质碱化等，使中
华水韭和东方水韭逐渐丧失了适生生境；另外，其他
物种的入侵也导致这两个物种居群规模迅速减
小 ’引。野外调查发现，东方水韭松阳居群(SY一1)
仅剩 20株植物左右，而另一居群也不足400株；中
华水韭休宁居群(XN)不足 100株。较小的居群规
模很可能导致水韭属植物居群内个体间近交的发
生，从而造成上述两物种居群内部的遗传多样性水
平较低。同样，为避免破坏这两种水韭的野生居群，
本研究所采集的样品数目也偏少，这很可能在某种
程度上也会造成这两个物种各个居群遗传多样性水
平偏低。
对中华水韭和东方水韭居群间和居群内的分子
变异进行分析，结果发现中华水韭的遗传变异主要
存在于居群间(占总变异的 86．7l％)，而东方水韭
的遗传变异 主要存在于居群 内(占总变异 的
94．74％)。即中华水韭居群间遗传分化较大，而东
方水韭居群问分化较小。水韭属植物采用孢子繁殖
方式，孢子的传播一般要在水域相通的条件下进
行 】。经野外调查发现，中华水韭各居群之间呈间
断的“岛屿”状分布。这种特殊的地理分布可能限
制了种内居群间的随机交配，阻碍了居群间基因的
流动，从而导致居群间基因多样性增大，使居群间遗
传分化愈来愈明显。而东方水韭松阳两居群(SY一1
和SY-2)之间的距离较近，位于同一座山两侧的山
沟沼泽地，两居群之间在雨季有水流相通，这两个居
群很可能存在一定程度上的基因交流，从而使得居
群间的遗传分化较小。对中华水韭和东方水韭72
个个体进行 UPGMA聚类结果也表明，在东方水韭
两居群中很可能存在基因流，因为同一居群的个体
并不能聚在一起 ，而中华水韭同一居群的个体完全
能聚类，表明中华水韭居群间的基因交流有限(图
1)。对于中华水韭和东方水韭而言，两物种各 自的
个体能单独聚在一起，并且通过对两物种的 ISSR分
子变异进行分析，两物种间的遗传分化系数 G盯=
0．6522，表明这两物种间的遗传分化也较为明显。
种内遗传多样性是物种适应环境变化以及物种
进化的基础，是物种避免灭绝而长期生存的前提，对
于物种的保护具有重要的意义 引。正如前文所
述，中华水韭和东方水韭 目前居群数量较少，同时居
群规模也较小，而较小的居群规模很可能导致居群
内个体间近交以及居群内遗传漂变的发生，从而使
得居群内遗传多样性水平进一步降低，同时也使得
居群间的分化加剧。因此，在未来的研究当中，如何
防止水韭属植物居群进一步缩小以及如何复壮种
群，如何提高居群间的基因流，将是在水韭属植物保
护中迫切需要解决的问题。
参考文献：
[1] Liu H，WangQ F，TaylorWC．／soetes or／ent~／s(Isoetaceae)，a
new hexaploid quilwort from China[J]．Novon，2005，15：
164—167．
[2] 于永福．中国野生植物保护工作的里程碑 [J]．植物杂志，
1999．5：3—11．
[3] 葛颂，洪德元．遗传多稃性及其检测方法[A]．见：钱迎倩，
马克平编．生物多样性研究的原理与方法[M]．北京 ：中国
科学技术出版社。1994．123—140．
[4] Mefe G K，Carol C R．Principles of Conservation Biology
[M]．Sunderland，Massachusets：Sinauer Associates，Inc．，
1997．
[5] 邹喻苹 ，葛颂，王晓东．系统与进化植物学中的分子标记[M]．
北京 ：科学出版社。2001．
[6] 葛永奇，邱英雄，丁炳扬，傅承新．孑遗植物银杏群体遗传
多样性的ISSR分析[J]．生物多样性，2003，11(4)：276—
287．
[7] u A，Ge S．Genetic variation and clonal diversity of Psarmnoch-
loa (Poaceae)detected by ISSR markers[J]．Ann Bot，
2001，87：585—590．
[8] Qian w，Ge S，Hong D Y．Genetic variation within and among
populations ofawildrice蛳 granudatafrom China detected by
RAPD and 1SSR ma-,kers[J]．Theor Appl Gene。2001。102：
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 6期 陈进明等 ：珍稀濒危蕨类植物东方水韭的遗传多样性 573
440—449．
[9] Doyle J J，Doyle J L．A rapid DNA isolation procedure for smal
quantities offlesh leafmaterial[J]．Phytoch Bul，1987，19：
11—15．
[10] Yeh F，Yang R C，Boyle T．POPGENE．A User-Friendly Share-
ware for Population Genetic Analysis[M]．Molecular and Bio-
technology Center，University of Alberta，Edmonton，1997．
[11] Lewontin RC．The apportionment of human diversity[J]．Evol
Biol，1972，6：381—398．
[12] Excefl3erL，Smouse PE，Quat~o JM．Analysisofmolecular va-
fiance inferred from metric distances among DNA haplotypes ：ap-
plication to human mitoehondrial DNA restriction data[J]．Ge-
nedcs，1992，131：479-491．
[13] Excefier L．Analysis ofMolecular Variance(AMOVA)version
1．55[M]．Genetics and Biometry Laboratory，University of Ge-
neva，Switzerland，1993．
[14] Miler M P．AMOVA-PREP，A Prog~ for the Preparation of
AMOVA Input File8 from Dominant-marker Raw Data．release
l_O1[M]．Department ofBiological Sciences，Northern Arizona
University，Flagstaf，AZ，1998．
[15] Nei M，Li W H．Mathematical model for studying genetic varia-
tionintemmof restriction endonucleases[J]．ProcNatlAcad＆
USA，1979，76：5269—5273．
[16] Rohlf F J．NTSYSpe：Numerical Taxonomy and Multivariate A．
nalysis System，Version 2．02[M]．Exeter Software，Setauket。
New York，1998．
[17] 郝日明，黄致远，刘兴剑，王中磊 ，徐惠强，姚志刚．中国江
苏珍稀濒危植物的 自然分布及其特征[J]．生物多样性，
2000，8(2)：153—162．
[18] 陈进明，王晶苑，刘星，张彦文，王青锋．中华水韭遗传多
样性的 RAPD分析[J]．生物多样性，2004，12(3)：348—
353．
[19] 陈进明，刘星，王青锋．中国珍稀濒危蕨类植物——云贵水
韭的遗传多样性[J]．武汉大学学报(理学版)，2005，51
(6)：767—770．
[20] Chen J M，Wang J Y，Liu X，Gituru W R，Wang Q F．RAPD
analysis for genetic variation within the endangered quillwort
lsoetes hypsoph／,a(Isoetaceae)[J]．Wuhan Unlv J Nat Sci，
2005a，10：455-459．
[21] Chen JM，Liu X，Wang JY，GituruW R，WangQ F．Genetic
variation within the endangered quiUwort lsoetes hypsophila
(Isoetaceae)in China as evidenced by ISSR analysis[J]．Aquat
Bot，2005b，82：89—98．
[22] 陈嫒嫒，叶其刚，李作洲，黄宏文．极濒危植物中华水韭休宁
居群的遗传结构 [J]．生物多样性，2004，12(6)：564—
571．
[23] Kang M，Ye Q G，Huang H W．Genetic consequence of restrict—
od habitat and population decline in endangered ／soetes sinensis
(I8octaceae)．ArmBot，2005，96：1265—1274．
[24] 庞新安，刘星，刘虹，吴翠，王晶苑，杨书香，王青锋．中国三种
水韭属植物的地理分布与生境特征[J]．生物多样性，2003，
ll(4)：288—294．
[25] weI1M Z，PangXA，WangQ F，TaylorWC．Relationships be-
tween the water chemi shy and distribution of the endangered a-
quaticquilwortlsoetes sinensis PalmerinChina[J]．JFreshwater
Ecol，2003，18(3)：361—367．
[26] 盂繁松．长江流域脊囊属化石的研究及现代水韭 的起源
[J]．植物学报，1998，40(8)：768—774．
[27] Schaal BA，LevefichW J，Rogstad SH．A comparison ofmeth-
ods for assessing genetic variation in plant conservation of il1．re
plants[A]．In：Falk D A，Holsinger K E eds．Genetics and
Conservationof Rare Plants[M]．New York：Oxford University
Press，1991．123—134．
[28] EUstrand N C，Elam D R．Population genetic consequences of
smaUpopulation size：implications for plant conservation[J]．
AnnRevEcol Sm ，1993，24：217—242．
维普资讯 http://www.cqvip.com