全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(4): 636−643 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA10A104), 国家公益性行业(农业)科研专项(200903002-04)和国家现代农业
产业技术体系建设专项(CARS-13)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 孙万仓, E-mail: 18293121851@163.com
第一作者联系方式: E-mail: xiucunzeng@126.com
Received(收稿日期): 2013-07-07; Accepted(接受日期): 2013-11-24; Published online(网络出版日期): 2014-01-16.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140116.1610.010.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00636
白菜型冬油菜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及其在低
温条件下的表达
曾秀存 1,2 刘自刚 2 史鹏辉 2 许耀照 1 孙 佳 3 方 彦 4 杨 刚 2
武军艳 2 孔德晶 2 孙万仓 2,*
1 河西学院农业与生物技术学院 , 甘肃张掖 734000; 2 甘肃农业大学农学院 /甘肃省油菜工程技术研究中心 , 甘肃兰州 730070;
3 Department of Plant Sciences, University of Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan S7N5A8, Canada; 4甘肃农业大学研究测试中心, 甘
肃兰州 730070
摘 要: 超氧化物歧化酶(SOD)是一种逆境条件下清除细胞内活性氧的关键酶, 而铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)
是该酶系中最主要的活性氧清除剂, 与植物的抗逆性关系密切。本研究根据已发表的十字花科植物 Cu/Zn-SOD 基因
的编码区设计引物, 采用 RT-PCR克隆超强抗寒冬油菜陇油 7号 Cu/Zn-SOD的 cDNA序列, 该基因全长 459 bp。生
物信息学分析表明, 该基因与甘蓝型油菜(Brassica napus) Cu/Zn-SOD基因同源性高达 99%, 编码 1个亲水性稳定蛋
白, 无跨膜结构域和信号肽, 具有胞质 Cu/Zn-SOD 超基因家族特有的序列特征和保守结构区域。半定量 RT-PCR 以
及 SOD酶活性分析表明, 低温诱导条件下 Cu/Zn-SOD基因差异表达, 在白菜型冬油菜适应低温胁迫过程中发挥重要
作用。超强抗寒冬油菜陇油 6 号品种低温诱导蛋白的 SDS-PAGE 分析以及蛋白串联质谱技术鉴定表明, Cu/Zn-SOD
是受低温诱导表达的抗逆基因。
关键词: 白菜型冬油菜; Cu/Zn-SOD基因克隆; 低温; 表达分析; SOD活性; 低温诱导蛋白
Cloning and Expression Analysis of Copper and Zinc Superoxide Dismutase
(Cu/Zn-SOD) Gene from Brassica campestris L.
ZENG Xiu-Cun1,2, LIU Zi-Gang2, SHI Peng-Hui2, XU Yao-Zhao1, SUN Jia3, FANG Yan4, YANG Gang2, WU
Jun-Yan2, KONG De-Jing2, and SUN Wan-Cang2,*
1 College of Agronomy and Biotechnology, Hexi University, Zhangye 734000, China; 2 College of Agronomy, Gansu Agricultural University / Gansu
Engineering Research Center of Rapeseed, Lanzhou 730070, China; 3 Department of Plant Sciences, University of Saskatchewan, Saskatoon, Sas-
katchewan S7N5A8, Canada; 4 Research and Testing Center of Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
Abstract: Superoxide Dismutase (SOD) is a key enzyme eliminating reactive oxygen species (ROS), and the copper and zinc
superoxide dismutase (Cu/Zn-SOD) is the most important active oxygen scavenger in SOD family, which can improve plant tole-
rance to environmental stresses. The cDNA of Brassica campestris L. cultivar Longyou 7 was cloned by RT-PCR, using the
primers designed according to the published crucifer Cu/Zn-SOD cDNA sequences. The sequence of Cu/Zn-SOD from B. campes-
tris L. was 459 bp, encoding a predicted protein of 152 amino acid residues. Bioinformatics analysis showed that amino sequence
similarity with Brassica napus was 99%, and the predicted Cu/Zn-SOD protein was a hydrophilic protein without signal-peptide
as well as transmembrane region. It contained specific sequence characteristics and conserved domain of copper and zinc su-
peroxide dismutase (Cu/Zn-SOD) superfamily. The expression analysis of Cu/Zn-SOD gene using semi-quantitative RT-PCR and
results of SOD activity in response to lower temperature showed that the Cu/Zn-SOD was a differential expressed gene induced
by lower temperature. Results of separating low-temperature-induced proteins from Brassica campestris L. cultivar Longyou 6 by
SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and mass spectrometry further showed that Cu/Zn-SOD was a stress-
responsed gene, whose expression was induced by lower temperature.
第 4期 曾秀存等: 白菜型冬油菜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及其在低温条件下的表达 637


Keywords: Winter rape (Brassica compestris L.); Cu/Zn-SOD gene cloning; Lower temperature; Expression analysis; Ac-
tivity of SOD; Low-temperature-induced protein
白菜型冬油菜是西北寒旱区主要的油料作物和
生态作物[1-2]。但该地区冬季寒冷干燥, 极端低温天
气频发, 冬油菜在整个生育期都经历低温环境, 极
易遭受低温冻害而使细胞内大量超氧阴离子自由基
(O2–)积累, 引起细胞代谢异常及生物膜结构和功能
损坏 , 致使油菜不能安全越冬。超氧化物歧化酶
(superoxide dismutase, SOD)作为一种氧自由基的清
除剂, 能够催化植物体内超氧阴离子自由基的歧化
反应, 降低自由基的毒害, 维持细胞膜结构和功能
的稳定性[3-4], 增强植物的抗逆性[5-6]。SOD是普遍存
在于植物体内的一类金属酶类, 根据酶活性中心辅
基结合金属离子的不同, 可分为 Fe-SOD、Mn-SOD
和 Cu/Zn-SOD三种类型[7], 其中 Cu/Zn-SOD在活性
氧清除的酶系中尤为重要, 与植物的抗旱、抗寒、
耐盐碱等多种抗逆性关系密切[8-10]。转基因烟草研究
发现, Cu/Zn-SOD 的过量表达可减轻水分胁迫对植
株的伤害[11]。迄今, 已从棉花[12]、水稻[13]、玉米[14]
等作物中克隆出 Cu/Zn-SOD 基因, 但关于白菜型冬
油菜的 Cu/Zn-SOD基因的克隆、生物信息学分析以
及低温胁迫下的表达模式未见全面的报道。SOD是
典型的诱导酶, 在逆境条件下, 能诱导植物 SOD基
因的表达来提高植物对环境胁迫的抵抗能力[15]。本
研究探讨 SOD 酶蛋白家族 Cu/Zn-SOD 基因在超强
抗寒冬油菜中的表达情况及其在低温胁迫下的作用
并分析该低温诱导蛋白的种类及其表达, 旨在进一
步确定 Cu/Zn-SOD 基因的抗寒功能, 为利用转基因
技术选育抗寒冬油菜新品种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以 超 强 抗 寒 白 菜 型 冬 油 菜 品 种 (Brassica
campestris L.)陇油7号和陇油6号作为试材, 选取饱
满、大小一致的种子, 以自来水浸泡30 min后, 播于
装有育苗基质的营养钵(上口尺寸10 cm, 下口尺寸
7 cm, 高10 cm)培养6周左右。培养条件为温度25℃/
20℃(昼/夜)、光周期10 h/14 h (光/暗), 光照强度
100 μmol m–2 s–1。
1.2 总 RNA的提取及反转录
以生长良好的陇油7号植株幼嫩叶片 , 参照
TRI zo l试剂说明书提取总R N A , 电泳检测后按
M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒(BS249)说明反转
录, 得到单链cDNA, 置–20℃冰箱保存备用。
1.3 引物设计与 Cu/Zn-SOD基因克隆
以 GenBank 数据库中查到的十字花科植物
Cu/Zn-SOD 基因编码区的序列为模板, 利用 Primer
Premier 5.0 软件设计一对简并引物 CZSD-F:
5-ATGG(C/G)CAAGGGAGTTGCAGTTT-3和 CZSD-
R: CTTAGCCNTGAAGACCAATAAT(A/G)CC-3, 引
物按照十字花科编码区的首尾序列设计, 可扩增出
编码区的全序列。
以陇油 7 号幼苗叶片反转录 cDNA 为模板, 利
用简并引物 CZSD-F 和 CZSD-R 进行 RT-PCR 扩增,
扩增程序为, 94℃预变性 4 min; 94℃变性 40 s, 60℃
退火 40 s, 72℃延伸 1 min, 循环 35 次 ; 72℃延伸
10 min, 4℃保存; 扩增产物经 2% (w/v)琼脂糖凝胶
电泳检测后, 用普通琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂
盒(生工 SK1141)进行目的条带回收, 连入 pUCm-T
载体, 反应体系为模板 2 μL, pUCm-T Vector 1 μL,
10倍的 T4 DNA连接液 1 μL, T4 DNA连接酶 1 μL。
16~23℃连接 1~2 h, 连接后的质粒转化大肠杆菌
trans1-T1 感受态细胞, 37℃过夜培养, 蓝白斑筛选
后挑白斑进行菌液培养, 菌液 PCR 检测为阳性克隆
后, 送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
1.4 Cu/Zn-SOD预测蛋白的生物信息学分析
利用Blast软件从GenBank中挑选甘蓝型油菜(登
录号为AAY40317.1)、大白菜(登录号为Aac25568.1)、
萝卜 (登录号为AAD05576.1)、拟南芥 (登录号为
ABN50366.1)、琴叶拟南芥(登录号为XP002889716.1)
和芥菜(登录号为AAN60796.1) 6个十字花科植物的
Cu/Zn-SOD基因编码的氨基酸序列 , 利用DNAStar
软件将其与白菜型冬油菜Cu/Zn-SOD的氨基酸序列
进行多序列比对, 并通过MEGA 4.0软件构建系统发
生树。
利用 P r o t p a r a m 软件进行理化性质分析
(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html); 利用
TMHMM 软件(http://genome.cbs.dtu.dk/services/
TMHMM/)进行蛋白质跨膜区段的预测分析; 利用
SignalP 软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)
预测 N-末端信号肽序列; 利用 ScanProsite 服务器
(http://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/)对蛋白功能
638 作 物 学 报 第 40卷

位点进行预测。利用 NCBI在线 CDS进行结构域预
测分析 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/);
利用 ExPASy 工具中的 SOPMA 软件进行蛋白质二
级结构预测。
1.5 白菜型冬油菜 Cu/Zn-SOD 基因在低温胁迫
下的表达量
选取生长良好的陇油 7 号植株进行低温胁迫处
理, 先于 4℃培养 8 d, 继而转入–4℃超低温培养箱
培养 3 d, 最后于–8℃继续培养 3 d, 每一低温处理
完毕, 取其叶片和根冷冻保存备用, 以未低温处理
的植株为对照(CK)。提取处理及对照(CK)叶片和根
总 RNA, 并反转录成 cDNA, 测定 cDNA 浓度使其
浓度一致, 作为半定量 RT-PCR的模板。根据陇油 7
号 Cu/Zn-SOD基因的 cDNA序列设计半定量表达引
物 CZS-R: 5-TGAAACCTGGTGGGTGAG-3 和
CZS-F: 5-AGTGATTGTGAAGGTGGC-3。以浓度一
致的陇油 7号叶片和根的 cDNA (不同低温处理以及
未低温处理)为模板, β-actin 基因(正向引物 Act-F:
5-CACTTCTCCTCCTTCTTTGG-3; 反 向 引 物
Act-R: 5-GTAGGCATCCTTCTGGTTCA-3)为内参 ,
进行半定量RT-PCR, 同机分管扩增内参基因和目的
基因, 电泳检测 Cu/Zn-SOD 基因对低温胁迫的响应
模式。PCR扩增程序同上, 退火温度为 51℃。
1.6 低温诱导蛋白的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳
(SDS-PAGE)及质谱分析
选取生长良好的陇油 6号幼苗, 于 4℃连续低温
胁迫 25 d, 每 5 d取一次样, 待胁迫 25 d后, 将幼苗
置常温恢复生长 10 d, 并取样。低温胁迫以及室温
恢复生长的叶片用于蛋白质的提取, 以未经低温处
理的陇油 6号幼苗为对照(CK)。参考 Perras等[16]的
方法提取低温诱导蛋白质, 并将所提取的蛋白质进
行 SDS-PAGE分析。
SDS-PAGE 电泳结束后, 参照 Hon 等[17]的方法
回收、纯化蛋白质条带。先用冷 ddH2O冲洗凝胶, 并
用 0.1% (w/v)考马斯亮蓝 R-250 染色以及在脱色液
(45%甲醇+45%双蒸水+10%乙醇)中脱色后, 将所选
择的胶带用切胶笔切下相应位置的凝胶并粉碎后放
入透析袋, 加入 5倍体积的洗脱液(25 mmol L–1 Tris,
pH 8.3, 192 mmol L–1 Gly, 0.1% SDS), 在 100 mA恒
流电泳至凝胶无色, 13 160 × g离心 30 min弃沉淀,
将上清液过滤冻干。
将回收样品送生工生物工程(上海)股份有限公
司进行蛋白质串联质谱(LC-MS/MS)分析。
1.7 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定
2010年 8月 20日, 将陇油 7号播种于甘肃农业
大学油菜试验基地, 待油菜生长至五叶期, 依据气
温的变化取样, 时间分别为 2010 年 10 月 8 日(气温
14~20℃)、2010 年 10 月 17 日(气温 8~17℃)、2010
年 10月 31日(气温–2~12℃)、2010年 11月 15日(气
温–10~ –4℃)以及 2011 年 1 月 18 日(气温–20~
–8℃)。采用氮蓝四唑(NBT)光还原法[18]测定 SOD酶
活性。
2 结果与分析
2.1 Cu/Zn-SOD基因克隆和序列分析
以陇油 7 号 cDNA 为模板 , 利用简并引物
CZSD-F和 CZSD-R进行 RT-PCR扩增, 扩增产物经
2.0% (w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测得到约 460 bp片
段, 与目标条带大小基本一致(图 1)。回收纯化该片
段, 连接到 pUCm-T载体上, 转化大肠杆菌, 筛选重
组子后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序得
到碱基序列, 全长为 459 bp, 与其他十字花科基因
组数据库 Cu/Zn-SOD基因编码区序列具有很高的同
源性(与甘蓝型油菜和大白菜具有 99 %的同源性),
起始密码子为 ATG, 终止密码子为 TAA, 证明已成
功获得目的基因, 并利用 DNAStar 软件将该序列翻
译, 共编码 152个氨基酸(图 2)。
2.2 Cu/Zn-SOD基因编码蛋白质的特性分析
白菜型油菜 Cu/Zn-SOD基因预测蛋白质的相对
分子质量为 15.18 kD, 理论等电点为 5.64。该蛋白
由 20 种氨基酸组成, 以 Gly 和 Thr 所占比例最高,
分别为 19.1%和 10.5%, 酸性氨基酸(D、E)占 9.9%,
碱性氨基酸(K、R)占 5.9 %, 疏水氨基酸(A、I、L、
F、W、V)占 30.3%, 极性氨基酸(N、C、Q、S、T、
Y)占 23.7%, 带电荷的氨基酸(R、K、H、Y、C、D、
E)占 22.4%, 蛋白质不稳定指数(instability index)为

图 1 白菜型油菜 Cu/Zn-SOD基因的 RT-PCR结果
Fig. 1 RT-PCR results of Cu/Zn-SOD gene in winter turnip rape
M: DL2000 marker; 1: Cu/Zn-SOD基因扩增结果。
M: DL2000 marker; 1: PCR result of Cu/Zn-SOD gene amplification.
第 4期 曾秀存等: 白菜型冬油菜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及其在低温条件下的表达 639



图 2 Cu/Zn-SOD基因的编码区核酸序列及推导氨基酸序列
Fig. 2 Nucleotide sequence of Cu/Zn-SOD gene and its deduced
amino acid sequence
方框为起始密码子 ATG; *为终止密码子 TAA。
ATG is indicated in box; TAA is marked by asterisk.

17.51, 是一个稳定蛋白(稳定系数>40时不稳定); 总
平均疏水指数 (grand average of hydropathicity,
GRAVY)为–0.171, 为水溶性蛋白。利用在线工具
TMHMM和 SignalP 3.0分析 Cu/Zn-SOD蛋白, 结果
表明该蛋白 N 端不含信号序列, 无跨膜结构域, 因
此推测该酶蛋白是位于细胞基质中的非分泌蛋白。
用在线工具 SOPMA对 Cu/Zn-SOD蛋白的二级
结构预测显示 , 该蛋白包含 50.66%无规则卷曲
(random coil)、35.53%延伸链(extended strand)、9.21%
β-转角(beta turn)和 4.61% α-螺旋(alpha helix)。
应用 NCBI CCD 数据库对 Cu/Zn-SOD 蛋白保
守序列预测发现, 该蛋白含有 5个 Cu/Zn-SOD超家
族 (Cu-Zn superoxide dismutase superfamily) 保守
结构域。
2.3 白菜型油菜 Cu/Zn-SOD 超氧化物歧化酶的
氨基酸同源性和系统进化分析
白菜型冬油菜胞质 Cu/Zn-SOD与其他十字花科
植物酶蛋白相似性比较结果(图 3)显示, 该蛋白与甘
蓝型油菜(Brassica napus)的 Cu/Zn-SOD蛋白完全一
致, 与大白菜(Brassica rapa subsp. pekinensis)、琴叶
拟南芥 (Arabidopsis lyrata)、拟南芥 (Arabidopsis
thaliana)、萝卜(Raphanus sativus)和芥菜(B. juncea)
的同源蛋白也具有较高的相似性, 达到 91%~99%。
进一步分析 Cu/Zn-SOD 蛋白亲缘关系(图 4)表
明 , 白菜型油菜 (Longyou 7)与其他十字花科植物
SOD酶蛋白的系统进化关系可以大致分为 4类。白
菜型油菜(Longyou 7)、甘蓝型油菜(Brassica napus)
和大白菜(B. rapa subsp. pekinensis)为同一亚族, 属
于芸薹属; 拟南芥(Arabidopsis thaliana)和琴叶拟南
芥 (Arabidopsis lyrata)同属于鼠耳芥属 ; 萝卜
(Raphanus sativus)和芥菜(B. juncea)各自单独为一类,
分别为萝卜属和芸薹属。可见 Cu/Zn-SOD在系统进
化关系具有一定的属性特征。
2.4 低温胁迫下 Cu/Zn-SOD基因的表达
通过对 Cu/Zn-SOD基因半定量 RT-PCR分析(图 5)

图 3 白菜型冬油菜与其他植物的 Cu/Zn-SOD蛋白氨基酸的多重比较
Fig. 3 Sequence multi-alignment of the deduced Cu/Zn-SOD protein of winter rape with other species
640 作 物 学 报 第 40卷


图 4 陇油 7号 Cu/Zn-SOD蛋白与其他相关蛋白序列的系统进
化树分析
Fig. 4 Phylogenetic analysis of Longyou 7 Cu/Zn-SOD proteins
with other related proteins
发现, 低温胁迫下 Cu/Zn-SOD 在叶片和根中的表达
存在差异, 在最初 4℃低温处理下, 叶片和根部的表
达量均上调, 继续低温胁迫后, 叶片中 Cu/Zn-SOD
基因表达开始下调, 甚至低于对照(CK), 而根部的
表达量在–4℃时仍继续增强, 在–8℃表达减弱, 但
仍高于对照(CK), 由此说明 Cu/Zn-SOD 基因是低温
诱导条件下差异表达的基因, 根部 Cu/Zn-SOD 表达
量的增强有利于冬油菜越冬过程中对低温的抵御。

图 5 低温胁迫下白菜型冬油菜 Cu/Zn-SOD基因的半定量 RT-PCR分析
Fig. 5 Semi-quantitative RT-PCR analysis of Cu/Zn-SOD gene in winter turnip rape under low temperature

2.5 低温诱导蛋白的 SDS-PAGE分析
低温胁迫处理后, 陇油 6 号叶片的可溶性蛋白
SDS-PAGE分析结果(图 6)表明, 在 SDS-PAGE图谱
上有 4条带(D1、D2、D3、D4)随着低温胁迫时间的
延长表达量增加, 当解除胁迫常温恢复 10 d 后, 表
达量下降, 其中在相对分子质量为 15 kD左右的 D3
条带的变化很明显。为此将该条带回收, 并通过蛋
白串联质谱技术鉴定发现, D3条带与数据库中白菜
(Brassica rapa)铜 /锌超氧化物歧化酶 (编号为
gi|312837922)中 3 个肽段高度匹配(表 1), 离子分值
分别为 82、133和 157, 说明回收的蛋白质条带为白
菜型冬油菜铜/锌超氧化物歧化酶(单个离子分值大
于 44 说明具有广泛的同源), 也进一步说明铜/锌超
氧化物歧化酶与冬油菜的抗寒性关系密切。
2.6 低温胁迫下 SOD活性的变化
叶片和根部总 SOD活性的变化呈现先上升后下
降趋势(图 7), 在 10 月 31 日(气温–2~12℃), 叶片
SOD 活性最高, 为 10 月 8 日(气温 14~20℃)样品的
4.75 倍, 而根部酶活性达到最大值的时间较叶片推
迟, 在 11 月 15 日(气温–10~ –4℃)达到最大, 为 10
月 8 日(气温 14~20℃)的 3.06 倍。该结果与 Cu/Zn-
SOD基因表达变化规律一致, 说明在总 SOD中, 胞
质 Cu/Zn-SOD是起主要作用的同功酶。

图 6 叶片低温诱导蛋白 SDS-PAGE电泳图谱
Fig. 6 SDS-PAGE electrophoretogram of the low-temperature-
induced protein in leaf
M: 标准蛋白; 1: 对照; 2~6: 依次为低温处理 5、10、15、20和
25 d蛋白; 7: 常温恢复生长 10 d蛋白。
M: protein marker; 1: control; 2–6: SDS-PAGE of proteins from
low temperature for 5, 10, 15, 20, and 25 days, respectively;
7: protein from room temperature for 10 days.

表 1 蛋白质串联质谱(LC-MS/MS)的数据库搜索鉴定结果
Table 1 Result of searching protein database using peptide sequenced from LC-MS/MS
搜索条件 Searching condition 搜索结果 Searching results 蛋白质
条带
Protein
真实肽段
Ture peptide
物种
Species
匹配肽段
Match of fragment
离子分值
Score
蛋白质名称
Protein
物种
Species
序列号
No. of accession
得分
Score
KGGHELSLTTG
NAGGRL
KGGHELSLTTGNA
GGRL
82
RAFVVHELKDD
LGKG
RAFVVHELKDDL
GKG
133
D3
KGNSDVEGVVT
LTQDDSGPTKV
Brassica
campestris
KGNSDVEGVVTL
TQDDSGPTKV
157
copper/zinc
superoxide
dismutase
Brassica rapa gi|312837922 372
第 4期 曾秀存等: 白菜型冬油菜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及其在低温条件下的表达 641



图 7 低温胁迫下白菜型冬油菜 SOD活性的变化
Fig. 7 Effects of low temperature on SOD activity of winter rape

3 讨论
不同来源 Cu/Zn-SOD在氨基酸序列上具有较高
同源性, 结构上有高度的同一性[19]。本研究从白菜
型冬油菜中克隆了 Cu/Zn-SOD 基因的 cDNA 序列,
该序列拥有完整的阅读框(ORF), 预测编码蛋白无
信号肽和跨膜结构, 具有胞质 Cu/Zn-SOD 超家族特
有的保守结构区域, 这与所预期的胞质 Cu/Zn-SOD
一致, 显示所克隆基因序列的准确性。分析发现该
基因与十字花科的甘蓝型油菜、大白菜等氨基酸序列
具有极高的相似性, 具有 Cu2+结合位点以及二硫键
功能位点, 无规则卷曲和延伸链是该蛋白质二级结
构主要元件, 这些特征与其他植物 Cu/Zn-SOD 的序
列组成、结构及酶活性位点均有高度的相似性[20-21]。
生物体内 Cu/Zn-SOD是 3种超氧化物歧化酶中
分布最广、稳定性最高的同工酶, 其表达量与植物
抗逆性关系密切[22-23]。前人研究认为逆境胁迫初期
常引发 SOD 基因表达的快速上调, 提高植物对各种
逆境胁迫的抗性[24]。本研究中, 最初 4℃低温处理可
增强叶片和根中胞质 Cu/Zn-SOD 基因表达量, 随着
胁迫温度的继续降低以及胁迫时间的延长, 叶片中
该基因表达量下降甚至低于对照(CK)。其原因可能
是最初的降温导致冬油菜叶片内活性氧的大量积累,
为维持较高的抗寒力和正常的活性氧水平 ,
Cu/Zn-SOD 基因表达量上调, 而后由于继续零下低
温以及长时间的胁迫, 过量活性氧使叶片细胞结构
受到不可逆转的损伤, 抗寒能力下降, Cu/Zn-SOD表
达量急剧下降并低于对照(CK)。这符合实际生产中
冬油菜的生长表现(–2℃的低温使冬油菜地上部分
抗寒力开始下降 , –8℃时冬油菜进入枯叶期 )。
Cu/Zn-SOD 基因在植物不同组织特异性表达, 胡根
海等[12]研究发现, 胞质 Cu/Zn SOD基因在棉花根中
表达活性最高, 推测根可能是胞质 Cu/Zn-SOD 基因
的主要表达部位。李玉坤等[25]研究显示东方山羊豆
叶绿体 Cu/Zn-SOD基因在根中表达量最少。根是冬
油菜越冬最主要的器官 , 低温胁迫下 , 根部胞质
Cu/Zn-SOD 的表达量明显上调, 即使在–8℃的低温
下, 其表达量仍高于对照(CK), 可见 Cu/Zn-SOD 基
因是低温诱导条件下差异表达的基因, 其表达可减
轻或抵抗低温条件下产生的活性氧对根部伤害, 有
利于冬油菜安全越冬。已知逆境胁迫可诱发细胞内
活性氧浓度的增加而导致氧化胁迫, 所以植物抗逆性
的形成常常与抗氧化系统活性的增强关系密切[26-29]。
本研究中, 叶片和根部 SOD酶活性在低温条件下均
高于常温条件下, 表明 SOD在适应低温过程中起一
定作用。
植物低温诱导蛋白是植物在低温作用下由于基
因表达的改变而诱发合成的蛋白质[30]。关于棉花与
低温诱导关系研究发现, 低温锻炼期间, 植物细胞
内可溶性蛋白质和抗(冷)冻性之间呈现明显的正相
关, 即可溶性蛋白质含量随低温锻炼过程中抗(冷)
冻性的提高而增加[31]。本研究结果表明, 在 4℃的连
续低温胁迫下, 相对分子质量为 15 kD 处(D3)有一
条蛋白带的表达量受低温诱导, 并随胁迫时间的延
长而逐步增加, 当解除胁迫后又下降, 说明该蛋白
在增加冬油菜抗寒性方面有重要的作用。为了进一
步了解该蛋白的性质和类型, 对其进行回收并通过
蛋白串联质谱技术做鉴定, 结果显示该蛋白很可能
为铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD), 由此进一步
证实 Cu/Zn-SOD 为抗逆基因 [32], 其表达受低温诱
导 [33-34]。已有的研究认为活性氧活性的抑制和活性
氧的清除是保护植物细胞膜系统, 提高植物抗逆性
的有效途径[35], 因此 Cu/Zn-SOD的抗寒机制可能一
方面是作为活性氧的清除剂, 保护植物在逆境条件
下细胞膜系统免受损伤, 另一方面 Cu/Zn-SOD 为亲
水性胶体, 其表达量的增加有助于增强细胞的保水
力 , 从而提高细胞中束缚水的比例 , 降低冰点 , 增
强植物的抗寒性。
4 结论
从超强抗寒白菜型冬油菜中获得了一个长度为
459 bp Cu/Zn-SOD 基因的 cDNA 序列, 该序列编码
152个氨基酸残基的蛋白质, 在进化上十分保守, 具有
胞质 Cu/Zn-SOD 超家族特有的序列特征和保守结构
区域。在总 SOD 中胞质 Cu/Zn-SOD 是起主要作用的
同功酶。Cu/Zn-SOD是受低温诱导表达的抗逆基因。
642 作 物 学 报 第 40卷

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