全 文 ：2009年 12月
2009, 31(4):527 -530
中国油料作物学报
Chinesejournalofoilcropsciences
芸薹属远缘杂交试管苗快繁培养基的优化
梅家琴 ,李加纳 ,李勤菲 ,任自力 ,史佩娟 ,殷家明 ,刘列钊 ,徐新福 ,钱　伟＊
(西南大学农学与生物科技学院 , 重庆市油菜工程技术研究中心 ,重庆 400716)
　　摘要:为了优化芸薹属远缘杂交试管苗的快繁培养基 , 探讨基因型 、培养时间等因素对试管苗分化率的影响 ,
实验对甘蓝型油菜与甘蓝以及白菜型油菜与甘蓝两种远缘杂交方式的试管苗 , 在 10种添加了不同浓度的 6-BA
和 NAA的培养基上进行快繁培养。采用 SAS软件对培养后第 20d和第 30d的分化率进行分析处理 , 结果如下:
(1)白菜型油菜与甘蓝 5个杂交组合间 , 以及白菜型油菜与甘蓝 、甘蓝型油菜与甘蓝两种杂交类型间的试管苗分化
率无显著差异;除甘蓝型油菜与甘蓝杂交的试管苗在培养第 30d时的分化率无显著差异外 , 其它情况下培养基间
的诱导分化率差异均达到显著或极显著水平;(2)添加 3.0mg· L-1 6-BA(6-苄基嘌呤)和 0.2mg· L-1NAA(萘
乙酸)的 MS培养基对试管苗的诱导分化效率显著或极显著高于其它快繁培养基;(3)不同培养基培养的试管苗在
培养 20d和 30d时的分化率呈高度正相关 , 但前 20d的日平均分化率显著高于 20 ～ 30d的日平均分化率。
关键词:白菜型油菜;甘蓝;甘蓝型油菜;快繁;培养基优化;远缘杂交
中图分类号:S565.403　　文献标识码:A　　文章编号:1007-9084(2009)04-0527-04
MediumoptimizationforrapidpropagationofBrasicainterspecifichybrids
MEIJia-qin, LIJia-na, LIQin-fei, RENZi-li, SHIPei-juan,
YINJia-ming, LIULie-zhao, XUXin-fu, QIANWei＊
(AgronomyandBiotechnologyColegeofSouthwestUniversity, ChongqingEngineering
ResearchCenterforRapeseed, Chongqing400716, China)
Abstract:ThestudywasconductedtooptimizemediumofrapidpropagationofBrasicainterspecifichybrids
andtoestimatetheefectsofgenotypeandculturetimeondiferentiationeficiency.Tubeplantletsfromtwotypesof
interspecifichybrids, Brassicarapa×BrasicaoleraceaandBrasicanapus×B.oleracea, wereinvestigatedaftercul-
turedfor20dand30din10mediawithdiferentconcentrationof6-BAandNAA.Thediferentiationeficiencyda-
tawasanalyzedusingSASprogram.Theresultsshowedthatnosignificantdiferencewasfoundamong5interspecif-
iccombinationsbetweenB.rapaandB.oleracea, aswelasbetween2 typesofinterspecifichybridsofB.rapa×B.
oleraceaandB.napus×B.oleracea.Butsignificantdiferencewasdetectedindiferentmedia, exceptforB.napus×
B.oleraceaculturedafter30d.TheoptimumMSmediumwith3.0mg· L-1 6-BAand0.2mg· L-1NAAwasfound
intermsofthehighdiferentiationeficiency.Therewasasignificantlyhigherpositivecorelationofdiferentiation
eficiencybetweenplantletscultured20dand30d, althoughthediferentiationeficiencyperdaywassignificantly
higherduringthefirst20days.
Keywords:Brasicarapa;Brasicaoleracea;Brasicanapus;Rapidpropagation;Mediumoptimization;Inter-
specifichybridization
收稿日期:2009-06-10
基金项目:农业部 948项目(2006-G04);重庆市自然科学基金(CTSC2007BB1362);西南大学博士基金(FWUB2007004)
作者简介:梅家琴(1982-),女 ,四川彭州人 ,博士研究生 ,作物分子育种方向。 Tel:02368250701, E-ail:jiaqinmay@163.com
＊通讯作者:钱　伟(1973-),男,湖北天门人 ,教授 ,博士 ,植物分子育种方向。E-ail:qianwei666@hotmail.com
　　甘蓝型油菜(Brassicanapus, AACC)是一种重
要的油料作物 ,它是由白菜型油菜 (Brasicarapa,
AA)和甘蓝(Brassicaoleracea, CC)自然杂交 ,染色体
加倍进化而来的异源四倍体 [ 1] 。甘蓝型油菜被用
作栽培种的历史很短 ,与两个亲本种相比 ,其遗传基
础相当狭窄 ,加之优质甘蓝型油菜的日益推广逐渐
替代地方品种的种植 ,使得现有甘蓝型油菜的遗传
基础存在被侵蚀的可能。而甘蓝和白菜型油菜作为
甘蓝型油菜的亲本物种 ,具有丰富的遗传变异 [ 2] 。
通过利用甘蓝与白菜型油菜杂交人工合成甘蓝型油
菜 ,或亲本种与甘蓝型油菜杂交等途径 ,可将亲本种
遗传成分导入到甘蓝型油菜中 ,拓宽甘蓝型油菜的
遗传基础[ 3] ,并向其转移优良性状 [ 4] 。白菜型油菜
与甘蓝型油菜间的杂交容易成功 ,不需要采取特殊
手段即可获得远缘杂交后代 ,但是甘蓝与白菜型油
菜间 ,以及甘蓝与甘蓝型油菜间的杂交亲和性低 ,往
往需要通过胚挽救才能获得杂种。
自 Nishi等[ 5]首次应用胚挽救技术获得芸薹属
种间杂交后代后 ,很多学者相继对影响该技术的因
素进行了研究 ,比如基因型[ 6] 、培养基成分 [ 7] 、外植
体取材时间 [ 7, 8]等。但前人研究主要集中于对影响
胚挽救效率的因素进行探索 ,而对芸薹属远缘杂交
试管苗的快速繁殖体系的研究却鲜有报道 。部分芸
薹属物种间的远缘杂交比较困难 ,利用胚挽救技术
可在一定程度上提高杂交成功率 ,但如果研究对杂
种后代群体的需求量较大 ,或者要确保试管苗的移
栽成活率 ,则需结合有效的试管苗扩繁技术以满足
研究需要。本研究对白菜型油菜与甘蓝间 、甘蓝型
油菜与甘蓝间的两种远缘杂种的试管苗在不同激素
(6-苄基嘌呤和萘乙酸)浓度配比的 MS培养基上
培养 20d和 30d的分化率进行统计与分析和优化 ,
期望找到一种高效的 、适用于芸薹属种间杂交试管
苗快繁的培养基 。同时 ,本研究探讨了基因型 、培养
时间对远缘杂交试管苗分化率的影响 ,研究结果对
于完善芸薹属远缘杂交技术体系有重要意义 。
1　材料和方法
1.1　实验材料
研究采用的亲本材料由重庆市油菜工程技术研
究中心提供 , 包括甘蓝 (羽衣甘蓝 O31、 O62和
O104,花椰菜 O1和 O2,结球甘蓝 O4),白菜型油菜
(R702、R732和 R733)和甘蓝型油菜(N18)。所有
材料均为连续剥蕾自交或套袋自交多代的纯系。
1.2　实验方法
1.2.1　芸薹属远缘杂交试管苗的获得　2007年春
在重庆市油菜工程技术研究中心 ,采用人工去雄授
粉 ,组配了两种类型的远缘杂交组合(表 1)。第一
种远缘杂交类型为白菜型油菜与甘蓝间的杂交 ,有
5种杂交组合:O104×R702(组合 1), R733 ×O62
(组合 2), R732×O1(组合 3), R732×O2(组合 4)
和 R732×O4(组合 5);第二种远缘杂交类型为甘蓝
型油菜与甘蓝间的杂交即 N18 ×O31。授粉后第
10d,摘取杂交子房进行离体无菌培养(培养基成分
为 MS+1.0 mg· L-1 6-BA(6-苄基嘌呤)+0.2
mg· L-1 NAA(萘乙酸)+300mg· L-1CH(水解酪
蛋白)+3%蔗糖 +0.7%琼脂)。培养 25d后剥离
子房收获种子 ,并将其接种于 MS基本培养基上萌
发。待种子萌发后 ,切取幼苗茎尖接种到普通油菜
试管苗扩繁培养基上 (成分为 MS+3.0 mg· L-1
6-BA+0.2mg· L-1 NAA+3%蔗糖 +0.7%琼
脂[ 8, 9] )行预扩繁培养。
表 1　芸薹属远缘杂交试管苗的获得
Table1　DevelopmentofBrassicainterspecifichybrids
组合
Combination
甘蓝型油菜 ×甘蓝
B.napus×B.oleracea
白菜型油菜 ×蓝 B.rapa×B.oleracea
1＊ 2 3 4 5 总数 Total
授粉花蕾数 Budspolinated 1 498 66 212 217 603 76 1 174
收获子房数 Embryosobtained 455 6 89 78 108 57 338
收获种子数 Seedsharvested 52 2 2 8 10 10 32
萌发幼苗数 Seedlingsgerminated 20 2 1 6 5 1 15
预扩繁获苗数 Plantletsafterpre-propagation 72 8 6 13 8 2 37
　　＊甘蓝作母本 ,白菜型油菜作父本 ＊B.oleracea×B.rapa
1.2.2　远缘杂交试管苗的扩繁　预扩繁培养 25d
后 ,切取分化的幼芽 ,并分别接种于 10种添加了不
同浓度的 6-BA和 NAA的快繁培养基中进行扩繁
(表 2)。继代后第 30d,按组合收集分化出的幼芽 ,
混合后随机继代到上述培养基中再次扩繁 ,作为重
复 。两次扩繁均于继代第 20d和第 30d统计幼芽分
化数。
所有扩繁培养基均以 MS为基本培养基 ,添加
3%蔗糖 , pH5.8;培养条件为:温度 25 ℃, 光照
16 h· d-1 ,光照强度 2 000 lx;培养瓶底面直径 7.5
cm,每瓶装 25mL培养基 ,接种 4棵外植体。
1.3　数据分析
培养基的分化率为:
分化率(%)=幼芽分化数 /继代芽数 ×100
各培养基扩繁效率的方差分析和相关分析分别
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采用 SAS[ 10]的 GLM和 CORR程序进行 ,多重比较 采用 Duncan新复极差测验进行。
表 2　芸薹属远缘杂交试管苗在不同快繁培养基中的分化率
Table2　DifferentiationefficiencyoftubeplantletfromBrassicainterspecifichybridson10 media
培养基
Medium
激素
Hormone
分化率(%)/分化数
Diferentiationeficiency(%)/ No.ofdiferentiationplantlets
甘蓝型油菜 ×甘蓝
B.napus×B.oleracea
白菜型油菜 ×甘蓝
B.rapa×B.oleracea
平均值
Mean
6-BA(mg· L-1)NAA(mg· L-1) 20d 30d 20d 30d 20d 30d
1 0 0 127.8/33 144.4/36 102.1 /13 95.9 /12 114.9c＊ 120.2c
2 4 0.1 231.0/69 259.5/79 227.8 /33 250.0 /37 229.4ab 254.8b
3 4 0.2 224.2/64 265.8/76 191.7 /29 206.7 /32 207.9b 236.2b
4 4 0 223.5/56 245.0/59 204.2 /14 254.2 /17 213.4b 249.6b
5 3 0.1 235.7/71 302.4/91 267.3 /48 325.5 /56 251.5ab 313.9ab
6 3 0.2 307.6/88 397.0/111 265.0 /44 362.5 /56 286.3a 379.8a
7 3 0 194.6/63 267.5/81 246.7 /28 281.7 /32 220.7b 274.6b
8 2 0.1 244.8/69 283.3/83 250.0 /20 275.0 /22 247.4ab 279.2b
9 2 0.2 260.0/62 325.3/77 240.0 /21 250.0 /22 250.0ab 287.7b
10 2 0 250.9/61 319.2/79 250.0 /25 282.2 /27 250.5ab 300.7ab
　　＊Duncan多重比较 , 0.05显著水平＊ Duncanmultiplecomparison, significantdiferenceat0.05level
2　结果与分析
2.1　芸薹属远缘杂交试管苗的获得
2007年春进行芸薹属远缘杂交配组(表 1)。
在白菜型油菜与甘蓝杂交组合中 ,共授粉 1 174个
花蕾 ,收获 338枚杂交子房 ,剥离出 32粒种子 ,经
MS培养基萌发得到 15棵幼苗 。尽管不同杂交组合
间杂交亲和性有差异 ,但白菜型油菜和甘蓝母本均
得到了杂交后代。在甘蓝型油菜 ×甘蓝中 ,授粉
1 498个花蕾 ,收获 455枚杂交子房 ,剥离出 52粒种
子 ,经 MS培养基萌发得到 20棵幼苗 。该结果表明
甘蓝为父本与甘蓝型油菜和白菜型油菜的亲和性都
很低。
鉴于萌发出的幼苗数量有限 ,难以直接用于扩
繁培养基的筛选 ,因此我们对获得的幼苗进行了预
扩繁。通过 25d预扩繁培养 ,获得了 72株甘蓝型油
菜 ×甘蓝杂种试管苗 , 37株白菜型油菜与甘蓝间的
杂种试管苗(表 1)。
2.2　芸薹属试管苗扩繁培养基优化
将远缘杂交试管苗分别接种于 10种快繁培养
基中培养到第 20d和第 30d时 ,分别统计分化芽数 ,
计算两次重复的平均分化率(表 2)。对于来自甘蓝
型油菜 ×甘蓝和白菜型油菜 ×甘蓝杂种(含反交组
合 ,组合 1)的试管苗 ,添加激素的培养基其诱导分
化效率均显著(P<0.05)高于无激素培养基(第 1
号培养基 ,表 2),其中添加了 3.0mg· L-1 6-BA和
0.2mg· L-1NAA的第 6号培养基对试管苗的诱导
分化效果最好 ,接种 20d后平均每苗分化出 2.9个
幼芽 ,诱导分化率为 286.3%;30d后平均每苗分化
出 3.8个幼芽 ,诱导分化率达 379.8%。多重比较结
果亦表明该培养基为扩繁培养的最优培养基(表 2)。
2.3　基因型对芸薹属远缘杂交试管苗分化率的影响
方差分析结果显示除甘蓝型油菜 ×甘蓝杂种试
管苗培养 30d时培养基间的诱导分化率没有显著差
异外 ,其它情况下不同培养基对试管苗的诱导分化
率间差异均达到显著(P<0.05)或极显著水平(P<
0.01)(表 3)。
表 3　芸薹属远缘杂交试管苗在不同快繁培养基中培养
第 20d和第 30d时的分化率方差分析
Table3　ANOVAofdifferentiationefficiencyafterculture
for20dand30don10 mediaforBrassica
interspecifichybrids
变异来源
Source
自由度
Df
均方 MeanSquares
20d 30d
B.rapa×B.oleracea
组合 Combination 4 5815.5 15 293.6
培养基 Medium 9 21 319.6＊ 42 075.5＊＊
B.napus×B.oleracea
培养基 Medium 9 4 306.7＊ 8481.9
远缘杂交
Interspecifichybridization
杂交方式 Cross 1 307.6 5 112.3
培养基 Medium 9 8 332.8＊＊ 17 591.0＊＊
　　＊和＊＊:在 0.05和 0.01水平显著差异。
　　＊and＊＊:Significantdiferenceat0.05and0.01respectively.
　　根据表 1 ,白菜型油菜与甘蓝的正 、反交之间 ,
不同基因型配组间存在杂交亲和性的差异 ,但表 3
显示 ,试管苗的分化率在杂交方式间以及基因型间
均无显著差异(P<0.05),表明基因型以及杂交方
式间的差异对芸薹属远缘杂交试管苗的扩繁效率没
有显著影响。
2.4　继代时间对芸薹属远缘杂交试管苗分化效率
的影响
试管苗在培养第 20d和第 30d时的分化率具有
529梅家琴等:芸薹属远缘杂交试管苗快繁培养基的优化
极显著的相关性 ,其相关系数为 0.94(P<0.01)。
但是培养 20d的日平均分化率和随后进行连续培养
10d的日平均分化率间有极显著差异:培养 20d时 ,
日平均分化率为 11.1%;培养 20 ～ 30d时 ,其日平
均分化率下降为 4.2%。此结果表明继代时间的长
短可能是影响芸薹属远缘杂交试管苗扩繁效率的一
个重要因素 。
3　讨论
本研究发现添加了一定量的 6-BA和 NAA的
MS培养基 ,能诱导芸薹属远缘杂交试管苗的分化 ,
其中添加 3.0mg· L-1 6-BA和 0.2mg·L-1NAA的
MS培养基对材料的诱导分化效率最高 ,但同时也观
测到未添加任何激素的培养基(第 1号培养基)也
具有一定的分化效果:培养 20d和 30d后的平均芽
数为 1.1和 1.2个(表 2)。笔者认为 ,出现该现象
的可能原因是 ,在进行预培养或第一次重复培养时 ,
试管苗从培养基中吸收了一定量的外源激素并在体
内积累 ,或者前期的培养引起了试管苗内源激素的
变化。肖关丽等 [ 29]在甘蔗激素调控的研究中 ,也有
类似报道。该现象对培养基分化率的研究造成了一
定的干扰 ,但是这种干扰并未构成显著影响 ,第 1号
培养基的分化率显著低于其它添加激素的培养基。
继代时间长短对芸薹属远缘杂交试管苗的扩繁
效率有较大影响 。本研究结果显示 ,在进行试管苗
扩繁中 ,分化率在培养 20d时比培养 20 ～ 30d时好 。
可能的原因是 ,在分化培养的早期 ,试管苗能够从培
养基中吸收足够的激素量来保持较高的分化率 ,而
在随后的 10d里 ,培养基中剩余的激素量已不足以
维持试管苗保持前期较高的分化率。
亲本的基因型是影响芸薹属远缘杂交成功率的
重要因素 ,如影响杂交亲和性 [ 11]和胚挽救效率 [ 6] 。
而本研究结果表明 ,芸薹属远缘杂交试管苗扩繁效
率不受杂交方式以及杂交组合基因型的显著影响 。
我们推测 ,芸薹属远缘杂交早期杂种胚的发育受基
因型差异的影响 ,而试管苗的扩繁效率受基因型差
异的影响并不明显。
4　结论
芸薹属远缘杂交试管苗的扩繁效率 ,不受杂交
方式以及杂交组合基因型的显著影响;添加了 3.0
mg· L-16-BA和 0.2mg· L-1NAA的 MS培养基 ,
对芸薹属远缘杂交试管苗的诱导分化效率最高 ,为
最优快繁培养基;继代时间长短对芸薹属远缘杂交
试管苗扩繁效率有较大影响 。
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