全 文 ：武汉植物学研究 , ! ∀# ∃ % 一 &
∋ ( ) ∗+ , # (− . ) /, + 0 ( 1, + 23, # 4 35 3, ∗6 /
栽培稻与 7 种野生稻的原生质体融合 ’
何 光存 0 #, 3 8 /, ## 9 : ; , < 3 = > : 4 :
∀武汉大学生命科学学 院
武汉 7 ? ≅ ≅ & Α ∃
∀英国诺丁汉大学生 命科学 系 9 ( 1 1 2+ Β / , + #
9 Χ & Δ 4 ; Ε Φ ∃
提 要 野 生稻具有许多优 良性状 , 是水稻遗 传改 良的重 要物质基础 。 为了探讨应用原生质
体融合技术转移野 生稻有利基 因的途径 , 进行了栽培 稻与 7 种野 生稻融合试验 。 总计 !: Α 义
≅ & 个野生稻原生质体与栽培 稻原生质休进行了电激融合 。 获得了 7 ?! 7 块愈伤组织 , 再生 了
7 。个植株 。 试验了 了射线处理野生稻原生质体的有效剂量和碘代乙酞胺抑制栽培稻原生质
体生长的浓度 。 探讨了原生质体来源对融合效果的影响 , 讨论了融合亲和性问题 。
关键词 栽培稻 , 野生稻 , 原生质体 , 融合
稻属 中有 Α≅ 个野生种 。深入研究野生稻 , 可以从理论上探索栽培稻的起源 、演变和分
化 。野生稻具有丰富的核和质的遗传多样性以及栽培稻所没有的许多优 良特性 , 是培育抗
病高产的水稻新品种和新组合所必不可少的种质资源库 〔’· Α〕。野生稻的抗性经过长期的 自
然选择具有进化上的稳定性 。
目前 , 有 + 种野生稻的染色体组型已被确定〔? 〕 。 染色体组型不同的种间进行有性杂
交时存在着杂交不实和杂种后代不育等生殖障碍 , 致使一些重要野生稻的有利基因难以
转移和利用 。藉于原生质体融合的体细胞杂交是克服有性杂交障碍 , 转移异种异属遗传基
因的有效技术 , 在遗传学研究和作物品种改 良中具有重要的意义 〔‘〕 。而对于重要的禾本科
植物 , 由于受到原生质体技术的限制 : 有关原生质体融合的资料相对庚乏 。 栽培稻与野生
种之间原生质体融合虽然已有报道 〔Γ 一 了〕, 但成功应用的例子很少 。 研究稻属种间融合的相
关问题 , 探讨原生质体融合的规律 , 是应用这一技术对野生稻的优异基因进行遗传操作的
重要基础研究 。
本文报道栽培稻与 7 种野生稻的原生质体融合 。在我们的一系列实验中 , 除获得了大
批融合体再生苗外 , 对原生质体的分离方法 、 原生质体的前处理及影响融合的一些 因素进
行了探 卜执〕 本项研究 旨在为应用细胞工程和分子生物学手段利用野生稻资源提供实验依
据 。
收稿 日 % & ∀∃Α Α : 修回 「 % & ≅ ! ≅ ? 。 第一 作者 % 男 : 7 岁 : 教授 ∀阵士 ∃ , 从事植物遗传工程方面的研究
本项研究 为欧 共体博士后获金资助课题
武 汉 植 物 学 研 究 第 ! 卷
材料和方法
∀#∃ 野生稻 % 选用染色体组型不同的 7 种野生稻作为基因供体融合亲本 ∀表 ∃ 。 野生
稻的悬浮细胞系和微繁殖植株叶片用作分离原生质体的材料 。
表 融合实验所用的野生稻
Η , Ι #3 . 2#ϑ ∗ 23 3 5 ) 5 3 ϑ 2+ Κ) 5 2( + 3 Λ Μ 3 ∗ 2Ν 3 + 1 5
种 名
ΟΠ3 3 23 5
组
Ο3 3 12( +
染色体组型
Χ 3 + ( Ν 3
染色体数目Θ /∗ ( + #( 5 ( Ν 3
+ ) + 2Ι 3 ∗
特点
Π∗ ( Π3 ∗ 1 23 5
澳洲野生稻≅ : , ) 5 1∗, #论, 正Γ Γ ∀∃∗ = Ρ, 3 Σ Σ Α7 具根状茎
颗粒野生稻
≅ : 厂 , , 里) #, ∗, Χ
∗, + ) #, 1, 3 未定 Α 7 耐荫
阔叶野生稻
≅ : #, 1汤〕#2, ∀∃∗ = Ρ, 3 ΘΘ ; ; 7 抗 ? 种褐 飞虱
马来野生稻
≅ : ∗ 2ϑ #3= 2 4 2ϑ #3 = 2 未定 Α 7 抗螟虫
∀Α ∃ 栽培稻 % 粳型 品种台
北 ? ≅ 号 作 为融 合 受 体 亲
本 。 悬浮细胞培养 系按前 已
报道的方法 〔 〕建立和继代 。
∀?∃ 原 生质 体 的分 离 %
取继代培养第 ? ϑ 的悬浮细
胞分离原生质体 。 野生稻
悬 浮细胞 , 加 入原 生质体分
离酶液 ∀纤 维素酶 3 3一#) #, 5 3
Τ 8 ) Ρ ( ) + , 4 Ο Υς和 果胶 酶
Π3 6 1( #=, 5 3 Ω 一Α? ≅ : ς溶于含甘露醇 ? ς的 ΘΠ. 中 ∃ ≅ Ν Ξ , 栽培稻悬浮细胞 中则加入
浓度稀释 7 倍的酶液 ≅ Ν Ξ , 在 7≅ ∗ Ψ Ν 2+ 摇床上酶解过夜 。 酶解混和物通过孔径为 !≅ 、
7 Γ 、 ?≅ 拼Ν 的尼龙筛后 , 经过梯度离心纯化 , 以 ΘΠ. ? > 洗净备用 。 从微繁殖植株分离原
生质体时 , 选择新抽出的幼嫩叶片切碎 , 在 ΘΠ. ##Ο Ζ 酶液中酶解 。 其后基本步骤与从悬
浮细胞分离原生质体相同 。
∀7∃ 原生质体失活处理 % 为了便于融合体的筛选 , 野生稻和栽培稻的原生质体在融合
前分别作射线处理和碘代乙酞胺 ∀ΥΤ Ζ ∃处理 。进行射线处理时 , 将野生稻原生质体转移于
≅ Ν Ξ 的离心管中 , 放入艳 ?& 自动辐照仪进行设定时间的放射处理 。对栽培稻原生质体
进行 ΥΤ Ζ 处理时 , 将 Θ Π. ? > 中的 ΥΤ Ζ 调至设定浓度 , 原生质体于 Α Θ 下保温 Α≅ Ν 2+ 。
处 理 完 毕 后 , 原 生 质体 以相 应 的 Θ Π. 洗 净 , 悬 浮 于 电 融 合 液 ∀含 + ς甘 露 醇 和
≅ · Γ Ν Ν ( #Ψ Ξ Θ ,Θ Υ% ∃中 。
∀Γ∃ 原生质体融合 % 采用英国诺丁汉大学设计的电融合仪诱导栽培稻与野生稻原生
质体融合 。 融合前双亲原生质体密度调至 又 ≅ Γ 个 Ψ Ν Ξ , 按 % 混匀后 , ≅ Θ Ν 火 ≅ 。Ν
的 ΑΓ 方格培养皿中每格加入 ? Ν Ξ 。 电极在乙醇中灭菌晾干后插入方格 。 融合时交流电
压调至 Α ≅ [ Ψ6 Ν 使细胞排列 , 后升至 7 ≅ [ Ψ 6 Ν , 并施以 Τ≅ [ Ψ6 Ν 的 7 次直流脉冲诱导
原生质体融合 。 实验设亲本原生质体 自融和不融合对照 。 融合后每格加入原生质体培养
基 Φ Π 4 ? Ν Ξ , 室温下静置 ? ≅ Ν 2+ 。
∀! ∃ 融合体 的 培 养 % 离 心收 集 融 合体 , 以原 生质 体培 养基 洗 ? 次 , 密 度调至 Γ 火
护 个 Ψ Ν Ξ , 取 ≅ : Α Ν Ξ 置于看护细胞琼脂糖块的滤膜上 , 在 Α! 一 Α Θ下培养 。 Γ ϑ 后将滤
膜转到新鲜的培养基上 。 细胞团长至 Ν Ν 时 , 转到分化培养基上培养成苗 。 融合体再生
植株在 > Ο 0Π 培养基上保存 。
∀&∃ 4 Ζ Π; 分析 % 亲本和融合体再生植株的全量 ; 9 Ζ 根据 Μ /3 + (# 一 6 /# (∗ (Κ (∗ Ν 方法
提取 , ; 9 Ζ 经过洗净风干之后溶于 Η Σ Ι )Κ Κ3 ∗ 中备用 。 聚合链式反应在编程的 ΠΘ 4 仪上
进行 , 引物为 Τ Μ 3 ∗( + Η 36 / + (# ( Β = 公司 Ζ Ζ 系列 。 每个 ΑΓ 川碑 的反应混合液中含 # Λ 反应
第 期 何光存等 % 栽培稻 与 7 种野 生稻的原生质体融合
缓 冲液 , ≅ Ν Ν ( #Ψ Ξ ϑ 9 Η ΠΟ , Ν Ν ( #Ψ Ξ 引 物 , ≅ : 5 ) 的 Η , Β Μ ( #=Ν 3 ∗ , 5 3 和 + Β 模 板
; 9 Ζ 。 反应混合液上加 ΑΓ 拼Ξ 的矿物油 。 反应循环程序 % 第一个循环为 Γ Θ , ≅ Ν 2+ ∴ 随后
? Θ , Ν 2+ ∴ ? & Θ , Ν 2+ ∴ & Α Θ , Α ≅ Γ , 循环 7 Γ 次 。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析 ,
每穴加载样液 ≅ 拌Ξ , 以 入; 9 Ζ Ψ ]2 +ϑ 皿 为分子量标准 。 ; 9 Ζ 带通过嗅化乙锭染色分析 。
Α 结果分析与讨论
栽培稻台北 ? ≅ 悬浮细胞系的原生质体收量极高 , 达到 : 7! 又 Υ∋ 个 Ψ ⊥_ 。 在预备
试验中试用了不同酶液的分离效果 , 即原始酶液 ∀含 ς纤维素酶 4 Ο 、 ≅: ς果胶酶 Ω 一Α? ∃
酶解 7 / 和在稀释 7 倍的酶液中过夜 。 两种分离方法的原生质体的收量和生活力并无差
异 。后一种方法可以节约酶液并便于工作时间的安排 , 因而在正式融合实验中均采用低浓
度酶液中酶解过夜的方法分离原生质体 。
野生稻的原生质体收量 比栽培稻低 , 7 种 表 Α 野生稻悬浮细胞与叶片的原生质体产最
野生稻悬浮细胞分离的原生质体平均收量为
? · ≅ 7 ⎯ ≅ ! 个 , 只及台北 ? ≅ 的四分之一 ∀表
Α∃ 。考察其原因 , 可能是稻属种间特性细胞壁
结构和成份有差异所致 。
野生稻组织培养难以成功 , 已为 国内外
多家研究结果所证实 。 从愈伤组织诱导到建
立可分离原生质体的悬浮细胞系一般需 7 个
月以上的时间 。 本项研究试验了从野生稻微
繁殖植株中分离叶肉原生质体 。 禾本科叶肉
Η , Ι #3 Α Π∗ ( 1 ( Π#, 5 1 =23 #ϑ 5 Κ∗ ( Ν 5 ) 5Μ 3 + 5 2( +
3) #1) ∗ 3 5 , + ϑ #3 , < 3 5 ( Κ _ 2#ϑ ∗ 23 3 5
野生稻种Ο Π3 3 23 5 原生质体产量
∀
Π ∗ ( 1 ( Μ #, 5 1 = 23 #ϑ ∀岛几∃
!暇+,上 , 澳洲野生稻 悬浮细胞! · ∀ # ∃ %&∀ ∋(尸, ) ∗ ∗ 叶 片
+ , − .士 , / 0 1 2
+ , 3 /士 , /4 1 2
阔叶野生稻
, ∋∀ &(56∋( ∀
悬浮细胞
叶 片
+ / , 士 , 0 7 1 2
+ , 3 士 , 4 ∗ 1 2
马来野生稻
, & (8 ∋州
悬浮细胞叶 片
+ , 7 士 , 1 2 7
+ , 0 −士 , . 0 1 2 7
颗粒野生稻
, 9 &∀ ” # ∋∀ &∀
悬浮细胞
叶 片
+ , 3 4士 , / 1 2 ‘
+ , 3 士 , 3 1 2 7
原生质体含较多叶绿体 , 分离过程中易破碎 , 一般收量很低 。 因而将酶溶于含一系列细胞
膜稳定成份的 : ;< ∋ ∋ => 〔∗〕中 。 4种野生稻叶肉原生质体收量平均为 , 4 2 ? 护 个 ≅ 9 ΑΒ ,
尽管 比悬浮细胞的低 , 但足以进行融合实验 。从叶片分离原生质体省去了建立悬浮培养系
的复杂过程 , 实际上提高了野生稻原生质体获得的效率 。
Χ 射线能造成细胞染色体和 Δ Ε > 的断裂或损伤 , 从而抑制细胞分裂 Φ ?Γ > 处理则可
对细胞质的某些成份产生损伤 , 也有抑制细胞分裂的效果 。 射线处理的原生质体与 ? Γ >
处理的原生质体融合后在代谢上实现互补 , 可以进行正常的生长分裂 , 广泛地应用于融合
实验以选择融合体〔‘〕 。 射线处理供体原生质体的另一优点是染色体经失活处理后 , 在细胞
分裂时可能丢失 , 因而杂种中只含有供体植物的少数染色体 、 染色体的片段甚至仅为细胞
质 。 这种不对称融合和基因组的部分转移 , 可提高细胞杂种的育性和可利用性 〔− “ 。〕。
以马来野生稻 + , &∋ 8∋ ΗΧ ∋1 悬浮系分离的原生质体为材料 , 对 Χ 射线处理的有效剂量
作了试验 。 自动放射仪 处理原生质体 ∋ Ι +剂量 为 ∗ 4 ϑ Χ 1 , 原生质体的植板率为未处理
对照的 .4 Κ , . Ι 放射处理 + 7 ∗ ϑ Χ 1可以完全抑制细胞团的形成 。 Λ Χ!Μ #Ν ∀ 曾报道用射
线处理栽培稻 > ∗3Ο Π ∃ 时 , 只需要 ∗. ϑ Χ 即可抑制细胞团的形成 〔”〕 , 远远低于本试验 中
马来野生稻所需的剂量 。这种差异除种间特性的影响之外 , 细胞的生长状态也是重要 因素
之一 。本试验所用马来野生稻悬浮细胞生长极 为旺盛 , 在诺丁汉大学常用来作水稻原生质
体培养的看护细胞 , 因而需要更高的辐射剂量来抑制细胞的生长 。
武 汉 植 物 学 研 究 第 ! 卷
就 ΥΤ Ζ 对栽培水稻台北 ? ≅ 原生质体的有效剂量也作了研 究 , 在 ? 次独立 的试验
中 , ≅ Ν Ν (# Ψ Ξ 的 ΥΤ Ζ 处理 Α≅ Ν 2+ 即可有效地抑制台北 ?≅ 原生质体的生长 。 在以后的
融合实验中均用 ? / 放射处理野生稻原生质体 , ≅ Ν Ν (# Ψ Ξ ΥΤ Ζ 处理台北 ? ≅ 原生质体
Α ≅ Ν 2+ 以形成融合体的选择体系 。
电激法是诱导原生质体融合的有效方法之一 , 在 Α ( [ Ψ 6 Ν 的交流 电场里 , 原生质体
排列成串 。 根据台北 ?≅ 悬浮细胞分离原生质体与阔叶野生稻叶肉原生质体融合试验统
计 , ≅ ς以上的原生质体排列成 串 。 当施加 ( ≅ [ Ψ6 Ν 的直流 电压时 , 原生质体发生融
合 , 形成来源于 Α 个或多个细胞的融合体 。
经过融合处理的原生质体和未融合的对照均以燕麦草悬浮细胞作看护进行培养 。 结
果表明 , 电激融合处理对原生质体的生长有一定的影响 。 以台北 ?≅ 为例 , 电激处理过的
原生质体培养 Α 周后 , 细胞 团的形成率只及未 电激对照的 ?Α ς 。 每次融合实验均设亲本
原生质体失活处理后不融和 自融的两种对照 。在所有实验中 , 上述两种对照从未有细胞团
的形成 , 进一步证实了 = 射线和 ΥΤ Ζ 失活处理的可靠性 。 因此 , 异种原生质体融合后形成
的愈伤组织 , 均 可以认为是融合体而来 。 融合体培养 7 周后 , 愈伤组织形成频率平均为
& : Λ ≅ 一 Γ , 变异幅度为 Α : 又 ≅ 一 ‘至 Α : & Λ ≅ 一 Γ 。
融合体经看护培 养 Γ ϑ 后转移到
新鲜培养基上培养 , 所形成的愈伤组织
以两段分化培养法再生出植株 。 即将愈
伤组织首先转移至含蔗糠和 麦芽糖各
Γ ς 、 琼脂 糖 : Α ς 的 > Ο Φ 9 ∀> Ο 加
Φ 2+ 3 1 2+ Α Ν Β Ψ Ξ , 9 Ζ Ζ ≅ : Γ Ν Β Ψ Ξ ∃上暗
培养 Γ ϑ , 以促进胚状体的 发育 ∴ 然后
转移到琼脂糖浓度减半的 > Ο Φ 9 培养
基上光照培养发育成绿苗 。 试验结果表
明 , 这种二段分化培养的绿 苗再生频率
比在琼脂糖 ≅ : ! ς , 蔗糖 ? ≅ ς > Ο Φ 9
上培养的高 Α一 Γ 倍 ∀表 ? ∃ 。
对 7 种融合组合 的再生绿苗取 样
提取 ; 9 Ζ , 作 了 4 Ζ Π; 分 析 。 结果 表
明 , 融合体再生苗的带谱明显与受体亲
表 ? 两种方法获得的植株分化频率
Η , Ι #3 ? 4 3 Β 3 + 3 ∗ , 12( + ∗ , 13 5 ( Κ Μ #, + 1#3 15 Κ∗ ( Ν
Κ) 53 ϑ 33 ##5 ( + ϑ 2ΚΚ3 ∗ 3 + 1 Ν 3 ϑ2,
再 生方法 “> 3 1 α# ( ϑ 5
愈伤数
Θ , ##2 1 ∗ , + 5
Κ3 ∗ ∗3 ϑ
绿苗数
Χ ∗ 3 3 +
Μ #, + ∗#3 1 5
白苗数
Ζ #Ι 一+ (
分化频率∀ς ∃
4 3 Β 3 + 3 ∗ , β
1#( + ∗ , 1 3
方法一
> 3 1#飞( ϑ ( + 3
方法 χ二> 3 1 ## ( ϑ 1 _ (
方‘法一> 3 1##( ϑ ( + 6
方法二> 3 1 #飞( ϑ 1 _ (
Α Γ
Α Α&
? &
≅ ≅ ≅
, 方法 一 % 在普通 > ΟΦ 9 培养基 上再 生 ∴ 方法二 % 在改 良的
> ΟΦ 9 培 养琴上再生
釜 > 3 1## ( ϑ ( + 3 % Π #, + ∗ #6 1 5 _ 6 ∗ 3 ∗ 6 Β 3 + 3 ∗ , ∗3 ϑ ( + > Ο Φ 9 + 、3 ϑ 2β
) + # : > 3 1 ##( ϑ 1 _ ( % Π #, + 1 #6 15 _ 3 ∗ 3 ∗ 3 Β 3 + 3 ∗ , 1 3 ϑ ( + ∗ ## 3 + #( ϑ 2
Κ2( ϑ > Ο Φ 9 + Ρ6 ϑ #) + # 2% _ /23#、 ? ς 5 ) 3 ∗ ( 5 3 _ , 5 ∗ 3 Μ #, 3 3 ϑ
_ 21 #、 : Γ ς % 、, #1 ( 、。 , + ϑ : Γ ς 5 ) 3 ∗ ( 5 3 :
本台北 ? ≅ 的不同 , 一般均 多出数目不等扩增带 ∀见图 ∃ 。 同一组合个体之间亦呈现出差
别 , 这是因为不同实验之间或同一实验不同个体之间 , 野生稻原生质体生长状况 、受辐射
作用的程度有差别所致 。 在栽培稻 Ψ 颗粒野生稻 、栽培稻 Ψ马来野生稻融合后代的微繁殖苗
中 , 有的表现出野生稻根部的典型性状 。 结果表明电激融合是获得体细胞杂种的有效途
径 。
进行了 7 种野生稻与台北 ?≅ 之间 7 Γ 次融合实验 。 通过逐次融合的分析 , 发现融合
体愈伤组织形成频率与供体原生质体的来源有一定的关系 。 从表 7 可以看出 , 以马来野生
稻和宽叶野生稻效果最好 , 澳洲野生稻的结果最差 。 这种差异可能与原生质体来源组织有
# ! 武 汉 植 物 学 研 究 第 ! 卷
参 考 文 献
应存山 : 中国稻种资源 : 北京 % 中国农业科技出版社 , ? : 一 !
Α [ , ) Β /, + ; Ζ : Η /3 _ 2#ϑ ∗ 3Υ, 1 2< 3 5 ( Κ ∗ 23 3 : Π : ∀∃ : 0( Λ ? ? , ≅ > , + 2#, , Μ /2#2Μ Μ 2+ 3 5 % Υ+ 1 3 ∗+ , 1 2( + , # 4 23 3 4 3 5 3 , ∗ 3 / #+ β
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≅ : Υ ( + ϑ ( + % Ζ 3 , ϑ 3 + # 23 Π ∗ 3 5 5 , ? : ≅ &一 Α≅ Γ
Γ ⊥2+ 3/ 4 Π , Ο#, Ν 3 1 Υ ] , Θ ( 3 8 2+ Β Σ Θ : Μ ∗ ( ϑ ) 3 1 2( + ( Κ / 3 13 ∗ ( 8 , ∗ = ( + 5 Ι = 1 /3 Κ) 5 2( + ( Κ Ν 3 5 ( Μ / =## Μ ∗ ( 1 ( Μ #, 5 1 5 ( Κ
Π ( ∗1 3 ∗ 尸5 2, 6 ( , ∗ 6 ∗, ∗ , , + ϑ 3 3 ## 5 ) 5 Μ 3 + 5 2( + 一 ϑ 3 ∗ 2< 3ϑ Μ ∗( 1( Μ #, 5 ∗5 ( Κ( 即Ρ , 5 , ∗ Ρ< , % Ζ + 3 _ , Μ Μ ∗ ( , 3/ 1( 5 ( Ν , 1 23 / =Ι ∗ 2ϑ 2Ρ, β
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Μ ∗ ( 1( Π#, 5 1 5 : & ,/ 3 ( ∗ Ζ ΠΠΥ Χ 3, % 3 1 , , & ! % ≅ 一 ≅
何光存 , 卢兴桂 : 光敏感核不育水稻原生质体的高效培养与再 生 : 高技术通讯 : ? , Α % ε Α
Η ∗ 23 8 ] , Δ 3#3 3 ∗ Ζ , 0 , 1 3 5 Χ . : Θ / ∗ ( + 飞( 5 ( Ν 3 3 #2+ 22+ , 1 2( + 2+ , 5 = Ν Ν 3 1 ∗ 23 5 ( + , 1 23 /= Ι ∗ 2ϑ 5 % 3 ΚΚ3 3 1 5 ( Κ Β , Ν Ν , ϑ ( 5 3 , + ϑ
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第 期 何光存等 % 栽培稻与 7 种野 生稻的原生质体融 合
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_ 2#ϑ ∗ 23 3 5 _ 3 ∗3 3 #3 3 1 ∗ ( Κ) 5 3 ϑ Κ∗ ( Ν _ / 23 / 7 ? ! 7 3 , ##2 _ 3 ∗ 3 ( Ι 1 , 2+ 3 ϑ , + ϑ 7 ≅ Μ #, + 1 5 _ 3 ∗ 3 ∗3 β
Β 3 + 3 ∗ , 13 ϑ : ; 2ΚΚ3 ∗ 3 + 1 ∗ , ∗3 5 ( Κ 3 ( #( + = Κ( ∗ Ν , 1 2( + , + ϑ Π#, + 1 ∗3 Β 3 + 3 ∗ , 1 2( + _ 3 ∗ 3 ( Ι 5 3 ∗ < 3 ϑ ,
Μ ∗ ( Ι , Ι #= , 5 , ∗ 3 5 ) #1 ( Κ 1 / 3 3 ( Ν Μ , 1 2Ι2#21 = Ι 3 1_ 3 3 + 1 /3 _ 2#ϑ , + ϑ 3 ) #1 2< , 13 ϑ Β 3 + ( Ν 3 5 : Η /3
/ = Ι ∗ 2ϑ 5 _ 3 ∗ 3 3 ( + Κ2∗ Ν 3 ϑ Ι = Ν ( ∗ Μ / ( #( Β = , 5 5 3 5 5 Ν 3 + 15 , + ϑ 4 Ζ Π; , + , #= 5 2、 :
Φ 3 = _ ( ∗ ϑ 5 Θ ) #1 2< , 1 3 ϑ ∗ 23 3 , . 2#ϑ ∗ 23 3 , Π ∗ ( 1 ( Μ #, 5 1 , ⊥ ) 5 2( +