全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(2): 205−213 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究国家公益性行业(农业)科研专项(3-29)和国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-05)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 张京, E-mail: zhangjing03@caas.cn, Tel: 010-62189624
第一作者联系方式: E-mail: caas08f2e1a@aliyun.com, Tel: 0354-6286388
Received(收稿日期): 2013-06-22; Accepted(接受日期): 2013-09-16; Published online(网络出版日期): 2013-11-14.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20131114.1708.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00205
Amy6-4基因遗传多样性及其与 α-淀粉酶活性的关联分析
姜晓东 1,2 郭刚刚 1 张 京 1,*
1 中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081; 2山西农业大学农学院, 山西太谷 030801
摘 要: α-淀粉酶活性是影响大麦种子发芽和麦芽制作及啤酒酿造的重要性状, Amy6-4 为编码高等电点的 α-淀粉酶
基因, 挖掘其高活性的等位变异对啤酒大麦的品种改良具有指导意义。通过对 58 份大麦品种中 Amy6-4 基因的重测
序, 研究了该基因的核苷酸序列以及在品种间的遗传多样性, 并在群体结构分析的基础上, 进行了核苷酸多态性与
α-淀粉酶活性的关联分析。结果表明, Amy6-4基因共存在 7个单核苷酸变异位点(SNP), 构成 5种单倍型。其中, H_3
单倍型最普遍, 发生频率为 51.7% (30/58); 其次为 H_1单倍型, 发生频率为 39.7% (23/58); 其他 3种单倍型发生的频
率约为 10%。SNP位点及其构成的单倍型均与酶活性无关联性。
关键词: 大麦; 遗传多样性; 单倍型; 连锁不平衡; 关联分析
Association of Genetic Diversity for Amy6-4 Gene with α-Amylase Activity in
Germplasm of Barley
JIANG Xiao-Dong1,2, GUO Gang-Gang1, and ZHANG Jing1,*
1 Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2 College of Agronomy, Shanxi Agricultural University,
Taigu 030801, China
Abstract: Amy6-4 is one of the genes codingα-amylase with high isoelectric point, which plays an important role in germination
and malting process in barley (Hordeum vulgare L.). To detect the intervarietal polymorphism on Amy6-4 locus, we resequenced
the Amy6-4 alleles in 58 barley varieties that are deposited in the germplasm bank of China, and analyzed the association of single
nucleotide polymorphisms (SNPs) and haplotypes with α-amylase activity based on the population structure. A total of seven
SNPs in five haplotypes were detected among the 58 barley entries. Haplotype H_3 was most popular with frequence of 51.7%
(30/58) in the entries tested, and haplotype H_1 ranked the second with frequnce about 39.7% (23/58). However, the remaining
three haplotypes only shared about 10% of the frequency. No SNP or haplotype was associated with α-amylase activity.
Keywords: Barley; Genetic diversity; Haplotype; Linkage disequilibrium; Association analysis
α-淀粉酶属 α-1,4-D-葡聚糖水解酶, 作用于淀
粉及相关多聚和寡聚糖的 1,4-糖苷键, 广泛存在于
植物、动物、细菌和真菌中。在大麦中, 根据等电
点高低, 将 α-淀粉酶分为低等电点 Amy1 (pI 4.7~5.0)
和高等电点 Amy2 (pI 5.9~6.4)两类; 相应地, α-淀粉
酶的编码基因也依据其编码酶蛋白的等电点高低分
为 Amy1和 Amy2两大基因家族, 分别位于第 7和第
6染色体上[1]。
Amy6-4 基因是编码 Amy2 的基因家族成员之一,
主要在发芽种子的糊粉层中合成。1985年, 为研究
赤霉素(GA)对 α-淀粉酶基因表达的影响, Rogers[2]
根据高等电点 α-淀粉酶的 cDNA文库和同工酶信号
肽序列设计引物, 与大麦糊粉层表达的 mRNA 杂
交, 找出高等电点 α-淀粉酶相关 mRNA, 经引物延
伸克隆出 cDNA序列, 通过 Southern杂交克隆出全
基因序列 , 定名为 Amy6-4 (GenBank 登录号为
K02637.1)。
麦芽中的 α-淀粉酶是唯一能够最初对天然淀粉
颗粒起作用的酶 , 其活性直接影响到淀粉的降解 ,
在麦芽加工和啤酒生产中起重要作用, 因此成为麦
206 作 物 学 报 第 40卷


芽质量和啤酒大麦品种选育的重要指标。
通过功能基因重测序揭示不同品种或基因型之
间的单倍型变异, 进而对等位基因多态性与表型性
状进行关联分析, 不仅能寻找功能基因的优良等位
变异, 为分子标记选择开发标记, 而且可能发现多
功能基因以及用以鉴定多个表型性状的多功能分子
标记。2001年, Thornsberry等[3]利用 92个自交系材
料对 dwarf8 基因的多态性研究和关联分析发现, 该
基因不但影响玉米的株高, 更重要的是有的等位变
异还与开花期有关。受这一研究启发, 利用已知基
因序列进行基因多样性和功能预测及验证的报道越
来越多[4-5]。本研究选用 58份大麦种质资源, 根据发
表的 Amy6-4基因序列设计引物, 对该基因进行重测
序, 并进行单核苷酸多样性和单倍型分析, 试图通
过该基因的等位变异与 α-淀粉酶活性之间的关联分
析, 发现 Amy6-4 基因的优良等位变异(突变), 为开
发功能标记奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料和 DNA提取
58份供试大麦种质中, 56份来自中国的22个省、
自治区, 代表不同的生态类型, 包括46份地方品种、
5份野生型大麦和5份育成品种。其余2份国外种质来
自叙利亚和伊朗(表1)。全部材料由中国农业科学院
作物科学所国家农作物种质资源保藏中心提供。
选取每份材料 10 粒种子, 种于温室, 种子出苗
2 周后, 剪取嫩叶, 用 CTAB 法[6]提取基因组 DNA,
1%的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量, 紫外分光光
度计检测 DNA浓度。
1.2 α-淀粉酶活性测定
选取每份材料 100 粒种子, 置 3 个铺有湿润滤
纸的培养皿中, 于培养箱中 15℃暗培养 5 d后, 随机
取 20 粒种子, 去除根和芽。采用 3,5-二硝基水杨酸
法[7]测定 α-淀粉酶活性。
1.3 Amy6-4基因序列分析
1.3.1 引物设计 根据 NCBI (http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/nuccore/166994)公布的 Amy6-4 基因组
序列(GenBank 登录号为 K02637.1), 与大麦中其他
编码 α-淀粉酶的同源基因序列比对结果, 选择在非
同源区段, 设计覆盖 Amy6-4基因 5′ UTR区、编码区
和内含子区以及 3′ UTR 区的 4 对引物, 用于全长扩
增(表 2)。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。
1.3.2 基因扩增与测序 PCR反应总体积为 25 μL,
包含基因组 DNA 25 ng、dNTP终浓度各 0.25 μmol
L−1、引物终浓度各 10 μmol L−1、HiFi Taq DNA
Polymerase (北京全式金生物技术有限公司) 1 U和
1×buffer 25 μL。扩增程序为: 94℃预变性 5 min; 94℃
变性 30 s, 退火 30 s (温度因引物而异), 72℃延伸
1 min, 38个循环; 72℃终延伸 10 min; 4℃保存。扩增
产物经凝胶回收试剂盒(TIANGEN)纯化后, 送生工
生物工程 (上海 )有限公司进行双向测序。利用
BLAST 工具 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/), 将测序
结果与 GenBank 中的序列比对, 以确认扩增结果的
正确性。
1.3.3 数据分析 利用 Vector NTI Advance 10.0
(Invitrogen, USA)中的 Contig-Express 组件, 将相互
覆盖的序列片段拼接, 用 Clustal W1.83 软件[8]进行
多序列比对, 将完成比对的序列保存为 PHYLIP 格式
文件, 采用 DnaSP 4.0 软件(http://www.ub.es/dnasp)[9]
进行序列多样性分析及单倍型分析。分别利用 θ值[10]
和 π 值[11]估计核苷酸多样性。作为衡量核苷酸多样
性的参数, θ值为衡量群体突变的参数, 与核苷酸变
异占序列位点的比率有关。而 π 值则反映同一位点
不同序列间的差异。
根据Tajima [12]提出的TajiIma’s D检验, 作中性检
验, 以评价 Amy6-4基因是否经受了选择的影响。
1.3.4 系统发育树的构建 使用 ClustalW1.83 软
件进行序列比对, MEGA4.0 软件[13]邻接法(neighbour-
joining)构建系统发育树。
1.4 群体结构和等位基因的连锁不平衡分析
利用覆盖大麦基因组的41个 SSR 标记, 使用
Structure2.0软件[14]对58份样品进行群体结构分析。
用 DnaSP 4.0 软 件 (http://www.ub.es/dnasp) 计 算
Amy6-4基因位点上任意2个多样性等位位点之间的
r2值, 绘制 LD衰减图, 分析 Amy6-4位点等位基因之
间的连锁不平衡。
1.5 Amy6-4等位变异与酶活性关联分析
将群体结构分析中各个品种的Q值作为协变量,
使用 TASSEL 2.1软件(http://www.maizege netics.net/)
的一般线性模型(general linear model, GLM)程序 ,
对测得的 α-淀粉酶活性数据与 Amy6-4 序列分析的
SNP和单倍型数据进行回归分析。
2 结果与分析
2.1 Amy6-4核苷酸和氨基酸序列分析
以覆盖 Amy6-4全基因 2902 bp的 4对引物, 包
第 2期 姜晓东等: Amy6-4基因遗传多样性及其与 α-淀粉酶活性的关联分析 207


括起始密码子前 1168 bp的 5′ UTR区、编码区以及
264 bp 3′ UTR区, 对 58份大麦种质进行分段扩增和
序列比对(图 1)。结果只有位于编码区的第 3外显子
和 3′ UTR 区存在单核苷酸多态性位点(SNP), 其中
在编码区有 4个 SNP位点, 3′ UTR上存在 3个 SNP
位点(图 2), 构成 5种单倍型(表 3)。

表 1 58份供试大麦种质的编号、原产地及特性
Table 1 Accession number, origin, and characteristics of 58 barley entries
品种编号
Accession
No.
原产地
Origin
棱型
Row
number
皮裸性 1)
Covered/
naked 1)
冬春性 2)
Growth
habit 2)
种质类型 3)
Germplasm
type 3)
单倍型类型
Type of
haplotype
α-淀粉酶活性
Activity of
α-amylase
ZDM2719 中国浙江 Zhejiang, China 2 C S C 2 0.753
ZDM8300 中国浙江 Zhejiang, China 2 C S C 2 0.869
ZDM3344 中国浙江 Zhejiang, China 6 C F L 3 1.063
ZDM2680 中国浙江 Zhejiang, China 2 C S L 1 1.127
ZDM2683 中国浙江 Zhejiang, China 2 C F L 1 1.127
ZDM2844 中国浙江 Zhejiang, China 6 C F L 1 1.245
ZDM4018 中国云南 Yunnan, China 6 C F L 3 0.777
ZDM1802 中国新疆 Xinjiang, China 6 N S L 3 1.265
ZDM1775 中国新疆 Xinjiang, China 2 C S L 1 1.252
ZDM4922 中国西藏 Tibet, China 6 N S C 3 1.429
ZP401 中国西藏 Tibet, China 6 C S W 3 0.991
ZP436 中国西藏 Tibet, China 6 N S W 3 0.703
ZDM4453 中国西藏 Tibet, China 6 N S L 3 0.863
ZP470 中国西藏 Tibet, China 6 N S W 3 0.703
ZP500 中国西藏 Tibet, China 6 C S W 3 1.231
ZP371 中国西藏 Tibet, China 6 N S W 3 0.989
ZDM4707 中国西藏 Tibet, China 6 N S L 3 1.185
ZDM3882 中国四川 Sichuan, China 6 N W L 3 1.075
ZDM5371 中国四川 Sichuan, China 6 C W L 3 1.473
ZDM93 中国陕西 Shaanxi, China 6 C S L 3 1.110
ZDM887 中国陕西 Shaanxi, China 6 C S L 1 0.661
ZDM119 中国山西 Shanxi, China 2 C S L 5 1.252
ZDM286 中国山东 Shandong, China 6 C W L 1 0.692
ZDM368 中国山东 Shandong, China 6 C W L 4 1.261
ZDM8102 中国青海 Qinghai, China 6 N S L 3 0.950
ZDM8154 中国青海 Qinghai, China 6 N S L 3 0.896
ZDM5210 中国内蒙古 Inner Mongolia, China 6 N S L 3 0.956
ZDM5212 中国内蒙古 Inner Mongolia, China 6 N S L 3 0.766
ZDM1406 中国内蒙古 Inner Mongolia, China 2 C S L 1 0.671
ZDM5203 中国内蒙古 Inner Mongolia, China 2 C S L 1 0.839
ZDM5206 中国内蒙古 Inner Mongolia, China 6 C S L 1 0.784
ZDM5263 中国江西 Jiangxi, China 6 C W L 1 0.776
ZDM5271 中国江西 Jiangxi, China 6 C W L 1 0.497
ZDM1838 中国江苏 Jiangsu, China 2 C S C 3 1.189
ZDM2398 中国江苏 Jiangsu, China 6 C W L 3 1.053
ZDM2038 中国江苏 Jiangsu, China 6 C F L 3 0.775
ZDM3516 中国湖南 Hunan, China 2 C S L 1 1.162
ZDM9621 中国湖北 Hubei, China 2 C F C 2 0.796

208 作 物 学 报 第 40卷


(续表 1)
品种编号
Accession
No.
原产地
Origin
棱型
Row
number
皮裸性 1)
Covered/
naked 1)
冬春性 2)
Growth
habit 2)
种质类型 3)
Germplasm
type 3)
单倍型类型
Type of
haplotype
α-淀粉酶活性
Activity of
α-amylase
ZDM3447 中国湖北 Hubei, China 6 C W L 1 0.917
ZDM5240 中国黑龙江 Heilongjiang, China 6 C S L 3 0.824
ZDM1175 中国黑龙江 Heilongjiang, China 6 C S L 1 1.255
ZDM860 中国河南 Henan, China 6 N S L 3 1.079
ZDM586 中国河南 Henan, China 6 C S L 1 1.209
ZDM14 中国河北 Hebei, China 6 C S L 1 1.265
ZDM8986 中国贵州 Guizhou, China 6 C F L 3 1.053
ZDM8981 中国贵州 Guizhou, China 6 C W L 1 0.781
ZDM3883 中国贵州 Guizhou, China 2 C S L 1 1.371
ZDM3901 中国贵州 Guizhou, China 6 C W L 1 1.330
ZDM3629 中国广东 Guangdong, China 6 C W L 1 1.245
ZDM8055 中国甘肃 Gansu, China 6 N S L 3 0.868
ZDM7825 中国甘肃 Gansu, China 2 C S L 3 1.516
ZDM8018 中国甘肃 Ganshu, China 6 N S L 3 1.115
ZDM3606 中国福建 Fujian, China 6 N S L 3 1.145
ZDM5258 中国安徽 Anhui, China 6 C F L 1 0.505
ZDM5260 中国安徽 Anhui, China 6 C F L 1 0.655
ZDM5261 中国安徽 Anhui, China 6 C F L 1 0.754
WDM4911 伊朗 Iran 6 N S L 3 0.587
WDM3692 叙利亚 Syria 6 C S L 3 0.784
1) C和 N分别代表皮大麦和裸大麦; 2) S、W和 F分别代表春性、冬性和半冬性; 3) C、L和W分别代表栽培品种、地方品种和野生种。
1) C and N stand for covered and naked barely, respectively; 2) S, W, and F stand for spring, winter, and facultative barely, respectively;
3) C, L, and W stand for cultivar, landrace, and wild species, respectively.

表 2 用于扩增 Amy6-4基因不同区段的引物
Table 2 Primers for Amplification of different parts of Amy6-4 gene in barley
序列 Sequence (5′–3′) 引物
Primer 正向 Forward 反向 Reverse
产物期望大小
Expected product (bp)
退火温度
Annealing temp. ( )℃
Amy6-4_1 CGTTCAAAGCGTGTGTTATTTT CATGATCGCGGTACATACAGA 1306 61
Amy6-4_2 CCATCTACATCACTTGGGCATT ATGAACGAAACCAAGAAAAGAAA 1420 59
Amy6-4_3 TCTGTATGTACCGCGATCATGT TGTATCATATAGGAACTTGTAGAGCTG 1400 62
Amy6-4_2 TTTCTTTTCTTGGTTTCGTTCA AAGCTTTTGGTTATCTATATCCATTG 590 61

Amy6-4基因的第 3外显子和 3′ UTR存在多样
性(图 1和图 2)。于第 3外显子 2442 bp处有一个 C/G
颠换多态性位点, 为一同义突变, 对应于氨基酸序
列的第 360位点精氨酸(R); 2477 bp位点为A/G转换
SNP 位点, 为非同义突变, 导致第 372 位点的氨基
酸由天冬酰胺(N)突变为丝氨酸(S); 2587 bp有一个
G/A 转换 SNP 位点, 为同义突变, 对应于第 405 位
点甘氨酸(G); 位于 2591 bp出现一个 G/C颠换 SNP
位点, 为非同义突变, 导致第 410 位点的氨基酸由
甘氨酸(G)突变为丙氨酸(A)。该基因的 3′ UTR区有
3个 SNP位点, 分别是位于 2655 bp的 G/A、2657 bp
的 G/C和 2840 bp的 G/A多态性位点。在供试的 58
份大麦材料中 , H_3 单倍型的出现频率最高 , 达
51.7% (30/58); 其次为 H_1 单倍型, 频率为 39.7%
(23/58); 其他 3种单倍型的频率均较低(表 3)。
2.2 核苷酸序列多样性的变化趋势
以核苷酸多样性 π值和θ为指标, 通过对 58份
大麦材料 Amy6-4基因第 3外显子和 3′ UTR区的序
列多样性研究, 基本明确了相应于 Amy6-4基因全序
列, 在长度为 475 bp 区段内单核苷酸多样性(SNP)
分布规律。π值从 2442 bp的 0.0075上升至 2477 bp
的 0.001 25, 此后开始下降至 0.005, 再从 2587 bp 到
第 2期 姜晓东等: Amy6-4基因遗传多样性及其与 α-淀粉酶活性的关联分析 209


2591 bp 迅速升高到最大值 0.015 (即在编码区的
SNP3), 再次下降; 在 3′ UTR 区下降到最低值, 接
近 0 后再次升高, 表现为先升后降—再升再降—再
升的变化趋势, 而其他区段则相对保守(图 3)。
2 个多样性参数(θ 和 π)的估计值 0.005 80 和
0.007 13, 差异不显著, 表明 θ 值和 π 值的变化趋势
较为一致。
利用 Amy6-4 序列中的多态性位点 (SNP)的
TajiIma’s D检验, 本试验中TajiIma’s D值为 0.697 25,
在 P = 0.1 水平未达到显著, 说明该基因在进化过
程中, 未经受选择作用的影响, 其序列变异为选择
中性。

图 1 Amy6-4第 3外显子和 3′ UTR的 7个 SNP的核苷酸序列(475 bp)比对
Fig. 1 Nucleotide alignment with seven SNPs detected in the third exon and 3′ UTR for Amy6-4 gene

图 2 Amy6-4结构示意图及在第 3外显子和 3′ UTR上的多态性位点(SNP)
Fig. 2 Schematic structure of Amy6-4 with all detected SNPs, located in the third exon and the 3′ UTR
210 作 物 学 报 第 40卷


表 3 在 58份大麦种质中发现的 Amy6-4的单倍型
Table 3 Haplotypes in Amy6-4 gene among 58 barley entries
多态性位点 Polymorphic loci 单倍型
Haplotype
种质数
No. of entries
频率
Frequency (%) 2442C 2477C 2587C 2591C 2655U 2657U 2840U
H_1 23 39.7 G A G C A C A
H_2 3 5.2 C G A G G G G
H_3 30 51.7 C G G G G G G
H_4 1 1.7 C A G G A C G
H_5 1 1.7 G G G G G C G
多态性位点表示为核苷酸序数+所在区域, 其中C表示编码区, U表示 3′ UTR区。H_1单倍型包括种质 ZDM14、ZDM286、ZDM887、
ZDM1175、ZDM1406、ZDM1775、ZDM3447、ZDM3516、ZDM3629、ZDM5203、ZDM5206、ZDM5258、ZDM5260、ZDM5261、
ZDM5263、ZDM5271、ZDM8981、ZDM2680、ZDM2683、ZDM586、ZDM2844、ZDM3883和 ZDM3901; H_2单倍型包括种质 ZDM2719、
ZDM8300和 ZDM9621; H_3单倍型包括种质 ZDM860、ZDM3882、ZDM4922、ZDM8018、ZDM8102、ZP401、WDM3692、ZDM1838、
ZDM5240、ZDM5371、ZDM1802、ZP436、ZDM4453、ZDM5210、ZDM8055、ZDM8986、ZP470、WDM4911、ZDM2398、ZDM3344、
ZDM7825、ZDM4018、ZDM2038、ZP500、ZP371、ZDM8154、ZDM5212、ZDM4707、ZDM3606和 ZDM93; H_4单倍型包括种质 ZDM368;
H_5单倍型包括种质 ZDM119。
The polymorphic locus is named as the series number of the nucleotide plus the letter “C” (coding region) or “U” (3′ UTR region). The
H_1 haplotype included entries ZDM14, ZDM286, ZDM887, ZDM1175, ZDM1406, ZDM1775, ZDM3447, ZDM3516, ZDM3629, ZDM5203,
ZDM5206, ZDM5258, ZDM5260, ZDM5261, ZDM5263, ZDM5271, ZDM8981, ZDM2680, ZDM2683, ZDM586, ZDM2844, ZDM3883, and
ZDM3901; the H_2 haplotype included entries ZDM2719, ZDM8300, and ZDM9621; the H_3 haplotype included entries ZDM860,
ZDM3882, ZDM4922, ZDM8018, ZDM8102, ZP401, WDM3692, ZDM1838, ZDM5240, ZDM5371, ZDM1802, ZP436, ZDM4453,
ZDM5210, ZDM8055, ZDM8986, ZP470, WDM4911, ZDM2398, ZDM3344, ZDM7825, ZDM4018, ZDM2038, ZP500, ZP371, ZDM8154,
ZDM5212, ZDM4707, ZDM3606, and ZDM93; and the H_4 and H_5 haplotypes included entries ZDM368 and ZDM119, respectively.


图 3 Amy6-4基因序列多样性
Fig. 3 Sequence diversity of Amy6-4 gene

2.3 Amy6-4基因系统发育树分析
根据 58份种质Amy6-4基因第 3外显子和 3′ UTR
区域 SNP变异所构成的 5种单倍型, 构建了系统发育
树, 发现单倍型 H_1 与 H_4、H_2 与 H_3、H_5 与
H_3 亲缘关系最近; 其次是单倍型 H_1、H_2、H_3
和 H_4均与H_5较近; H_1和 H_4都与H_3较远, 与
H_2 最远; H_2、H_3 和 H_5 均与 H4 较远, 与 H_1
最远(图 4)。对各种单倍型品种的来源(表 1 和表 3)
分析可知, H_1单倍型的 23份种质地域分布较广, 来
自中国 14个省、自治区; H_2单倍型的 3个品种全部
是育成品种, 来自中国的浙江和湖北; H_3 单倍型的
30个品种中, 除 2份国外大麦种质外, 其余均为中国
青藏高原及其相邻省区的参试品种, 包括西藏 8个、
四川 2个、云南 1个、甘肃 3个; H_4和 H_5单倍型
各仅包括 1个品种。为分析不同 Amy6-4单倍型大麦
的特征特性, 了解 5种单倍型在不同类型大麦中的分
布, 根据表 1数据和图 4的聚类结果归纳出表 4。可
以看出, H_1单倍型包括的 23份种质, 全部为皮大麦,
11个春性、12个冬性, 且此单倍型中来自南方的品种,
多为冬性或半冬性品种; H_2单倍型的 3份种质也均
是皮大麦, 且为育成品种; H_3单倍型的 30份材料包
括春性 23 份、冬性 7 份, 裸大麦 17 份、皮大麦 13
份 ; 单倍型 H_4 和 H_5 分别为山东六棱冬大麦
(ZDM368)和山西的二棱春大麦品种(ZDM119)。
2.4 连锁不平衡分析
利用 58份大麦材料 Amy6-4基因的重测序数据,
分析了该基因碱基序列中 7个 SNP位点间的连锁不
平衡关系, 只有位于第 2587 bp的 SNP3(G/A)位点与
其他 6 个 SNP 位点无连锁不平衡(LD)关系(图 5)。
其余 6 个 SNP 位点相互之间, 均存在显著的 LD 关
系(R2=0.82~1.00)。
2.5 Amy6-4等位变异连锁不平衡程度
LD衰减程度对关联分析具有很大的影响。在对
Amy6-4基因第 3外显子和 3′ UTR区的 SNP多态性
位点 LD 分析的基础上, 进一步以 r2作为衡量指标
检测该区域的 LD 衰减程度, 在 Amy6-4 基因的多态
性区域未检测到明显的 LD衰减, r2值在 0.8~1.0之间
(图 6)。表明在该基因的多态性区域内存在较高的
第 2期 姜晓东等: Amy6-4基因遗传多样性及其与 α-淀粉酶活性的关联分析 211



图 4 依据 58份大麦种质 Amy6-4基因 SNP多样性的系统发育树
Fig. 4 Phylogennetic tree of 58 barley entries according to
SNP diversity on Amy6-4 locus

图 5 Amy6-4基因内的多态性位点(SNP)的连锁不平衡关系
Fig. 5 Linkage disequilibrium of the Amy6-4 gene revealed in
different sets of barley varieties by SNP-analysis
对角线上为 R2值, 对角线下为 P值; 矩形表示 SNP间的相关性。
R2 values and P-values are shown in the upper and lower diagonal,
respectively. The rectangles show correlation between SNP combi-
nations.

图 6 Amy6-4基因 SNP位点间 r2值随遗传距离衰减散点图
Fig. 6 Attenuation of r2 values between SNP pairs along with
genetic distance on Amy6-4 locus

表 4 Amy6-4基因的单倍型及其相应的不同特性样品数统计
Table 4 Haplotype patterns of Amy6-4 gene and their affiliation to samples based on different barley traits
多态性 SNP Polymorphisic SNP (5′–3′) 大麦类型 Type of barley 单倍型
Haplotype SNP1 SNP2a SNP3 SNP4a SNP5 SNP6 `SNP7 2r-s 6r-s 2r-W 6r-W N C
H_1 G (Arg) A (Asn) G (Gly) C (Ala) A C A 7 4 1 11 — 23
H_2 C (Arg) G (Ser) A (Gly) G (Gly) G G G 2 — — 1 — 3
H_3 C (Arg) G (Ser) G (Gly) G (Gly) G G G 2 21 — 7 17 13
H_4 C (Arg) A (Asn) G (Gly) G (Gly) A C G — — — 1 — 1
H_5 G (Arg) G (Asn) G (Gly) G(Gly) G C G 1 — — — — 1
SNP位点后括号内字母表示编码的氨基酸; a表示该多态性位点编码的氨基酸发生替换。大麦类型中 2r-S、6r-S、2r-W和 6r-W分
别代表二棱春大麦、六棱春大麦、二棱冬大麦和六棱冬大麦; N和 C分别代表裸大麦和皮大麦。
Amino acids coded by the SNP are shown in the brackets follwing the SNP site; SNP marked with a indicates substititution of amino acid
residue on this locus. Barley types 2r-S, 6r-S, 2r-W, and 6r-W represent two-rowed spring barley, six-rowed spring barley, two-rowed winter
barley, and six-rowed winter barley, respectively; and types N and C represent naked and covered barley, respectively.

212 作 物 学 报 第 40卷


锁不平衡度, 适宜进行基于候选基因的关联分析。
2.6 Amy6-4 序列多样性与 α-淀粉酶活性间的关
联分析
在Amy6-4基因序列多态性LD及其衰减程度分
析的基础上 , 使用 TASSEL 软件的一般线性模型
(GLM)程序, 将群体结构分析中 K=6 时, 各参试样
品 Q值作为协变量, 分别对每个 SNP和单倍型与实
验测定的 58 份大麦种质的 α-淀粉酶活性(表 1)进行
回归分析。结果显示, 各个 SNP位点和各种单倍型,
均与 α-淀粉酶活性间无关联性(P>0.05), 表明本研
究检测的这些发生在 α-淀粉酶编码基因上的等位变
异均对酶活性没有影响。
3 讨论
本研究利用58份不同地理来源的大麦种质, 对编
码高等电点 α-淀粉酶的功能基因 Amy6-4 进行了重
测序和序列比对分析, 只在该基因编码区的第 3 外
显子和 3′ UTR区发现 7个 SNP位点, 其中 4个在
编码区, 3 个在 3′ UTR, 构成 5 种单倍型, 主要是
H_3和 H_1单倍型。属于 H_1单倍型的 23份材料
全部为皮大麦, H_3单倍型共 30份材料, 多数为中
国青藏高原及其邻近省区的大麦种质。据此推测单
倍型 H3 与大麦的皮裸性之间及其与青藏高原大麦
之间, 可能存在着某些必然的联系, 值得进一步研
究。通过对 SNP进行氨基酸序列比对, 发现由外显
子上 2 个同义突变的单核苷酸编码的氨基酸, 分别
位于 α-淀粉酶蛋白质结构域 B的 α螺旋(SNP1)及底
物结合结构域 C (SNP3)。关联分析结果表明, 所发
现的 7个 SNP和 5种单倍型, 均与 α-淀粉酶活性无
关。Robert等[15]研究发现, 由品种间单核苷酸变异
SNP2或 SNP4引发的, α-淀粉酶蛋白质结构域 B和
结构域 C上的氨基酸变化, 对酶蛋白的二级结构并
没有影响。本研究结果与 Matthies等[16]的报道有相
近之处, 即位于 2487 bp的 SNP3和单倍型 H_2均
与 α-淀粉酶活性无关, 但 Matthies还发现, SNP3和
单倍型 H_2与麦芽品质性状, 如浸出率、脆性、可
溶性蛋白和黏度等显著关联。根据 Bozonnet 等[17]
对蛋白结构的研究结果, SNP3 位点突变所编码的
同义突变甘氨酸(Gly)残基距离在结合麦芽低聚糖
中起关键作用的氨基酸残基(Tyr380)只相隔 3 个氨
基酸残基。本研究中, LD分析结果表明, 只有位于
2587 bp的 SNP3 (G/A)位点与其他 6个 SNP位点之
间, 没有连锁不平衡关系, 表明该位点处于自由状
态。TajiIma’s D检验结果表明, Amy6-4基因序列变
异为选择中性, 在进化过程中并未经受选择作用的
影响。这一结果与中国 20世纪 80年代以前大麦育
种实践高度相符。本研究绝大多数供试材料为国内
种质, 仅有 2份国外材料, 在 56份国内材料中包括
5 份育成品种、5 份野生大麦和 46个地方品种, 其
中 5 个育成品种全部为 20 世纪 60 年代中末至 70
年代初育成。由于 α-淀粉酶活性不是直观性选择性
状, 且啤酒大麦育种中尚未被提出, 我国早期大麦
育种未对该特性加以选择, 因而这 5 个育成品种与
野生大麦和地方品种表现出相同 Amy6-4 基因中性
选择特点。20 世纪 80 年代以后, 大麦育种目标有
了变化, 但由于本试验中未包括近年来育成啤酒大
麦品种, 是否存在对 Amy6-4 基因的人工选择有待
进一步探讨。
在本研究中, 尽管发现大麦品种间α-淀粉酶活
性存在较大变异, 但其编码基因Amy6-4的多态性位
点与酶活性间不存在关联性, 说明Amy6-4基因变异
对于α-淀粉酶活性影响较小。这与Yang等[18]对限制
性糊精酶结构基因的多态性变异与其酶活性之间的
关联分析结果一致。β-淀粉酶的形成过程与α-淀粉酶
和限制性糊精酶不同, β-淀粉酶主要是在种子发育
过程中合成, 而α-淀粉酶和限制性糊精酶均是在种
子发芽过程中合成的[19]。α-淀粉酶活性作为复杂的
数量性状, 具有复杂的遗传机制。在种子发芽过程
中, α-淀粉酶基因的表达不仅受到赤霉素(GA)和脱
落酸(ABA)的拮抗作用, 而且受到各种调控因子如
受赤霉素调控的转录因子GAmyb、ABA诱导的蛋白激
酶pKABA以及WRKY38等转录因子的共同作用[20-23]。
并且α-淀粉酶在分泌前还要经受一系列的转录后调
控, 即α-淀粉酶分泌途径上受到众多因素如GA、细胞
内的Ca2+浓度和代谢产生的糖类等因素的调节[24-27]。
许多基于双亲杂交后代群体的连锁作图分析和基于
LD的全基因组关联分析, 对影响α-淀粉酶活性QTL
的研究结果表明 , 除大麦3H染色体外 , 大麦其他6
条染色体上均分布有影响α-淀粉酶活性的QTL [28-31],
进一步表明α-淀粉酶活性是受多基因控制的数量性
状。但综合已有对α-淀粉酶活性的定位结果, 认为大
麦染色体5H末端的端粒区域可能存在控制α-淀粉
酶活性的主效调控基因。可以作为今后研究影响α-
淀粉酶活性的主要QTL区域 , 进而可能在此区域
通过精细定位 , 发掘出α-淀粉酶活性的调控因子
或主效QTL。
第 2期 姜晓东等: Amy6-4基因遗传多样性及其与 α-淀粉酶活性的关联分析 213


4 结论
Amy6-4基因的第 3外显子和 3′ UTR区共存在 7
个 SNP位点, 其中编码区有 4个, 3′ UTR区有 3个,
共构成 5种单倍型。单倍型 H_3的出现频率最高, 其
次为单倍型 H_1, 其余 3 种频率很低。Amy6-4 基因
的 7个 SNP及其构成的 5种单倍型均与 α-淀粉酶活
性无关。
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