全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(5): 627632 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本项目由河北省自然科学基金项目(C2014301005)资助。
This study was supported by the Natural Science Foundation of Hebei Province, China (C2014301005).
* 通讯作者(Corresponding authors): 柴建芳, E-mail: chai87652130@163.com; 王海波, E-mail: nkywanghb@163.com
Received(收稿日期): 2015-09-28; Accepted(接受日期): 2016-03-02; Published online(网络出版日期): 2016-03-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160311.1605.010.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00627
ω-黑麦碱基因沉默对小麦 1B/1R易位系加工品质的影响
柴建芳* 王海波* 马秀英 张翠绵 董福双
河北省农林科学院遗传生理研究所 / 河北省植物转基因中心, 河北石家庄 050051
摘 要: ω-黑麦碱是造成小麦 1B/1R 易位系加工品质差的一个重要因素, 为探索解决这一问题, 构建了 ω-黑麦碱基
因沉默表达载体, 并通过农杆菌介导转化小麦品种金禾 9123, 获得 3个 T0代转基因植株, 再经连续的扩繁和 PCR检
测, 获得纯合转基因 T4 代株系。酸性 PAGE 检测结果表明, 这些纯合转基因株系中 ω-黑麦碱的总表达量平均下降
53%。这些 ω-黑麦碱基因沉默的转基因株系的面筋指数、沉降值和稳定时间均显著提高, 而其农艺性状, 如株高、
穗粒数、千粒重和小区产量, 均没有受到不良影响, 说明沉默 ω-黑麦碱基因可以在不影响产量的前提下提高小麦
1B/1R易位系的加工品质。
关键词: 小麦 1B/1R易位系; 黑麦碱; RNA干扰; 基因沉默; 加工品质
Effect of ω-Secalin Gene Silencing on Processing Quality of Wheat 1B/1R
Translocation Line
CHAI Jian-Fang*, WANG Hai-Bo*, MA Xiu-Ying, ZHANG Cui-Mian, and DONG Fu-Shuang
Genetics and Physiology Institute, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Plant Genetic Engineering Center of Hebei Province,
Shijiazhuang 050051, China
Abstract: Omega-secalin is an important factor for the poor processing quality of wheat 1B/1R translocation lines. In this study,
an expression vector of silencing ω-secalin gene was constructed and transferred into wheat variety Jinhe 9123 via Agrobacterium
tumefaciens strain EH105. The three T0 transgenic plants obtained were consecutively multiplied after PCR validation until the T4
lines. Acid-PAGE assay indicated that total amount of ω-secalins in the transgenic lines decreased 53% on average compared with
that in their respective control. In the three homozygous transgenic lines, gluten index, precipitation value, and stabilization time
increased significantly, whereas the agronomic traits, such as plant height, grain number per spike, 1000-grain weight and plot
yield, had no significant changes compared with those in the wild type. These results suggest that silencing ω-secalin genes can
improve the processing quality of wheat 1B/1R translocation lines on the premise of not affecting grain yield.
Keywords: Wheat 1B/1R translocation line; Secalin; RNAi; Gene silencing; Processing quality
小麦 1B/1R 易位系具有抗性好、高产和适应性
广等优点, 在我国大面积推广的高产小麦品种中占
有很大的比例[1]。目前, 来自黑麦品种 Petkus 的抗
病基因已失去抗性[2-3], 新的非 Petkus来源的抗病小
麦 1B/1R易位系已陆续培育成功[4-5], 显示 1B/1R易
位系仍将在未来的小麦育种和生产上发挥重要作
用。但是, 小麦 1B/1R 易位系普遍存在加工品质差
的问题, 主要表现为面筋强度低、耐揉性差和面团发
黏, 对面包和面条加工品质都有明显的不良影响[6-7]。
研究认为, 小麦 1B/1R易位系 1RS染色体上的 ω-黑
麦碱基因是导致面团加工品质变差的一个重要原因[8],
因此 , 封阻 ω-黑麦碱基因的表达可能是改善小麦
1B/1R易位系加工品质的一条有效途径。
为封阻 ω-黑麦碱基因的表达, 利用 ph基因诱导
同源染色体重组和利用 1R 染色体的单体附加系自交
已创造了不含 ω-黑麦碱基因的小麦 1B/1R易位系[9-10],
但高产和抗逆等有利基因是否会随 ω-黑麦碱基因一
同丢失, 目前尚不清楚。
628 作 物 学 报 第 42卷
RNA 干扰(RNAi)是近年来发展起来的一项新
技术[11-12], 可用来沉默多个序列高度相似基因的表
达, 在小麦上已成功应用[13-14]。ω-黑麦碱基因是一
个包括多个成员的基因家族 , 不同家族成员之间
DNA 序列高度相似[15], 适合用 RNA 干扰封阻 ω-黑
麦碱基因的表达。本研究旨在明确 ω-黑麦碱基因沉
默是否会对小麦重要农艺性状造成影响, 该基因沉
默技术能否应用于小麦 1B/1R 易位系加工品质的遗
传改良。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1B/1R 易位系兰考 906 和非 1B/1R 易位系中国
春用于克隆构建表达载体的相关基因片段 , 1B/1R
易位系金禾 9123 用于遗传转化。金禾 9123 由本研
究团队选育, 2008 年通过黄淮北片审定, 2012 年通
过黄淮南片审定, 但该品种加工品质比较差(农业部
农作物品种审定第 1877号公告)。
从兰考 906花后 15 d的籽粒中提取总 RNA, 用
植物 RNA 提取及第一链 cDNA 合成试剂盒(北京全
式金生物技术有限公司), 按说明书程序反转录合成
第一链 cDNA。
1.2 ω-黑麦碱基因 RNA干扰表达载体的构建
ω-黑麦碱基因 RNA 干扰片段由正向 ω-黑麦碱
基因片段、含内含子的 DNA 片段和反向 ω-黑麦碱
基因片段 3 部分依次连接组成。根据我们[15]报道的
ω-黑麦碱基因不同成员编码区的序列, 选取编码区
5′相对保守的区段设计引物 , 引物序列为 P3-1:
5′-ttcccgggccttcctcatctttgtcct-3′ (下画线部分为 Sma I
酶切位点); P4-1: 5′-taggatccgctctggtctctggggttg-3′ (下
画线部分为 BamH I酶切位点)。以兰考 906的 cDNA
为模板进行 PCR扩增, 扩增参数为 94℃ 4 min; 94
℃ 45 s, 65℃ 45 s, 72℃ 1 min, 30个循环; 72℃ 7
min。对 PCR 产物进行克隆测序, 选取其中一个与
Chai等[15]报道的黑麦碱序列完全一致的克隆作为载
体构建黑麦碱基因的正向片段。
设计反 P4-1/反 P3-1 引物对 , 前者序列为
5′-AATTTCTAgAAgCTCTggTCTCTggggTTg-3′ (下
画线部分为 Xba I 酶切位点 ), 后者序列为
5′-AATAgAgCTCCCTTCCTCATCTTTgTCCT-3′ (下
画线部分为 Sac I 酶切位点)。以上述含正向黑麦碱
基因片段的克隆为模板进行 PCR 扩增, 扩增参数相
同获得反向的黑麦碱基因片段。
利用 P内 1/P内 2引物对, 从小麦的蜡质蛋白基
因扩增携带内含子的 DNA片段, 引物序列 P内 1为
5′-AATTggATCCggCggCCTCggCgACgTCCTCg-3′
(下画线部分为 BamH I 酶切位点 ); P 内 2 为
5′-AATTTCTAgAACCCggTgACCgTTggCCTgCA-3′
(下画线部分为 Xba I 酶切位点)。以中国春基因组
DNA为模板进行 PCR扩增, 扩增参数与扩增正向黑
麦碱基因片段时相同, 扩增后对产物进行克隆测序,
选取与Murai等[16]报道的小麦Waxy基因第一内含子
序列完全一致的片段构建载体。
在用 pBS-T 克隆试剂盒进行克隆时会出现一些
没有插入片段的蓝斑, 选择一个蓝斑摇菌提质粒得
到闭环的 pBS-T质粒载体, 该载体具有 Sma I–BamH
I–Xba I–Sac I结构的多克隆位点。以该质粒载体为
中间载体, 依次通过 Sma I–BamH I双酶切、BamH
I–Xba I双酶切和 Xba I–Sac I双酶切把正向的黑麦碱
基因片段、含内含子的 DNA片段和反向的黑麦碱基
因片段连接起来, 再用 Sma I/Sac I 双酶切, 把植物
双元表达载体 pAHC25中的 Gus基因替换为已连接
好的黑麦碱基因 RNA 干扰片段“正向黑麦碱基因片
段–内含子片段–反向黑麦碱基因片段”, 得到抗性筛
选基因为 Bar 基因的黑麦碱基因沉默表达载体
pAHC25-Sec。为得到适于农杆菌转化的黑麦碱基因
沉默表达载体, 进一步用 Hind III/EcoR I 部分双酶
切上述 pAHC25-Sec表达载体, 回收 6.1 kb的片段并
将 其 与 同 样 双 酶 切 的 农 杆 菌 表 达 载 体
pCAMBIA0390 连接, 得到可用于农杆菌转化的黑
麦碱基因沉默表达载体 pCAMBIA0390-Sec (图 1),
该表达载体的抗性筛选基因为 Bar基因。
图 1 黑麦碱沉默表达载体 pCAMBIA0390-Sec结构示意图
Fig. 1 Schematic diagram of pCAMBIA0390-Sec expression vector
第 5期 柴建芳等: ω-黑麦碱基因沉默对小麦 1B/1R易位系加工品质的影响 629
1.3 农杆菌转化
取金禾 9123 开花后 12~15 d 的籽粒, 先用 70%
酒精溶液浸泡 1 min, 1%次氯酸钠溶液消毒 10 min,
再以无菌水冲洗 4次; 在无菌条件下用手术刀片挑取
幼胚盾片朝上放到愈伤组织诱导培养基 SD2 上(MS
培养基+1 mg L–1 VB1+150 mg L–1天门冬酰胺+2 mg
L–1 2,4-D+30 g L–1蔗糖+3 g L–1植物胶, pH 5.8), 于 25
℃黑暗条件下诱导愈伤组织, 4~10 d后进行转化。
将预培养的幼胚愈伤组织放入含有黑麦碱沉默
表达载体的农杆菌 EH105 侵染液(1/10MS 无机盐
+3%蔗糖+1%葡萄糖+100 mol L–1乙酰丁香酮, pH
5.4, 菌液OD600值为 0.5)侵染 30 min, 然后于装有无
菌滤纸的平皿中 23℃黑暗条件下共培养 2~3 d, 再
将其转移到 SD2+300 mg L–1羧卞青霉素的抑菌培养
基上恢复培养 2 周, 及分化培养基(1/2MS+2%蔗糖
+300 mg L–1羧卞青霉素+5 mg L–1玉米素+3~5 mg
L–1 Bialaphos) 25℃光照条件下分化筛选 2周, 将抗
Bialaphos (Bar 基因抗性)的再生芽转移到 1/2MS+
2%蔗糖+0.3 mg L–1 IAA+0.5 mg L–1多效唑培养基
上壮苗 , 再生植株生长到苗高 6~8 cm、根系较好
时移入培养钵 , 幼苗在 4~8℃下春化 20 d 后移栽
到温室。
1.4 小麦抗性再生植株的分子检测及 Basta涂叶
检测
当小麦抗性再生植株生长至 4~5 片叶时 , 用
CTAB 法提取叶片的基因组 DNA 进行 PCR 检测。
检测引物为ω-sec-P3 (5′-ccttcctcatctttgtcctc-3′)和 P内
2 (5′-acccggtgaccgttggcctgca-3′), 扩增区域为正向黑
麦碱基因片段加上内含子片段 , 扩增片段大小为
548 bp。扩增程序为 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 60℃ 30
s, 72℃ 1 min, 35个循环; 72℃ 10 min。
用记号笔在植株倒数第 2片叶距叶尖 1 cm处画
上横线, 用 100 mg L–1 Basta溶液双面涂抹横线到叶
尖的部位, 1周后观察涂抹部位颜色变化情况。
1.5 种子醇溶蛋白与高低分子量麦谷蛋白的电
泳检测及其统计分析
采用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)检测种
子醇溶蛋白[17], 采用 SDS-PAGE 检测高、低分子量
麦谷蛋白[18]。用 Image J 149v软件量化处理醇溶蛋
白电泳中 ω-黑麦碱条带的亮度, 并用 DPS v3.01 软
件统计分析。
1.6 转基因小麦的农艺性状与加工品质测定及
其统计分析
将得到的 3个 T4代纯合转基因株系及其受体对
照金禾 9123 按随机区组设计进行小区产量比较试
验, 每个小区种 5行, 行长 4 m, 每行播 240粒种子,
行距 30 cm, 3次重复, 收获前从每小区随机选 20个
茎秆调查株高和穗粒数, 收获后称取小区产量和千
粒重, 委托河北省农作物品种品质检测中心测定蛋
白质含量、吸水率、湿面筋含量、面筋指数、Zeleny
沉降值和稳定时间。试验结果选用 DPS v3.01 软件
统计分析。
2 结果与分析
2.1 阳性转基因植株的获得
通过农杆菌介导的遗传转化, 得到金禾 9123的
10个 T0代抗性再生植株, 其中 3株为目的基因 PCR
阳性(图 2)。用 100 mg L–1 Basta溶液涂叶处理表明,
PCR 阳性植株叶片涂抹部位颜色没有变化, 而其他
7 株叶片涂抹部位变黄, 从而排除了农杆菌污染导
致 PCR 假阳性的可能性, 说明目的基因已整合到 3
个小麦植株的基因组中。
图 2 T0代转基因植株的 PCR检测
Fig. 2 Electrophoregram of PCR products from T0 putative
transgenic wheat plants
M: DL2000; –: 未转化受体品种(阴性对照); +: 阳性质粒;
1~10: T0代转基因植株。
M: DL2000; –: non-transgenic recipient (negative control);
+: positive control; 1–10: T0 putative transgenic wheat plants.
2.2 纯合转基因株系的获得与 ω-黑麦碱基因的
表达
T0 代阳性转基因植株经连续自交和 PCR 检测,
从 T2代分离群体中获得纯合转基因株系, 经过进一
步的扩繁和 PCR 检测, 转基因性状能够稳定遗传,
最终得到 3个 T4代纯合转基因株系(K1-5、K1-15和
K1-16), 并且收获了足够种子用于小区产量比较试
验。酸性 PAGE 检测结果显示, 在 4 个 ω-黑麦碱条
带中, 除表达量最弱的条带 2 变化不明显外, 转基
因株系的其他 3 个黑麦碱条带的表达量均显著降低
(图 3), 转基因株系ω-黑麦碱基因的总表达量为受体
品种 ω-黑麦碱基因总表达量的 47.5% (表 1)。其他
非黑麦碱条带没有出现一致变弱的情况, 说明黑麦
碱基因沉默具有较高的特异性。
630 作 物 学 报 第 42卷
表 1 转基因小麦株系及其受体对照种子中不同 ω-黑麦碱的表达量比较
Table 1 Comparison of ω-secalins in seeds of wheat transgenic lines and the non-transgenic recipient
ω黑麦碱条带
ω-secalin band
受体对照
Recipient control (%)
转基因株系
Transgenic lines (%)
转基因株系/受体对照比值
Transgenic lines/recipient control ratio
1 43.2 24.6* 0.569
2 4.8 4.8 0.995
3 36.4 15.4** 0.424
4 15.6 2.7** 0.170
合计 Total 100.0 47.5
*和**分别表示转基因株系与受体对照之间在 P < 0.05和 P < 0.01水平差异显著。
* and ** indicate significant difference between the transgenic line and the recipient control at P < 0.05 and P < 0.01, respectively.
图 3 转基因小麦种子中 ω黑麦碱的酸性 PAGE检测
Fig. 3 Detection of ω secalin in transgenic wheat seeds by acid
PAGE
CK: 受体对照; A~C: 3个纯合转基因株系;
1~4: 4条 ω-黑麦碱条带。
CK: negative control; A–C: three pure transgenic lines;
1–4: four ω-secalin bands.
为了解 ω-黑麦碱基因表达沉默对麦谷蛋白基因
表达的影响 , 对3个纯合转基因株系及其对照进行
了高低分子量麦谷蛋白的电泳检测, 结果转基因株
系麦谷蛋白各条带的表达量与对照相比没有明显变
化(图4), 说明 ω-黑麦碱基因沉默没有影响麦谷蛋白
基因的表达。
图 4 转基因小麦种子中麦谷蛋白的 SDS-PAGE检测
Fig. 4 Detection of glutenin subunits in transgenic wheat seeds
by SDS-PAGE
CK: 受体对照; 1~3: 3个纯合转基因株系。
CK: negative control; 1–3: three homozygous transgenic lines.
2.3 转基因小麦的加工品质
3个转基因株系的籽粒蛋白质含量、吸水率和湿
面筋含量与受体对照没有显著差异, 但面筋指数明
显提高, 其中2个株系与对照达到显著差异, 沉降值
和稳定时间也比对照显著提高(表2), 说明 ω-黑麦碱
基因的沉默显著提高了金禾9123的加工品质。
2.4 转基因小麦的农艺表现
3个转基因株系的株高、穗粒数、千粒重和小区产量
与对照非常接近(表 3), 株系间差异均不显著, 说明沉默
黑麦碱基因的表达没有影响转基因株系的农艺表现。
表 2 转基因小麦及其受体品种金禾 9123的籽粒加工品质
Table 2 Grain processing quality of transgenic lines and their receptor
株系
Line
蛋白质含量
Protein content
(%)
吸水率
Water absorption rate
(%)
湿面筋
Wet gluten content
(%)
面筋指数
Gluten index
沉降值
Sedimentation
value (mL)
稳定时间
Stabilization time
(min)
对照 Control 14.7±0.4 a 61.7±0.2 a 30.9±1.5 a 36.7±2.3 a 17.5±0.8 a 1.2±0.3 a
K1-5 14.4±0.3 a 62.6±0.6 a 27.6±1.3 a 43.0±3.6 ab 21.6±0.6 b 2.6±0.3 b
K1-15 14.7±0.0 a 62.2±1.9 a 29.4±0.9 a 48.0±5.2 b 23.7±1.2 bc 2.5±0.3 b
K1-16 14.7±0.1 a 61.7±0.6 a 31.5±1.3 a 45.7±1.2 b 25.0±1.1 c 2.4±0.2 b
同一列中, 数据后不同字母表示株系间差异显著(P < 0.05)。
Values followed by different letters in the same column are significantly different at P < 0.05.
第 5期 柴建芳等: ω-黑麦碱基因沉默对小麦 1B/1R易位系加工品质的影响 631
表 3 转基因小麦及其受体品种金禾 9123的农艺性状
Table 3 Agronomic traits of transgenic lines and their receptor
株系
Line
株高
Plant height (cm)
穗粒数
Grain number per spike
千粒重
Thousand-grain weight (g)
小区产量
Plot yield (t hm–2)
对照 Control 78.7±1.2 34.9±1.0 49.7±0.2 7.0±0.3
K1-5 77.0±1.0 34.9±0.9 49.0±0.2 6.9±0.1
K1-15 76.7±0.6 34.4±1.0 49.9±0.4 6.7±0.2
K1-16 80.7±1.2 36.4±0.1 49.2±0.4 6.9±0.4
3 讨论
1B/1R 易位系金禾 9123 是一个高产品种, 加工
品质较差, 不利于推广应用。本研究尝试利用 ω-黑
麦碱基因沉默技术来改善金禾 9123的加工品质, 发
现 ω-黑麦碱基因沉默在不影响产量的前提下确实能
显著提高金禾 9123的加工品质。在本研究中, ω-黑
麦碱基因的沉默效率平均为 52.5%, 沉默效率不高,
可能与使用的Ubiquitin启动子有关, Gil-Humanes等[19]
用种子特异性启动子构建的沉默表达载体转化小麦
取得了更高程度的沉默效果。目前, 我们也构建了
由小麦种子特异性启动子驱动的 ω-黑麦碱基因沉默
表达载体, 并通过基因枪法共转化小麦 1B/1R 易位
系科农 199, 得到了沉默效果更好的转基因株系, 其
加工品质提高的幅度更为显著, 相关结果将另文报
道。由此推测, 通过沉默 ω-黑麦碱基因的表达可以
改良小麦 1B/1R易位系的品质。
ω-黑麦碱是一类高度水溶性的蛋白[20]。本研究
中, 转基因株系的湿面筋含量没有提高, 麦谷蛋白
各组分的表达量也没有明显变化, 而转基因株系的
面筋指数却显著提高, 说明转基因株系用与对照相
同量的面筋产生了更多的不溶性面筋聚合体。这暗
示 ω-黑麦碱对不溶性面筋聚合体的形成产生了不良
影响, 但 ω-黑麦碱如何影响不溶性面筋聚合体的形
成, 值得进一步研究。
本研究得到的 ω-黑麦碱基因沉默株系与以往报
道的 ω-黑麦碱基因缺失材料[9-10]有不同特点。据报
道, 小麦 1B/1R 易位系的 1RS 上有一个控制根系大
小的基因, 且该基因位于 ω-黑麦碱基因的附近[21]。
在文献报道的 ω-黑麦碱基因缺失材料[9-10]中, 控制
根系大小的基因是否已随 ω-黑麦碱基因区段一同丢
失尚不清楚, 因为缺乏相关农艺性状的报道, 而 ω-
黑麦碱基因沉默株系由于不涉及染色体区段缺失 ,
不会导致邻近的根系大小相关基因的丢失, 本研究
中 ω-黑麦碱基因沉默株系的农艺性状没有受到不良
影响恰好证明这一点。另外, 基因沉默性状作为一
个显性性状[22-23], 可在不同 1RS 来源的小麦 1B/1R
易位系上应用, 不会因为 ω-黑麦碱基因缺失材料上
的抗性基因失去抗性而失去应用价值, 其应用范围
应更广。
4 结论
利用 RNA 干扰技术沉默 ω-黑麦碱基因的表达,
显著提高了金禾 9123的加工品质, 且未对其重要农
艺性状造成不良影响, 是改善小麦 1B/1R 易位系加
工品质的有效手段。
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