全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(9): 13431352 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08004-002), 国家自然科学基金项目(31171578), 黑龙江省高校科技创新团队
建设计划项目(2011TD055)和国家基础科学人才培养基金项目(J1210069)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 朱延明, E-mail: ymzhu@neau.edu.cn, Tel: 18645035310
第一作者联系方式: E-mail: a09080003@163.com, Tel: 18045476676
Received(收稿日期): 2015-01-20; Accepted(接受日期): 2015-05-04; Published online(网络出版日期): 2015-06-03.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150603.0901.006.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.01343
野生大豆碳酸盐胁迫应答基因 GsMIPS2 的克隆及功能分析
陈 晨 1 孙晓丽 2 刘艾林 1 端木慧子 1 于 洋 1 肖佳雷 1 朱延明 1,*
1 东北农业大学生命科学学院, 黑龙江哈尔滨 150030; 2 黑龙江八一农垦大学农学院, 黑龙江大庆 163319
摘 要: 为挖掘野生大豆(Glycine soja L. G07256)耐碳酸盐关键功能基因, 利用前期高通量转录组测序数据, 从构建
的碳酸盐胁迫基因表达谱中, 选取了一个碳酸盐胁迫下显著上调表达的肌醇-1-磷酸合酶类基因。采用同源克隆的方
法, 获得该基因的全长 cDNA, 命名为 GsMIPS2。实时荧光定量 PCR 结果显示该基因受碳酸盐胁迫诱导表达, 并且
其表达量具有组织特异性。将 GsMIPS2基因转化拟南芥, 并结合拟南芥中 T-DNA插入突变体 atmips2来验证其耐碳
酸盐功能。结果表明, 碳酸盐胁迫条件下, GsMIPS2 超量表达拟南芥种子萌发率显著高于野生型, 而拟南芥突变体
atmips2种子萌发率显著低于野生型。上述结果表明, GsMIPS2基因在植物应答碳酸盐胁迫过程中起重要作用。
关键词: 野生大豆; GsMIPS2基因; 肌醇-1-磷酸合成酶; 碳酸盐胁迫
Cloning and Functional Analysis of Glycine soja Bicarbonate Stress Responsive
Gene GsMIPS2
CHEN Chen1, SUN Xiao-Li2, LIU Ai-Lin1, DUAN-MU Hui-Zi1, YU Yang1, XIAO Jia-Lei1, and ZHU
Yan-Ming1,*
1 College of Life Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2 College of Agronomy, Heilongjiang Bayi Agricultural Univer-
sity, Daqing 163319, China
Abstract: To identify the key functional genes in response to bicarbonate stress in Glycine soja L. G07256, we constructed a gene
expression profile under bicarbonate treatment using high throughput RNA-seq data, from which we selected a myo-inositol-
1-phosphate synthase gene whose expression was significantly induced by bicarbonate stress. By homology-based cloning, we
acquired its full length cDNA and termed as GsMIPS2. The results of quantitative real-time PCR demonstrated the bicarbonate
stress induced expression of GsMIPS2 and its tissue expression specificity. We also verified the function of GsMIPS2 in bicarbon-
ate responses by using the GsMIPS2 transgenic Arabidopsis combined with the T-DNA insertion line atmips2. We revealed that
the germination rate of GsMIPS2 overexpression lines was significantly higher, while that of atmips2 mutant line was much lower
than that of wild type under bicarbonate stress. These results indicate the positive role of GsMIPS2 in plant bicarbonate stress
responses.
Keywords: Glycine soja; GsMIPS2; Myo-inositol-1-phosphate synthase; Bicarbonate stress
由碳酸盐造成的盐碱逆境严重影响植物的生长
和发育, 是限制作物产量和品质的重要因素[1]。土壤
盐碱化问题在世界范围内广泛存在[2]。因此, 挖掘耐
盐碱关键基因, 应用基因工程技术手段培育耐盐碱
作物品种, 对开发利用盐碱地资源、增加耕地面积,
具有重要的理论和现实意义 [3]。野生大豆(Glycine
soja L. G07256)是栽培大豆的祖先种, 自然环境下
在遗传方面未受到人为选择的影响, 积累了丰富的
耐逆基因资源, 因此成为克隆耐盐碱胁迫基因的理
想材料[4]。
肌醇是生物体内一种重要的物质, 参与生长调
节、激素调节及信号传导等过程[5], 并形成各种肌醇
衍生物。有研究表明, 肌醇衍生物松醇能够通过保
护细胞结构、减少活性氧积累等方面应答非生物胁
1344 作 物 学 报 第 41卷
迫[6]。肌醇-1-磷酸合成酶(MIPS: EC5.5.1.4)是肌醇合
成的限速酶, 它通过将 D-葡萄糖-6-磷酸转化为 L-
肌醇-1-磷酸合成肌醇。Das-Chatterjee 等[7]和 Patra
等[8]分别克隆了野生旱稻(Porteresia coarctata)的肌
醇-1-磷酸合酶基因(PcINO1)并将其在烟草中超量表
达, 从而显著提高了转基因植物的耐盐性; 鹰嘴豆
(Cicer arietinum)肌醇-1-磷酸合成酶基因(CaMIPS2)
在拟南芥中异源表达可显著提高其耐盐、耐旱性[9];
平滑网茅(Spartina alterniflora)肌醇-1-磷酸合成酶基
因(SaINO1)在拟南芥中超量表达, 可以通过保护光
合系统 II 提高植物耐盐性[10]。Hegman 等[11]分离鉴
定了大豆MIPS蛋白编码基因GmMIPS, 发现其参与
种子发育过程。然而, Kido 等[12]在干旱条件下分析
大豆高通量串联基因表达发现, 大豆的 MIPS 基因
并不受干旱诱导表达。
尽管目前对于 MIPS 基因耐盐方面的研究取得
了一定进展, 但对其应答碳酸盐胁迫功能的研究仍
然十分匮乏。本研究从实验室前期构建的野生大豆
(Glycine soja L. G07256)碳酸盐胁迫下高通量转录
组测序数据中, 选取了一个肌醇-1-磷酸合成酶类基
因 GsMIPS2, 结合超量表达拟南芥及拟南芥突变体,
研究该基因在植物应答碳酸盐胁迫中的功能, 旨在
为作物耐碳酸盐转基因育种提供基因资源并奠定理
论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
耐盐碱野生大豆(Glycine soja L. G07256)由吉林
省农业科学院大豆研究所王跃强研究员提供; 野生型
拟南芥(哥伦比亚生态型)及突变体(SALK_031685C)购
自 Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC, Not-
tingham, UK)。大肠杆菌 DH5α、根瘤农杆菌 GV3101
和植物表达载体 pCAMBIA3300 35Su均由东北农业大
学生命科学学院植物生物工程研究室保存。
1.2 野生大豆 GsMIPS2 全长 cDNA 的克隆及序
列分析
利用同源克隆法获得野生大豆 GsMIPS2 全长
cDNA。将饱满的野生大豆种子浸没于 98%的浓
H2SO4中处理 10 min以除去泥膜, 用无菌 ddH2O冲
洗 4~5 遍后用 1/4 Hoagland 培养液进行液体培养,
待幼苗长至 3 周龄取材, 并于–80℃保存。用 RNA
提取试剂盒 RNAprep Plant Kit (TIANGEN, Beijing,
China)提取材料总 RNA, 取 1.5 μL 总 RNA 为模板,
以 Oligo dT 为引物 , 采用 SuperScript III Reverse
Transcriptase Kit (Invitrogen, USA) 合成 cDNA第 1
条链。根据大豆同源基因(Glyma18g 02210.1), 设计
GsMIPS2 全长基因 PCR 扩增引物(5-ATGTTCATC
GAGAATTTTAAGGTAGAG-3和 5-TCACTTGTAC
TCGAGAATCATGTTATTC-3), 以野生大豆 cDNA
为模板, 采用 PrimeSTAR HS DNA Polymerase进行
PCR扩增。将大小符合要求的电泳条带回收、克隆
至 pGEM-T载体, 转化大肠杆菌 DH5α后送交测序,
每段序列至少测 3 个转化子, 分析测序结果以确定
GsMIPS2的全长序列。
利用Mega 5.0进行多重序列比对, 并用Neighbor-
Joining 法构建系统发育树; 利用 MEME 在线软件
(http://meme.nbcr.net/meme/)分析目的蛋白所具有的
保守结构域。
1.3 野生大豆 GsMIPS2 基因碳酸盐胁迫下表达
特性分析
将 3周龄的野生大豆幼苗, 置含有 50 mmol L–1
NaHCO3的 1/4 Hoagland培养液中, 分别处理 0、1、
3、6、12 和 24 h 后迅速剪取根尖部分, 于–80℃保
存; 按 1.2所述方法提取 RNA及合成 cDNA第 1条
链。根据 SYBR Green Real-time PCR Master Mix
(TOYOBO, Japan)试剂盒操作说明进行实时荧光定
量 PCR。采用比较 CT 法 (2–ΔΔCt)分析结果 , 以
GAPDH作为内参基因。本试验进行 3次独立的生物
学重复和 3 次技术重复, 取 3 次重复的平均值。原
始数据标准化处理的方法参见文献[13]。
1.4 野生大豆 GsMIPS2基因组织表达特性分析
取 1/4 Hoagland 培养液培养的野生大豆各个时
期的组织, 包括种皮、根、幼茎、老茎、上胚轴、
下胚轴、叶和花, 参见 1.3方法提取 RNA, 并进行实
时荧光定量 PCR分析。
1.5 GsMIPS2转基因拟南芥的获得与分子鉴定
利用不依赖酶切位点的植物超量表达载体
pCAMBIA330035Su[14], 根据 GsMIPS2 基因序列设
计带 U 碱基的引物(5-GGCTTAAUATGTTCATCGA
GAATTTAAGG-3和 5-GGTTTAAUTCACTTGTAC
TCGAGAATCATG-3), 转化根瘤农杆菌 GV3101,
利用农杆菌介导的 Floral dip 法[15]对野生型拟南芥
进行遗传转化; 通过连续 3 代的草胺膦筛选(25 μg
L–1)、PCR检测及半定量 RT-PCR检测, 确定超量表
达目的基因的转基因纯合体株系。
第 9期 陈 晨等: 野生大豆碳酸盐胁迫应答基因 GsMIPS2的克隆及功能分析 1345
1.6 拟南芥 AtMIPS2基因突变体 atmips2的分子
鉴定
采用 PCR 技术鉴定拟南芥 T-DNA 插入突变体
atmips2 (SALK_031685C)。使用基因特异性引物 FP:
5-TGATCCCACTTCCTGGTATCTATG-3及 T-DNA
特异性引物 LB: 5-GAGATTAACCTATGGCTCCC
CTT-3验证 T-DNA 是否插入到基因中; 使用基因特
异性引物 FP: 5-TGATCCCACTTCCTGGTATCTAT
G-3和 RP: 5-CCGGGTGGAAAGAGTGAAAC-3, 验
证突变体是否为 T-DNA插入纯合突变体。
1.7 转基因拟南芥及拟南芥突变体碳酸盐胁迫
耐性分析
将同一批获得的野生型、转基因纯合体及突变
体拟南芥种子用 5% NaClO消毒 6 min, 其间反复振
荡, 用灭菌的 ddH2O清洗 6~8次, 放于 4℃避光保存
3 d用于萌发期表型分析。将春化后的种子同时播种
在添加 10 mmol L–1 NaHCO3 (pH 8.5)的 1/2 MS固体
培养基上, 以播种在不含 NaHCO3的 1/2 MS固体培
养基的种子作为对照。由于前 3 d 种子萌发率变化
较快, 因此每 0.5 d统计一次萌发率, 3 d后每天统计
一次萌发率, 共统计 5 d, 于播种第 3天拍照。试验
保证 3次技术重复及 3次生物学重复。
2 结果与分析
2.1 野生大豆 GsMIPS2基因的筛选与序列分析
通过对高通量转录组测序数据的分析, 从肌醇
-1-磷酸合酶家族中选取碳酸盐胁迫下显著上调表达
的基因 GsMIPS2 (图 1)。根据与 GsMIPS2同源的大
豆基因(Glyma18g02210.1)序列, 设计基因特异性引
物, 使用高保真酶进行 PCR 扩增并测序。结果表明
3 个转化子的测序结果完全一致, 将测序得到的序
列进行 ORF finder预测, 最终确定 GsMIPS2的全长
CDS序列, 大小为 1533 bp, 编码 510个氨基酸, 经
ExPASy 预测蛋白质的分子量为 56 444.52 Da。在
NCBI 网站上以 GsMIPS2 蛋白序列为靶序列进行
BlastP 比对, 下载比对结果中与 GsMIPS2 相似度较
高的蛋白序列, 使用 MEGA 5.0 进行多重序列比对,
并构建系统发育树。如图 2, 来自多个物种的 MIPS
蛋白都与 GsMIPS2蛋白具有极高的相似性, 与双子
叶植物和单子叶植物的相似度分别为 88%~100%和
83%~86%。系统发育树结果表明, 单子叶与双子叶
植物的MIPS蛋白位于不同的分支, GsMIPS2蛋白与
大豆 GmMIPS2 蛋白序列完全一致 , 相似度为
100%。同时, 通过 MEME在线软件结构域预测结合
相关文献[16-17]发现, 在所选取的这几个物种的蛋白
序 列 中 都 含 有 “GWGGNNG”, “LWTANTER”,
“NGSPQNTFVPGL”和“SYNHLGNNDG”这 4个保守
的结构域 (图 3), 并含有由 1 个 Rossman 折叠
(GXGGXXG)和 1个酶催化活性区组成的 NAD结合
位点。在 GsMIPS2 蛋白中该催化活性区位于第
118~510个氨基酸的区域, 其中对MIPS酶结合底物
起到关键作用的氨基酸残基已用红色箭头标出。
2.2 GsMIPS2 基因碳酸盐胁迫下表达模式分析
及组织表达特异性分析
为研究 GsMIPS2在碳酸盐胁迫条件下的表达模
式, 采用实时荧光定量 PCR分析了 GsMIPS2基因在
50 mmol L–1 NaHCO3胁迫下, 野生大豆根中的表达
特性。结果显示(图 4), GsMIPS2基因能被碳酸盐胁
迫诱导表达, 并呈现先上升后下降的表达趋势。在
50 mmol L–1 NaHCO3处理后 3 h达到最高值, 比 0 h
增加了约 18.8倍, 该结果表明 GsMIPS2基因参与碳
酸盐胁迫过程, 并且在短期内显著上调表达。该结
果与高通量转录组测序数据相一致(图 1), 同样能够
说明 GsMIPS2基因受碳酸盐诱导表达。
同时, 我们研究了 GsMIPS2 基因在野生大豆组
织中的表达特异性, 采用实时荧光定量 PCR 分析了
GsMIPS2 基因在野生大豆种皮、根、幼茎、叶、上
胚轴、下胚轴、老茎、花等组织的表达特性。如图
图 1 GsMIPS 基因家族碳酸盐胁迫下转录组测序数据
Fig. 1 RNA-seq data of GsMIPS gene family under bicarbonate stress
1346 作 物 学 报 第 41卷
图 2 GsMIPS2 蛋白与单子叶和双子叶植物 MIPS 蛋白序列相似度及进化树分析
Fig. 2 Similarity and phylogenetic tree analysis of GsMIPS2 with MIPS proteins from monocotyledon and dicotyledon
(图 3)
第 9期 陈 晨等: 野生大豆碳酸盐胁迫应答基因 GsMIPS2的克隆及功能分析 1347
图 3 GsMIPS2 蛋白与其他物种 MIPS 蛋白保守结构域分析
Fig. 3 Conserved motifs analysis of GsMIPS2 with MIPS proteins from other species
5所示, GsMIPS2基因的表达量在野生大豆不同组织
中存在着明显的差异, 在野生大豆叶片中的表达量
最高 , 幼茎次之 , 而在其他组织中则相对较低 , 说
明该基因在野生大豆组织中的分布具有特异性。综
上所述, 我们推测野生大豆 GsMIPS2 基因在植物应
答碳酸盐胁迫反应中起着重要的作用, 其组织特异
1348 作 物 学 报 第 41卷
图 4 GsMIPS2 基因碳酸盐胁迫下表达模式分析
Fig. 4 Expression pattern analysis of GsMIPS2 under
bicarbonate stress
图 5 GsMIPS2 基因组织表达特异性分析
Fig. 5 Tissue specific expression analysis of GsMIPS2
1: 种皮; 2: 根; 3: 幼茎; 4: 叶; 5: 上胚轴; 6: 下胚轴; 7: 老茎; 8: 花。
1: episperm; 2: root; 3: young stem; 4: leaf; 5: epicotyl;
6: hypocotyl; 7: old stem; 8: flower.
性分布表明该基因行使功能的主要部位可能是在植
物叶片中。
2.3 GsMIPS2超量表达拟南芥及 atmips2拟南芥
纯合突变体的获得
为进一步研究 GsMIPS2 基因的功能, 采用不依
赖酶切位点的 USER技术构建 GsMIPS2基因植物超
量表达载体, 载体图谱如图 6-A, 并用 Flora dip法对
野生型拟南芥进行侵染, 经草铵膦(25 μg L–1)筛选
得到 T0代抗性植株, 随后进行了连续两代草胺膦筛
选及 PCR跟踪检测, 对 T2代不发生分离的抗性植株
视为超量表达纯合体, 共获得 3 株纯合体植株(#4、
#11 和#20), 通过进一步半定量 RT-PCR 检测, 证明
这 3 株植株均为 GsMIPS2 基因超量表达纯合体(图
6-B)。
同时对拟南芥中肌醇 -1-磷酸合酶 2 基因
(AtMIPS2)的突变体 atmips2 (SALK_031685C)进行
了分子鉴定。如图 7-A 所示, 该突变体插入位点为
第 4个外显子 655 bp处。通过 PCR技术, 利用基因
特异性引物 FP 及 T-DNA 特异性引物 LB 进行 PCR
检测, 野生型拟南芥无条带而突变体有条带, 说明
T-DNA 已经插入到该基因中; 利用基因特异性引物
FP和 RP进行 PCR检测, 野生型拟南芥有条带而突
变体无条带, 则说明该突变体为纯合突变体(图 7-B),
可应用于下一步表型试验。
2.4 GsMIPS2 超量表达拟南芥及拟南芥突变体
的碳酸盐胁迫耐性分析
将野生型、突变体及 2个 GsMIPS2基因超表达
量相近的拟南芥株系(#11 和#20)的种子经表面消毒
后, 播于 1/2 MS 固体培养基或添加 10 mmol L–1
NaHCO3 (pH 8.5)的胁迫培养基上, 每 12 h统计一次
种子萌发率。如图 8和图 9-A, 在正常生长条件下转
基因、突变体与野生型拟南芥种子的萌发状态及萌
发率大致相同, 表明导入的 GsMIPS2 基因并未对拟
南芥的生长、发育造成影响。在 10 mmol L–1 NaHCO3
图 6 GsMIPS2 超量表达植株的分子鉴定
Fig. 6 Characterization of the GsMIPS2 overexpression lines
A: 拟南芥超量表达 GsMIPS2基因载体构建图示; B: GsMIPS2基因超量表达拟南芥半定量 RT-PCR鉴定。
A: schematic representation of the construct for overexpressing GsMIPS2 gene in Arabidopsis; B: semi-quantitative RT-PCR identification of
GsMIPS2 overexpression lines.
第 9期 陈 晨等: 野生大豆碳酸盐胁迫应答基因 GsMIPS2的克隆及功能分析 1349
图 7 拟南芥突变体 atmips2 的分子鉴定
Fig. 7 Characterization of Arabidopsis atmips2 mutant
A: 拟南芥突变体 atmips2 T-DNA插入位点图示; B: 拟南芥突变体 atmips2的 PCR鉴定。
A: T-DNA insertion site of atmips2; B: PCR identification of atmips2.
图 8 碳酸盐胁迫对野生型、突变体和 GsMIPS2 超量表达拟南芥萌发期的影响
Fig. 8 Effect of bicarbonate stress on the germination phenotype of wild type, atmips2, and GsMIPS2 overexpression lines
(pH 8.5)处理下, 转基因、突变体与野生型拟南芥的
萌发都受到抑制, 但是与野生型拟南芥相比, 突变
体的萌发率受抑制更明显, 而转基因拟南芥 2个株
系种子的萌发率受 NaHCO3胁迫影响的程度明显低
于野生型(图 9-B), 以上结果初步说明GsMIPS2基因
的超量表达增加了拟南芥的碳酸盐耐性, 而 atmips2
突变体则使拟南芥对碳酸盐胁迫更加敏感。
3 讨论
全世界近 932 hm2 的土地都正在遭受盐碱胁
迫的危害 [ 1 8 ] , 而通常意义上的碱胁迫主要是由
NaHCO3和 Na2CO3这两种碳酸盐引起的 [19]。碳酸
盐胁迫不仅能引起离子胁迫、渗透胁迫、氧化胁
迫 , 还能产生高 pH 值 , 因此比盐胁迫更具有危害
性 [20]。然而迄今为止 , 对于碳酸盐胁迫的研究相
比盐胁迫要少得多。对于肌醇-1-磷酸合成酶的研
究表明 , 只有少数自身具有胁迫耐受性的植物所
编码的MIPS蛋白 , 才能够在高温或高盐浓度的环
境下维持自身MIPS酶蛋白的催化活性 , 从而继续
发挥催化作用 , 促进肌醇的合成 [21-22], 而这种特
性可能与它们在胁迫生长环境下蛋白质的结构特
性及其对胁迫环境耐受程度的不同密切相关。针
对上述研究结果 , 本研究所使用的试验材料野生
大豆在长期的自然选择过程中积累了较强的盐碱
胁迫耐受性 , 其种子能够在 pH 9.02的碱性土壤中
萌发 [23]; 同时 , GsMIPS2 基因是野生大豆碳酸盐
胁迫 RNA转录组测序数据中明显上调表达的基因,
因此对该基因的研究为阐明植物耐碳酸盐机制提
供潜在的价值与意义。
进化树及结构域分析结果表明, GsMIPS2 蛋白
与其他物种的 MIPS 蛋白都有共同的保守结构域及
极高的相似性, 这 4个结构域可能会形成MIPS酶蛋
1350 作 物 学 报 第 41卷
图 9 碳酸盐胁迫下野生型、突变体及 GsMIPS2 超量表达拟南芥萌发率统计(B, C)
Fig. 9 Germination rate statistics of wild type, atmips2, and GsMIPS2 overexpression lines under bicarbonate stress (B, C)
A: 正常条件下种子萌发率; B: 种子在 10 mmol L–1 NaHCO3处理下萌发率。试验包括 3次技术重复及 3次生物学重复, 使用 t检验进
行差异显著性分析, *代表 P<0.05。
A: seed germination rates of wild type, atmips2 and GsMIPS2 overexpression lines under normal condition; B: seed germination rates of wild
type, atmips2 and GsMIPS2 overexpression lines under 10 mmol L–1 NaHCO3 treatment. The experiment included three fully independent
technical repeats, and three biological repeats. Significant differences analyses were conducted using t-test method and was denoted by one
star corresponding to P<0.05.
白的核心结构, 因此在进化过程中高度保守[24-26]。
然而 , 蛋白质的功能与其结构密切相关。虽然
GsMIPS2 蛋白与大豆 GmMIPS2 蛋白氨基酸序列完
全一致, 表明这 2 种蛋白在一级结构上并没有区别,
但是由于酶类蛋白质在发挥其功能时还与其二级结
构、三级结构乃至四级结构有着紧密的联系, 因此,
这 2 种不同来源的蛋白在发挥催化作用时, 外界胁
迫环境对蛋白构象影响程度是否相同还需要进一步
研究。而这种构象的不同可能会使 GsMIPS2蛋白与
GmMIPS2 蛋白在胁迫环境下酶的催化活性产生差
异。由于目前尚无对非耐盐碱大豆品种在碳酸盐胁
迫下 MIPS 基因功能的研究, 为了验证 GsMIPS2 基
因耐碳酸盐功能是否与野生大豆自身的胁迫耐性相
关, 下一步试验还可以将非耐盐碱大豆品种的 MIPS
基因超量表达拟南芥进行功能验证。
实时荧光定量 PCR 结果显示, GsMIPS2基因能
够迅速受碳酸盐胁迫诱导表达, 并且具有组织特异
性, 据此推测该基因在碳酸盐胁迫中发挥一定的功
能, 并且其行使功能的主要部位可能是在植物的叶
中, 该结论与Hegerman等[11]证明GmMIPS基因在大
豆不同组织中的表达量具有明显差异的结果相一
致。同时, 我们结合相关文献[27], 对野生型、突变体
及超量表达株系在不同碳酸盐浓度下 (9、10和11
mmol L–1 NaHCO3)萌发期的表型进行了浓度梯度预
试验, 发现在10 mmol L–1 NaHCO3 (pH 8.5)处理下
萌发率差异最显著 , 最终确定采用 10 mmol L–1
NaHCO3 (pH 8.5)进行试验。在碳酸盐胁迫下
GsMIPS2基因超量表达拟南芥的萌发率明显好于野
生型, 该现象从表型上初步说明 GsMIPS2基因在植
物碳酸盐耐性方面起着积极的作用。由于野生大豆
中不易获得 GsMIPS2基因敲除突变体, 我们采用了
与野生大豆 GsMIPS2基因相似度较高(88%)的拟南
芥 AtMIPS2基因突变体进行验证。结果表明, 在碳酸
盐胁迫下拟南芥突变体 atmips2的萌发率明显低于
野生型, 该现象可以部分反映 GsMIPS2基因在碳酸
盐胁迫下的功能。然而, 虽然野生大豆 GsMIPS2基
因序列和拟南芥 AtMIPS2基因序列相似度较高, 但
是由于这2个基因来源不同 , 后续试验还需要将
GsMIPS2基因超量表达到拟南芥突变体中, 通过功
能互补实验来进一步验证 GsMIPS2基因的功能。
肌醇-1-磷酸合成酶是肌醇合成的关键酶, 肌醇
在植物应答盐、干旱等非生物及病虫害等生物胁迫
方面有着重要的功能[28-29]。Raboy 等[30]研究拟南芥
中的 MIPS 基因家族(MIPS1, MIPS2, MIPS3)发现,
MIPS1 和 MIPS2 基因的突变体 mips1 和 mips2 能够
降低植物种子中肌醇的含量; Saxena等[31]发现拟南芥
超量表达鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)的 CaMIPS 基因
会引起肌醇含量的增加, 从而提高拟南芥种子萌发
期对冷、盐、干旱等胁迫的耐性; Kaur等[9]同样发现,
受 ABA诱导的鹰嘴豆 CaMIPS2基因的超量表达, 增
加拟南芥对盐及干旱胁迫的耐性, 与野生型相比, 该
过程伴随着MIPS2酶活性的提高及肌醇含量的增加。
针对上述研究结果, 后续试验还需要验证 GsMIPS2
基因的超量表达是否会增加肌醇的含量, 从而解释
GsMIPS2基因提高植物碳酸盐耐性的生物学机制。
4 结论
筛选出一个转录水平明显上调的肌醇-1-磷酸合
第 9期 陈 晨等: 野生大豆碳酸盐胁迫应答基因 GsMIPS2的克隆及功能分析 1351
酶类基因 GsMIPS2, 该基因能被碳酸盐胁迫诱导表
达, 并且具有组织特异性。将该基因超量表达到拟
南芥中能够提高拟南芥萌发期的碳酸盐耐性。
References
[1] Kawanabe S, Zhu T C. Degeneration and conservation of Aneu-
rolepisium chinense grassland in northern China. J Jpn Grassl Sci,
1991, 37: 91–99
[2] 李彬, 王志春, 孙志高, 陈渊, 杨福. 中国盐碱地资源与可持
续利用研究. 干旱地区农业研究, 2005, 23(2): 154–158
Li B, Wang Z C, Sun Z G, Chen Y, Yang F. Resources and sus-
tainable resource exploitation of salinized land in China. Agric
Res Arid Areas, 2005, 23(2): 154–158 (in Chinese with English
abstract)
[3] Nakashima K, Ito Y, Yamaguchi-Shinozaki K. Transcriptional
regulatory networks in response to abiotic stresses in Arabidopsis
and grasses. Plant Physiol, 2009, 149: 88–95
[4] 李向华, 王克晶, 李福山, 严茂粉. 野生大豆(Glycine soja)研
究现状与建议. 大豆科学, 2005, 24: 305–309
Li X H, Wang K J, Li F S, Yan M F. Research progress of wild
soybean (Glycine soja) and suggestions for improving its effec-
tive utilization and protection. Soybean Sci, 2005, 24: 305–309
(in Chinese with English abstract)
[5] Loewusa F A, Murthy P P N. Myo-inositol metabolism in plants.
Plant Sci, 2000, 150: 1–19
[6] Nelson D E, Rammesmayer G, Bohnert H J. Regulation of
cell-specific inositol metabolism and transport in plant salinity
tolerance. Plant Cell, 1998, 10: 753–764
[7] Das-Chatterjee A, Goswami L, Maitra S, Dastidar K G, Ray S,
Majumde A L. Introgression of a novel salt-tolerant L-myo-
inositol 1-phosphate synthase from Porteresia coarctata (Roxb.)
Tateoka (PcINO1) confers salt tolerance to evolutionary diverse
organisms. FEBS Lett, 2006, 580: 3980–3988
[8] Patra B, Ray S, Richter A, Majumder A L. Enhanced salt toler-
ance of transgenic tobacco plants by co-expression of PcINO1
and McIMT1 is accompanied by increased level of myo-inositol
and methylated inositol. Protoplasma, 2010, 245: 143–152
[9] Kaur H, Verma P, Petla B P, Rao V, Saxena S C, Majee M. Ec-
topic expression of the ABA-inducible dehydration-responsive
chickpea L-myo-inositol 1-phosphate synthase 2 (CaMIPS2) in
Arabidopsis enhances tolerance to salinity and dehydration stress.
Planta, 2013, 237: 321–335
[10] Joshi R, Ramanarao M V, Baisakh N. Arabidopsis plants consti-
tutively overexpressing a myo-inositol 1-phosphate synthase gene
(SaINO1) from the halophyte smooth cordgrass exhibits en-
hanced level of tolerance to salt stress. Plant Physiol Biochem,
2013, 65: 61–66
[11] Hegeman C E, Good L L, Grabau E A. Expression of
D-myo-inositol-3-phosphate synthase in soybean. Implications
for phytic acid biosynthesis. Plant Physiol, 2001, 125:
1941–1948
[12] Kido E A, Ferreira Neto J R, Silva R L, Belarmino L C, Bezerra
Neto J P, Soares-Cavalcanti N M, Pandolfi V, Silva M D, Ne-
pomuceno A L, Benko-Iseppon A M. Expression dynamics and
genome distribution of osmoprotectants in soybean: identifying
important components to face abiotic stress. BMC Bioinform,
2013, 14(suppl) 1: S7
[13] Willems E, Leyns L, Vandesompele J. Standardization of
real-time PCR gene expression data from independent biological
replicates. Anal Biochem, 2008, 379: 127–129
[14] Nour-Eldin H H, Hansen B G, Norholm M H, Jensen J K, Halkier
B A. Advancing uracil-excision based cloning towards an ideal
technique for cloning PCR fragments. Nucl Acids Res, 2006, 34:
e122
[15] Clough S J, Bent A F. Floral dip: a simplified method for Agro-
bacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.
Plant J, 1998, 16:735–743
[16] Lu B B, Du Z, Ding R X, Zhang L, Yu X J, Liu C H, Chen W S.
Cloning and characterization of a differentially expressed
phenylalanine ammonialyse gene (liPAL) after genome duplica-
tion from tetraploid Isatis indigotica fort. J Integr Plant Biol,
2006, 48: 1439–1449
[17] Cui M, Liang D, Wu S, Ma F W, Lei Y S. Isolation and develop-
mental expression analysis of L-myo-inositol-1-phosphate syn-
thase in four Actinidia species. Plant Physiol Biochem, 2013, 73:
351–358
[18] Rao P S, Mishra B, Gupta S R, Rathore A. Reproductive stage
tolerance to salinity and alkalinity stresses in rice genotypes.
Plant Breed, 2008, 127: 256–261
[19] Shi D C, Sheng Y M. Effect of various salt–alkaline mixed stress
conditions on sunflower seedlings and analysis of their stress
factors. Environ Exp Bot, 2005, 54: 8–21
[20] Shi D C, Yin L J. Difference between salt (NaCl) and alkaline
(Na2CO3) stresses on Puccinellia tenuiflora (Griseb.) Scribn et
Merr. plants. Acta Bot Sin, 1993, 3: 144–149
[21] Majee M, Maitra S, Dastidar K G, Pattnaik S, Chatterjee A, Hait
N C, Das K P, Majumder A L. A novel salt-tolerant L-myo-
inositol-1-phosphate synthase from Porteresia coarctata (Roxb.)
Tateoka, a halophytic wild rice: molecular cloning, bacterial
overexpression, characterization, and functional introgression
into tobacco-conferring salt tolerance phenotype. J Biol Chem,
2004, 279: 28539–28552
[22] Ghosh Dastidar K, Maitra S, Goswami L, Roy D, Das K P, Ma-
jumder A L. An insight into the molecular basis of salt tolerance
of L-myo-inositol 1-P synthase (PcINO1) from Porteresia coarc-
tata (Roxb.) Tateoka, a halophytic wild rice. Plant Physiol, 2006,
140: 1279–1296
[23] Ge Y, Li Y, Zhu Y M, Bai X, Lv D K, Guo D, Ji W, Cai H. Global
transcriptome profiling of wild soybean (Glycine soja) roots
under NaHCO3 treatment. BMC Plant Biol, 2010, 10: 153
[24] Johnson M D, Sussex I M. 1L-myo-inositol 1-phosphate synthase
from Arabidopsis thaliana. Plant Physiol, 1995, 107: 613–619
[25] Wongkaew A, Nakasathien S, Srinives P. Isolation and char-
acterization of D-myo-inositol-3-phosphate synthase from
mungbean (Vigna radiata). Plant Mol Biol Rep, 2009, 28:
122–127
[26] Majumdera A L, Johnsonb M D, Henry S A. 1L-myo-inositol-
1-phosphate synthase. Biochim Biophys Acta, 1997, 1348:
245–256
[27] Zhu D, Li R, Liu X, Sun M, Wu J, Zhang N, Zhu Y. The positive
regulatory roles of the TIFY10 proteins in plant responses to
1352 作 物 学 报 第 41卷
alkaline stress. PLoS One, 2014, 9: e111984
[28] Yoshida K T, Wada T, Koyama H, Mizobuchi-Fukuoka R, Naito
S. Temporal and spatial patterns of accumulation of the transcript
of myo-inositol-1-phosphate synthase and phytin-containing par-
ticles during seed development in rice. Plant Physiol, 1999, 119:
65–72
[29] Boominathan P, Shukla R, Kumar A, Manna D, Negi D, Verma P
K, Chattopadhyay D. Long term transcript accumulation during
the development of dehydration adaptation in Cicer arietinum.
Plant Physiol, 2004, 135: 1608–1620
[30] Raboy V. Myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate. Phyto-
chemistry, 2003, 64: 1033–1043
[31] Saxena S C, Salvi P, Kaur H, Verma P, Petla B P, Rao V, Kamble
N, Majee M. Differentially expressed myo-inositol monophos-
phatase gene (CaIMP) in chickpea (Cicer arietinum L.) encodes a
lithium-sensitive phosphatase enzyme with broad substrate speci-
ficity and improves seed germination and seedling growth under
abiotic stresses. J Exp Bot, 2013, 64: 5623–5639
欢迎订阅 2016 年《植物遗传资源学报》
《植物遗传资源学报》是中国农业科学院作物科学研究所和中国农学会主办的学术期刊, 为中国科技论文统
计源期刊、中国科学引文数据库来源期刊(核心期刊)、中国核心期刊(遴选)数据库收录期刊、中国学术期刊综合
评价数据库统计源期刊, 又被《中国生物学文摘》和中国生物学文献数据库、中文科技期刊数据库收录。据中
国科学技术文献评价研究中心和清华大学图书馆研制的 2014年《中国学术期刊影响因子年报》统计, 《植物遗
传资源学报》影响因子为 1.114 (复合影响因子为 1.503)。在中国科学技术信息研究所 2014年发布的《中国科技
期刊引证报告(核心版)》中, 《植物遗传资源学报》核心影响因子列农艺学期刊的第 4位。
报道内容为大田、园艺作物, 观赏、药用植物, 林用植物、草类植物及其所有经济植物的有关植物遗传资源
基础理论研究、应用研究方面的研究成果、创新性学术论文和高水平综述或评论。诸如, 种质资源的考察、收
集、保存、评价、利用、创新, 信息学、管理学等；起源、演化、分类等系统学；基因发掘、鉴定、克隆、基
因文库建立、遗传多样性研究。
《植物遗传资源学报》为双月刊, 大 16 开本, 196 页。定价 20 元, 全年 120 元。各地邮局发行, 邮发代号:
82-643。国内刊号 CN11-4996/S, 国际标准刊号 ISSN1672-1810。本刊编辑部常年办理订阅手续, 如需邮挂每期
另加 3元。
地址: 北京市中关村南大街 12号《植物遗传资源学报》编辑部(邮编: 100081)
电话: 010-82105794; 010-82105796 (兼传真)
网址: http://www.zwyczy.cn/; E-mail: zwyczyxb2003@163.com; zwyczyxb2003@caas.cn
欢迎订阅 2016 年《作物杂志》
《作物杂志》是中国作物学会和中国农业科学院作物科学研究所主办的有关作物科学的学术类期刊。1985
年创刊, 创刊时为技术类期刊, 2014年, 在中国科协科技期刊评估中被定位为学术类期刊。曾荣获第三届/第四届
/第五届全国优秀农业科技期刊奖、中国科协优秀科技期刊奖。连续入选全国中文核心期刊、中国科技核心期刊、
中国农业核心期刊、中国科技期刊引证报告(CJCR)源期刊。入选中国知识源总库中国科技期刊精品数据库。本
刊设有专题综述、遗传育种·种质资源·生物技术、生理生化·植物营养·栽培耕作、植物保护、种子科技、
研究简报等栏目。读者对象为农业科研人员、农业院校师生、农业技术推广工作者等。
《作物杂志》为双月刊, 大 16开, 172页。定价 15元, 全年 90元, 全国各地邮局均可订阅。
地址: 北京市中关村南大街 12号中国农业科学院作物科学研究所, 邮编: 100081
电子信箱: zwzz304@caas.cn 电话: 010-82108790
过刊免费下载: http://www.chinacrops.org/magas.asp?menuid=22