全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(2): 170179 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
北京市自然科学基金 (重点 )项目 (6151002), 国家转基因生物新品种培育重大专项 (2014ZX08010-002), 国家自然科学基金项目
(31570268, 31170267)和中国农业科学院科技创新工程项目的资助。
This study was supported by the Natural Science Foundation (6151002), the Major Project of China on New Varieties of GMO Cultivation
(2014ZX08010-002), the National Natural Science Foundation of China (31570268, 31170267) and the Agricultural Science and Technology
Innovation Program (ASTIP) of CAAS.
* 通讯作者(Corresponding authors): 杨青华, E-mail: yangqh2000@163.com, Tel: 0371-63555778; 杨建平, E-mail: yangjianping02@caas.cn, Tel:
010-82105859 ** 同等贡献(Contributed equally to this work)
第一作者联系方式: 原换换, E-mail: yuanhuanhuan111@126.com, Tel: 010-82105851; 孙广华, E-mail: guanghuanuli@163.comm, 010-
82105851
Received(收稿日期): 2015-08-27; Accepted(接受日期): 2015-11-20; Published online(网络出版日期): 2015-12-07.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20151207.1121.022.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00170
玉米 ZmPP6C基因的克隆及其响应光质和胁迫处理的表达模式分析
原换换 1,2,** 孙广华 1,2,** 闫 蕾 2 郭 林 2 樊晓聪 1,2 肖 阳 3
孟凡华 2 宋梅芳 2,4 詹克慧 1 杨青华 1,* 杨建平 1,2,*
1 河南农业大学农学院 / 河南粮食作物协同创新中心, 河南郑州 450002; 2 中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081; 3 中国农
业科学院研究生院, 北京 100081; 4 北京市辐射中心, 北京 100875
摘 要: 丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶 6亚基(catalytic subunits of Ser/Thr protein phosphatase 6, PP6C)是 PP6全酶的催化
亚基。在模式植物拟南芥中的研究表明, PP6C参与生长素极性运输、脱落酸信号转导和光信号转导途径介导的开花
调控。为了明确玉米丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶 6 亚基(ZmPP6C)的蛋白结构特征与同源蛋白间的进化关系, 采用
RT-PCR方法克隆了 ZmPP6C的全长基因。序列分析表明, ZmPP6C开放阅读框为 912个核苷酸, 编码 303个氨基酸
残基, 包含 PP2A 的催化亚基 PP2Ac 结构域; 系统进化树分析表明, PP6C 蛋白在进化上较为保守, 并且与高粱的
PP6C蛋白相似性更高。对玉米自交系 B73的 ZmPP6C基因进行器官特异性表达分析表明, 其表达量在成株期叶片中
最高, 是根中的 7.9倍; ZmPP6C能够响应不同光质处理, 且受远红光和红光的影响较大; 也能响应长日和短日处理,
在长日条件下的光照和黑暗阶段各有一个明显的表达高峰, 在短日条件下的光照和黑暗阶段分别有 2 个和 3 个表达
峰值; 同时, ZmPP6C还响应高渗透、盐渍和淹水等胁迫处理, 出现明显的上调表达。结果表明, ZmPP6C在玉米光信
号转导、开花诱导与胁迫应答中发挥重要作用, 其分子与生化机制值得进一步探讨。
关键词: 玉米; 丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶; 表达模式分析; 光敏色素; 光信号途径; 非生物胁迫
Molecular Cloning of ZmPP6C Gene and Its Expression Patterns in Response
to Light and Stress Treatments in Maize (Zea mays L.)
YUAN Huan-Huan1,2,**, SUN Guang-Hua1,2,**, YAN Lei2, GUO Lin2, FAN Xiao-Cong1,2, XIAO Yang3,
MENG Fan-Hua2, SONG Mei-Fang2,4, ZHAN Ke-Hui1, YANG Qing-Hua1,*, and YANG Jian-Ping1,2,*
1 College of Agronomy, Henan Agricultural University / Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops, Zhengzhou 450002, China; 2 Institute
of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3 Graduate School, Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Beijing 100081, China; 4 Beijing Radiation Center, Beijing 100875, China
Abstract: PP6C is the catalytic subunits of Ser/Thr protein phosphatase 6 (PP6) gene, which plays important roles in auxin
transport polarity, ABA (abscisic acid) signal transduction, flowering time control though light signaling pathway. To clarify
structural characteristics of PP6C protein and the evolution relationships among plant PP6C homologs, we cloned ZmPP6C gene
by RT-PCR. The open reading frame (ORF) of ZmPP6C possesses 912 nucleotides and encodes 303 amino acid residues with one
PP2Ac domain (the catalytic subunits of Ser/Thr protein phosphatase 2A). Phylogenetic analysis indicated that ZmPP6C belongs
to the same branch with the PP6C of Sorghum bicolor, and shows high similarity to all PP6C proteins from other monocotyledons
and dicotyledons. Further quantitative RT-PCR (qRT-PCR) assays indicated that ZmPP6C was highly expressed in leaf and lowly
第 2期 原换换等: 玉米 ZmPP6C基因的克隆及其响应光质和胁迫处理的表达模式分析 171
in stem, stamen, pulvinus, sheath, and pedical. ZmPP6C transcription abundances could respond to different light and circadian
treatments (both long-day and short-day conditions), especially to the light transitions from the dark to far-red or red light condi-
tion. In addition, ZmPP6C transcription abundances were up-regulated by high osmosis, high salt and water logging. Our results
suggested that ZmPP6C may be involved in light signaling pathway, flowering time control, and abiotic stress response in maize,
and its roles in crop improvement are worthy of more exploration in the future.
Keywords: Zea mays; ZmPP6C; Expression patterns; Phytochrome; Light signaling pathway; Abiotic stress
蛋白磷酸酶的作用和蛋白激酶相反, 它是催化
已磷酸化的蛋白质去磷酸化反应的一类酶, 与蛋白
激酶相对应存在, 共同组成了磷酸化和去磷酸化这
一重要的蛋白质活性的开关系统 [1,2]。蛋白磷酸酶
6(PP6)是一种类似于 PP2A 的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷
酸酶[1,2], 参与调节转录、翻译、形态建成和细胞循
环诸多过程[3]。PP6 全酶包括催化亚基 PP6C、调节
亚基 PP2A 和结构蛋白 SAPS。而 PP2A 全酶包括 2
个调节亚基 PP2Aa和 PP2Ab, 以及催化亚基 PP2Ac,
其中催化亚基 PP2Ac 类磷酸酶蛋白在逆境中发挥
着重要作用[1,4-6]。在模式植物拟南芥中有 AtFyPP1
和 AtFyPP32个高度同源的 PP6C 催化亚基基因; 二
者均能与光敏色素磷酸酶 2A 结合, 调控植物开花[6]。
AtFyPP3 过量表达株系延迟开花, 而 atftpp3 缺失突
变体则导致开花提前[6]。AtFyPP3的转录受到光照节
律的调节, 长日条件下 AtFyPP3 的表达明显高于短
日条件[6]。酵母双杂测试证实豌豆 PP6 能与燕麦的
phyA和拟南芥的 phyB互作, 体外 Pull-down实验表
明豌豆 PP6优先结合磷酸化或者 Pfr形式的 phyA和
phyB[7]。以上研究结果表明 PP6C可能通过与光敏色
素互作调节植物光形态建成。
研究表明拟南芥的 2个 PP6C同源蛋白AtFyPP1
和 AtFyPP3 参与生长素(auxin)的极性运输和 ABA
(abscisic acid, ABA)介导的胁迫响应。生长素主要在
植物顶端分生组织中合成, 然后被运输到植物体的
各个部位; 生长素的极性运输取决于生长素输出蛋
白 PIN (PIN-FORMED)的磷酸化水平; 蛋白丝氨酸/
苏氨酸激酶 PID (PROTEIN SERINE/THREONINE
KINASE PINOID)能促进 PIN 的磷酸化 [8-12]。
AtFyPP1和 AtFyPP3通过负调控 PID的激酶活性抑
制 PIN 的磷酸化, 进而阻遏生长素的极性运输, 导
致植物生长发育迟缓[13]。激素 ABA能够调节植物对
生物胁迫和非生物胁迫(干旱、盐、低温和病原菌等)
的响应 [14-17]。碱性亮氨酸拉链转录因子 ABI5
(ABSCISIC ACID INSENSITIVE5)能促进种子萌发
以及萌发后的幼苗生长, 是 ABA信号途径中重要的
抑制因子[18-21]。AtFyPP1 和 AtFyPP3 通过 ABI5 的
脱磷酸化来加速其降解, 从而促进 ABA信号转导[4]。
玉米是集口粮、饲料和工业原料为一体的重要
的多用途作物[22,23], 其产量受光照、水分和温度等多
种环境因素的制约[23-27]。蛋白磷酸酶在植物逆境信号
转导、有丝分裂和细胞循环过程中具重要作用[28-30],
而玉米中只有一个蛋白磷酸酶6催化亚基(ZmPP6C),
其研究未见报道。本研究克隆了ZmPP6C基因, 初步
分析了ZmPP6C蛋白功能结构域 , 在氨基酸水平对
其进行了系统进化分析, 并对该基因器官表达特异
性及响应光和胁迫处理的表达模式进行了较系统的
分析。ZmPP6C的表达能够响应不同光质处理, 也能
响应长日和短日处理 ; 同时 , ZmPP6C还响应高渗
透、盐渍和淹水等胁迫处理, 出现明显的上调表达。
我们发现ZmPP6C在玉米光信号转导、开花诱导与胁
迫应答中发挥重要作用 , 该结果将为以后ZmPP6C
功能研究及其在玉米分子抗逆育种中的应用奠定基
础。
1 材料与方法
1.1 试验材料及样品处理
选用玉米自交系B73为研究材料(中国农业科学
院作物科学研究所李新海博士惠赠, 杨建平实验室
繁育并保存)。(1)器官特异性表达样品的准备: 在北
京地区4月下旬于花盆中播种自交系B73的种子、自
然条件下生长60 d后分别取成株的叶、茎、根、幼
穗、苞叶、花丝、雄花、花柄、叶鞘和叶枕。(2)各
种持续光质处理: 将玉米种子消毒杀菌后, 平放在
湿润滤纸的培养皿中28℃催芽3 d, 挑选萌动一致的
种子播种于装有培养土塑料小盆(长宽高均为8.5 cm)
中, 每小盆播种9颗种子, 分别放于黑暗(Dk)、远红
光(FR, 0.5 µmol m–2 s–1)、红光(R, 22.5 µmol m–2 s–1)、
蓝光(B, 13.0 µmol m−2 s−1)和白光(WL, 17.0 µmol
m–2 s–1)玉米苗子均生长在22℃培养箱中生长。(3)黑
暗转换各种光质: 黑暗中生长13 d后分别转入以上
各种光质条件下0.25、0.5、1、2、4、8、12和24 h, 分
别取样。(4)长日和短日处理: 玉米幼苗在22℃长日
(LD, 16-h-光照/8-h-黑暗)或短日(SD, 8-h-光照/16-h-
黑暗)条件下中生长13 d。(5)盐渍(200 mmol L–1 NaCl)
和高渗透(20% PEG-6000)处理: 在正常温室条件下
172 作 物 学 报 第 42卷
(16-h-光照/8-h-黑暗, 22℃)生长13 d后对幼苗以盐渍
(200 mmol L–1 NaCl)和高渗透(20% PEG-6000)分别
处理0、1、3、6、12、24和48 h。以正常温室条件下
生长和未经处理的苗子作为对照。(6)淹水(灌水没根)
处理: 将正常温室条件下(22℃)生长到13 d的幼苗,
带钵体一同置水盒中, 水层高出钵体2 cm, 淹水7 d,
接着恢复正常温室条件, 分别在淹水3、4、5和7 d
以及恢复正常温室条件后3 d和7 d取样, 每天取样
时间固定在上午10:00。对照样品如(5)。(7)用作基因
克隆的植物材料为生长在22℃黑暗条件下13 d的幼
苗。将所有样品, 迅速收获并冻存于–80℃液氮备用。
1.2 菌株和载体
大肠杆菌DH5α菌株是本实验室保存的, 克隆载
体pEASY-Blunt-Simple和pESAY-T1 Cloning Kit购自
北京全式金生物技术有限公司。
1.3 酶和试剂
实验中使用的酶和试剂及购置公司为: ExTaq酶
和 PrimeSTAR HS酶, TaKaRa (大连)公司; Revert Aid
First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific公
司; 限制性内切酶和 T4 DNA连接酶, NEB公司; 凝
胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒, 天根生化科技有
限公司。
1.4 RNA提取及 cDNA合成
TRIzol (Invitrogen, USA)法提取各种处理的玉
米幼苗总 RNA, 经 DNase I (RNase-free, TaKaRa大
连公司)处理后作为模板, 以 Oligo-dT18 为引物, 利
用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit
(Thermo Scientific公司)反转录成 cDNA备用。
1.5 玉米 PP6C的克隆
根据 NCBI 中的 ZmPP6C (NM_001175500)的
序列设计引物 (ZmPP6C-F5′-TCTAGAATGGATGTG
GATCTGTGGAT-3′)和 ZmPP6C-R (5′-GGATCCTAG
GAAATATGGGACTGCGG-3′), 用黑暗下 13 d 幼苗
的 cDNA 为模板, 扩增得到 912 bp 的片段, 克隆到
pEASY-Blunt-Simple载体上, 得到 pEASY-ZmPP6C。经
PCR 和酶切鉴定后测序(苏州金唯智生物技术有限
公司北京分公司), 测序正确后备用。
1.6 玉米 PP6C 的基因序列比对、结构预测与进
化树分析
采用 NCBI-Blast 网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.
gov/Blast.cgi)获得玉米 (Zea mays)、拟南芥 (Arabi-
dopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、高粱(Sorghum
bicolor)、谷子(Setaria italica)、小麦(Triticum aesti-
vum)、大麦(Hordeum vulgare)、短柄草(Brachypodium
distachyom)、油菜(Brassica napus)、大白菜(Brassica
rapa)、棉花(Gossypium raimondii)、大豆(Giycine max)
同源蛋白的氨基酸序列。使用 DNAMAN Version 6
软件比对 ZmPP6C 与其他植物氨基酸水平的序列,
用 SMART 网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)分
析 ZmPP6C的结构域。
1.7 玉米 PP6C 表达的实时荧光定量 RT-PCR
(qRT-PCR)分析
以不同处理的“B73”玉米的cDNA第1链为模板,
玉米 Tubulin基因 (NM_001174192)为内参 , 测定
ZmPP6C的相对表达量。根据ZmPP6C与Tubulin的序
列设计qRT-PCR的引物: ZmPP6C_RT-F (5′-TACAAT
AGACCATCGGGACAGT-3′) 和 ZmPP6C_RT-R (5′-
GCACGGGAACAAAATCACA-3′); Tubulin_F (5′-AC
TTCATGCTTTCGTCCTACGCTCCA-3′)和Tubulin_R
(5′-CTGGGAGGCTGGTAGTTGATTC-3′)。按照全式
金Trans Start Green qPCR SuperMix试剂盒的说明书
操作, 反应体系为20 µL。用罗氏Light Cycler 480 II
Real-Time PCR System (Roche, 瑞士)进行qRT-PCR,
按照SYBR Green荧光染料相对定量PCR方法检测,
参照基因的2–ΔΔCt法[31]计算结果。经3次独立的生物
学重复, 并以此计算其标准差。
2 结果与分析
2.1 ZmPP6C基因的 cDNA的长度为 912 bp
根据NCBI中ZmPP6C的mRNA对应cDNA序列
(NM_001175500)设计引物, RT-PCR得到912 bp左右
的DNA片段(图1-A), 与预计扩增的ZmPP6C的ORF
片段大小一致。将扩增片段回收并连接到pEASY
Blunt-Simple载体上, 得到重组载体pEASY-ZmPP6C,
经PCR鉴定后的克隆再经Xba I和BamH I双酶切验证,
符合要求的克隆经酶切应具有一条912 bp左右的目
的基因条带及一条3830 bp左右的载体条带(图1-B)。
最后将上述符合要求的克隆测序显示 , 我们得到
cDNA克隆序列与NCBI中 ZmPP6C的mRNA对应
cDNA序列(NM_001175500)完全一致。
2.2 PP6C 基因家族在双子叶植物和单子叶植物
具有相同结构域和较高一致性
通过PCR的方法得到ZmPP6C的全长cDNA序列,
其ORF包含912个核苷酸残基, DNAMAN Version 6
软件推测其编码303个氨基酸残基、分子量为37.73
kDa的蛋白质, 等电点4.87 (http://web.expasy.org/
第 2期 原换换等: 玉米 ZmPP6C基因的克隆及其响应光质和胁迫处理的表达模式分析 173
图 1 ZmPP6C的 ORF的 cDNA片段的 RT-PCR扩增及其克隆
pEASY-ZmPP6C的双酶切鉴定
Fig. 1 RT-PCR fragment of ZmPP6C and double digestion of
pEASY-ZmPP6C using Xba I and BamH I
A: ZmPP6C的ORF的 cDNA片段的RT-PCR扩增, 泳道M为 1 kb
Plus DNA Ladder (TransGen Biotech, 中国北京), 泳道 1为 PCR
产物。B: 克隆 pEASY–ZmPP6C的双酶切, 泳道 M同(A), 泳道 1
为克隆 pEASY-ZmPP6C经 Xba I和 BamH I双酶切后获得约 912
bp和 3980 bp的条带。
A: RT-PCR fragment of ZmPP6C. Lane M and Lane 1 were loaded
with 1 kb Plus DNA Ladder (Transgen Biotech, Beijing, China) and
RT-PCR products, respectively. B: double enzyme digestion of
pEASY-ZmPP6C using Xba I and BamH I. Lane M and Lane 1 were
loaded with 1 kb Plus DNA Ladder (as above) and double digestion
products of pEASY-ZmPP6C using Xba I and BamH I, respectively.
protparam)。 使 用 SMART网 站 (http://smart.embl-
heidelberg.de/)对ZmPP6C的结构域分析发现ZmPP6C
中包含1个PP2Ac结构域(16~287, 丝氨酸/苏氨酸蛋
白磷酸酶2A的催化域 )(图2), 预测其还可能包括
Fmp27_SW (4~76, RNA聚合酶II转录起始保守域)、
Cir_N (7~34, CBF1互作共抑制因子CIR的N末端保
守域)、Metallophos (43~238, 具有水解酶活性域)、
Kelch (60~109, 蛋白结合活性域)、ZnF_UBR1 (137~
193, 锌指蛋白N末端底物识别域)和 Costars domain
(192~254, 结合肌动蛋白并调节细胞骨架和细胞运
动)。同时运用DNAMAN Version 6软件将ZmPP6C与
水稻、高粱和拟南芥的PP6C进行了氨基酸水平的序
列比对 , ZmPP6C与拟南芥AtPyPP1和AtPyPP3的一
致性均高达91.09%, 与水稻的一致性达96.04%, 与
高粱的一致性更高达99.67%。利用 DNAMAN Ver-
sion 6软件将该蛋白与来自拟南芥、水稻、高粱、谷
子、小麦、大麦、短柄草、油菜、大白菜、棉花、
大豆等不同种属的PP6C蛋白进行氨基酸序列水平
的系统发育树分析表明, PP6C在玉米和高粱中具有
高度一致性, 且无论是单子叶还是双子叶植物, 其
PP6C蛋白一致性均较高(图3)。PP6C基因家族在植物
进化中的高度一致性, 暗示其功能的高度保守。
图 2 玉米与拟南芥、水稻和高粱蛋白磷酸酶 6亚基的氨基酸序列比对和结构域分析
Fig. 2 Multiple sequence alignments and function domains of PP6Cs from Zea mays, Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, and Sorghum bicolor
利用 DNAMAN Version 6和 SMART网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行了氨基酸序列比对和结构域分析。AtFyPP1: 拟南芥
PP6C1, NP_175454; AtFyPP3: 拟南芥 PP6C3, NP_188632; OsPP6C: 水稻 PP6C, NP_001043937; SbPP6C: 高粱 PP6C, XM_002456138.1;
ZmPP6C: 玉米 PP6C, NP_001168971。
Multiple sequence alignments at amino acid levels and function domains were analyzed by DNAMAN Version 6 and SMART website (http://
smart.embl-heidelberg.de/). AtFyPP1: Arabidopsis thaliana PP6C1, NP_175454; AtFyPP3: Arabidopsis thaliana PP6C3, NP_188632; OsPP6C:
Oryza sativa PP6C, NP_001043937; SbPP6C: Sorghum bicolor PP6C, XM_002456138.1; ZmPP6C: Zea mays PP6C, NP_001168971.
174 作 物 学 报 第 42卷
图 3 玉米 PP6C与其他植物 PP6C的氨基酸水平的系统发育分析
Fig. 3 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of
ZmPP6C and other related PP6C
根据全长氨基酸序列利用 DNAMAN Version 6 软件构建进化
树。AtFyPP1: 拟南芥, NP_175454; AtFyPP3: 拟南芥, NP_188632;
OsPP6C: 水稻, NP_001043937; SbPP6C: 高粱, XM_002456138.1;
ZmPP6C: 玉米, NP_001168971; SiPP6C, 谷子, XP_004969614;
TaPP6C, 小麦, CDM83686, HvPP6C, 大麦, BAJ91769;
BdPP6C, 短柄草, XP_003567952; BnPP6C, 油菜, CDY36067;
BrPP6C, 大白菜, XP_009145698; GrPP6C, 棉花,
XP_012459064。
A neighbor-joining tree was constructed using DNAMAN Version 6.
AtFyPP1: Arabidopsis thaliana PP6C1, NP_175454; AtFyPP3:
Arabidopsis thaliana PP6C3, NP_188632; Oryza sativa:
NP_001043937; SbPP6C: Sorghum bicolor, XM_002456138.1;
ZmPP6C: Zea mays, NP_001168971; SiPP6C: Setaria italica,
XP_004969614; TaPP6C: Triticum aestivum, CDM83686; HvPP6C:
Hordeum vulgare, BAJ91769; BdPP6C: Brachypodium distachyom,
XP_003567952; BnPP6C: Brassica napus, CDY36067; BrPP6C,
Brassica napus, XP_009145698; GrPP6C, Gossypium raimondii,
XP_012459064; GmPP6C: Glycine max, XP_006605403.
2.3 ZmPP6C器官特异表达分析
基因在植物器官中的富集表达部位与其功能密
切相关, 为了研究玉米 ZmPP6C 的功能, 我们采用
荧光定量 PCR 技术检测了 B73 成株不同器官中
ZmPP6C 的表达水平, 结果显示该基因在 B73 的各
个器官中均有表达, 苞叶、叶柄和幼穗的相对表达
量较高, 叶片中表达量最高, 大约是根中的 8倍, 这
暗示 ZmPP6C 可能在玉米叶片中发挥更重要的作用
(图 4)。
2.4 ZmPP6C响应不同光质处理的表达模式分析
叶片不仅是植物光合作用的主要场所, 也是感
受不同光质的主要器官。器官特异性表达分析显示
ZmPP6C在叶片中表达量最高, 暗示着ZmPP6C很可
能参与植物对光的响应。为了明确ZmPP6C对不同光
质的响应 , 我们检测了玉米自交系B73幼苗在黑暗
和远红光(FRc)、红光(Rc)、蓝光(Bc)和白光(WLc)
条件下ZmPP6C的表达情况, 结果显示ZmPP6C在红
光和远红光条件下表达丰度相似, 均为黑暗条件下
的2倍(图5); 其白光和蓝光下的表达丰度分别是黑
暗下的3.2倍和1.6倍。这表明ZmPP6C的确能够受到
光的调节。
为了进一步了解 ZmPP6C 基因受光调节表达特
性, 我们进行了光质转换, 将黑暗中生长 13 d 的玉
米自交系 B73幼苗转到远红光(FR)、红光(R)、蓝光
(B)和白光(WL)中, 并于 0.25、0.5、1、2、4、8、12
和 24 h验证 ZmPP6C对各种光的响应能力。在转入
远红光、红光和白光后, ZmPP6C表达丰度均表现为
大幅度的升高; 其中在转入远红光 30 min、红光 15
min 和白光 30 min 的表达丰度达到峰值, 分别是黑
暗中的 15.7、9.0和 3.1倍(图 6)。在转入白光下 1 h
后, ZmPP6C的表达丰度下降到黑暗的 13%, 且在 24
h内基本稳定在黑暗的 13%~26%水平(图 6-C)。转入
远红光与转入白光类似, 但其表达丰度高于转入白
光中(图 6-A)。在转到红光下 30分钟后, ZmPP6C的
表达丰度急剧下降到黑暗的 3.9%, 在 1 h和 4 h时 2
次小的回升, 分别是黑暗的 0.8 倍和 2.2 倍; 从 8 h
后稳步上升, 直到 24 h达到黑暗的 7.2倍(图 6-B)。
从黑暗转蓝光后, ZmPP6C丰度上下波动较小, 推测
ZmPP6C响应蓝光的能力不强(图 6-D)。
2.5 ZmPP6C的表达对长日和短日处理的响应
为了更全面地了解 ZmPP6C 对光处理的反应能
力, 我们检测了 ZmPP6C 的表达对长日和短日处理
的响应。在长日条件下, ZmPP6C的表达在光照和黑
暗阶段, 各有一个明显的表达高峰, 分别出现在光
下 10 h时和转入黑暗 3 h时, 且是黑暗结束时的 4.8
倍和 3.1倍。短日处理下, ZmPP6C表达调控模式较
为复杂, 在光照和黑暗阶段分别有 2 个和 3 个表达
峰值(图 7)。光照阶段的表达峰值出现在光照后 2 h
和 8 h, 分别达到黑暗结束时的 1.9 倍和 5.5 倍(图
7-A); 黑暗阶段的表达峰值出现在进入黑暗后 6、10
和 14 h, 分别达到黑暗结束时的 2.5、9.9和 3.0倍(图
7-B)。可见 ZmPP6C的表达能响应长日和短日处理。
2.6 ZmPP6C的表达对胁迫处理的响应
由于拟南芥中 PP6通过 ABA信号途径, 来参与
对胁迫的调控[4], 为了进一步了解 ZmPP6C 对胁迫
第 2期 原换换等: 玉米 ZmPP6C基因的克隆及其响应光质和胁迫处理的表达模式分析 175
图 4 ZmPP6C的器官特异性表达的定量 RT-PCR分析
Fig. 4 qRT-PCR assays of ZmPP6C in different organs of maize
分别取玉米自交系 B73 (60 d)的不同器官用于 qRT-PCR分析, 包括根、茎、叶、雄花、叶枕、叶鞘、花丝、幼穗、花柄和苞叶。柱状
图显示的为 3次独立的生物学重复 ZmPP6C/Tubulin的相对平均值, 误差线代表标准差。
Different tissues of 60-day-old maize inbred line B73, including root, stem, leaf, stamen, pulvinus, sheath, pedical, young ear, pistil, and bract
were harvested for qRT-PCR assays. Each column shows the mean relative expression of ZmPP6C/Tubulin of three biological repeats. Error
bars indicate the standard deviation.
图 5 各种持续光质条件下 ZmPP6C转录表达的定量 RT-PCR
分析
Fig. 5 qRT-PCR assays of ZmPP6C expression under different
continuous light conditions
玉米自交系 B73的幼苗在黑暗或者持续远红光(FRc, 5 µmol m−2
s−1)、持续红光(Rc, 223 µmol m−2 s−1)、持续蓝光(Bc, 130 µmol m−2
s−1)或者持续白光(WLc, 170 µmol m−2 s−1)下生长 13 d。柱状图代
表三次独立的生物学重复 ZmPP6C/Tubulin的相对平均值, 误差
线代表标准差。
The seedlings of maize inbred line B73 were grown in continuous
far-red light (FR, 5 µmol m−1 s−1), red light (R, 223 µmol m−2 s−1),
continuous blue light (B, 130 µmol m−2 s−1), or continuous white
light (WL, 170 µmol m−2 s−1) for 13 d. Each column shows the
mean relative expression of ZmPP6C/Tubulin of three biological
repeats. Error bars indicate the standard deviation.
的响应 , 我们检测了 ZmPP6C 的表达对盐渍 (200
mmol L−1 NaCl)、高渗透(20% PEG-6000)和淹水(灌
水没根)处理的响应。结果表明, 在 0~3 h, 无论是否
盐渍处理 ZmPP6C 的表达变化不明显, 维持在处理
前的 0.9~1.2 倍(图 8-A); 在 6 h, 非盐渍处理样品
ZmPP6C 的表达水平上升到处理前的 2 倍, 而盐渍
处理的表达仍未见明显变化; 在 12 h, 非盐渍处理
样品 ZmPP6C 的表达下降, 而盐渍处理表达上升,
二曲线的交叉点出现在处理前的 0.8 倍; 在 24 h 和
48 h, 非盐渍处理样品 ZmPP6C 的表达水平继续到
处理前的 0.4倍, 而盐渍处理表达继续上升 1.1倍(24
h)和 2.6 倍(48 h)。20% PEG-6000 处理类似于 200
mmol L−1 NaCl, 只是 20% PEG-6000 处理 1 h,
ZmPP6C 的表达量迅速下降, 并且 ZmPP6C 的较低
表达水平(处理前的 0.2~0.6 倍), 一直维持到 24 h;
而 20% PEG-6000处理 48 h, ZmPP6C的表达水平上
升到处理前的 4.5 倍(图 8-B)。淹水(灌水没根)处理
3~4 d, ZmPP6C 的表达下降到未处理的 20%~30%;
处理 5 d和 7 d, ZmPP6C的表达上升到未处理的 1.3
倍和 4.1倍; 随着恢复正常温室生长条件 3 d和 7 d,
ZmPP6C 的表达上升到未处理的 3.0 倍和 6.9 倍(图
8-C)。可见, 与非胁迫处理相比, 盐渍和高渗透处理
抑制 6 h ZmPP6C 的表达; ZmPP6C 的表达对 200
mmol L−1 NaCl处理的响应早于对 20% PEG-6000处
理; 盐渍、高渗透和淹水处理均导致 ZmPP6C 的表
达显著上调。
3 讨论
PP6C 是光敏色素蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的
催化亚基[22,32], 催化磷酸化的蛋白质分子去磷酸化
反应, 在光信号转导中发挥着重要作用[1,2,7]。光是影
响植物生长发育最重要的环境因素之一, 首先光是
能量物质, 光提供了植物光合作用的能量[33-35], 光
合作用是植物生命活动过程中的重要组成部分, 是
作物产量和品质的基础; 缺乏光照会导致植株生长
176 作 物 学 报 第 42卷
图 6 黑暗转入不同光质条件下 ZmPP6C转录表达的定量 RT-PCR分析
Fig. 6 qRT-PCR assays of ZmPP6C expression during transition from darkness to different light conditions
玉米自交系 B73的幼苗在黑暗生长 13 d后转入远红光(FR, 5 µmol m−2 s−1)(A)、红光(R, 223 µmol m−2 s−1)(B)、白光(WL, 170 µmol m−2
s−1)(C)或者蓝光(B, 130 µmol m−2 s−1)下(D) 0、0.25、0.5、1、2、4、8、12和 24 h的 ZmPP6C表达模式。柱状图显示三次独立的生物
学重复 ZmPP6C/Tubulin的相对平均值, 误差线代表标准差。
The seedlings of maize inbred line B73 were grown in the dark for 13 d, then in far-red light (FR, 5 µmol m−2 s−1) (A), red light (R, 223 µmol
m−2 s−1) (B), white light (WL, 170 µmol m−2 s−1) (C), or blue light (B, 130 µmol m−2 s−1) (D) for 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, or 24 h. Each column
shows the mean relative expression of ZmPP6C/Tubulin of three biological repeats. Error bars indicate the standard deviation.
图 7 长日和短日条件下 ZmPP6C转录表达的定量 RT-PCR分析
Fig. 7 qRT-PCR assays of ZmPP6C under long day and short
day conditions
玉米自交系 B73的幼苗在长日条件(LD, 16-h-光照/8-h-黑暗)(A)
或者短日条件(SD, 8-h-光照/16-h-黑暗)(B)生长 13 d, 然后每隔 2
个小时取样一次。柱状图显示三次独立的生物学重复
ZmPP6C/Tubulin的相对平均值, 误差线代表标准差。
The seedlings of maize inbred line B73 were grown in long-day
condition (LD, 16-h-light/8-h-dark) (A) or short-day (SD,
8-h-light/16-h-dark) (B) for 13 d, then sampled every two hours.
Each column shows the mean relative expression of
ZmPP6C/Tubulin of three biological repeats. Error bars indicate the
standard deviation.
受阻、株高增加、叶面积减少、叶片变黄[36-37]。再
者, 光是信号物质, 植物通过光线提供的信息(光照
节律、光照强度和光质比例等)来及时调控其生长和
发育进程, 包括种子萌发、茎节伸长、向光性、避
荫性(shade avoidance)和开花期, 还包括作物的产量
和品质等[38-41]。本研究表明 ZmPP6C 在玉米的叶片
中表达量最高(图 4), 同时 ZmPP6C的表达响应不同
光质处理(图 5)、黑暗到光的转换(图 6), 以及长日和
短日处理(图 7)等。ZmPP6C的表达响应远红光和红
光处理, 但受两种光的表达模式差异较大, 转入远
红光 30分钟达到峰值, 然后迅速下降, 直到 24 h一
直保持较低的水平(图 6-A); 转入红光 15 min达到峰
值, 迅速下降后表现迂回上升, 直到 24 h 达到黑暗
的 7.2倍(图 6-B)。拟南芥、水稻和玉米中的研究表
明, 光敏色素 B (phyB)是红光的最主要受体, 而光
敏色素 A (phyA)主要是负责植物对远红光的反应,
它们与植物光形态建成、避荫性以及生物产量等性
状密切相关[38,41]。另外, PHYA的过量表达或者 PHYB
缺失突变体能显著地引起提早开花 [ 34 ]; PHYA 和
PHYB转基因的植株导致节间缩短、株高降低、株型
紧凑、光合作用提高、促进增产[41-46]。研究表明豌
豆 PP6能够与拟南芥中光敏色素 A (phyA)和光敏色
素 B (phyB)互作; 豌豆 PP6基因在拟南芥中异源转
基因导致开花延迟, 而拟南芥的 2个 PP6C同源基因
AtFyPP1 和 AtFyPP3 表达的下调却引起开花提前[2]。
第 2期 原换换等: 玉米 ZmPP6C基因的克隆及其响应光质和胁迫处理的表达模式分析 177
图 8 非生物胁迫条件下 ZmPP6C转录表达的定量 RT-PCR分析
Fig. 8 qRT-PCR assays of ZmPP6C under different abiotic
stress conditions
玉米自交系 B73的幼苗在正常温室条件下(16-h-光照/8-h-黑暗,
22℃)生长到 13天的幼苗转入到盐渍(200 mmol L–1 NaCl)(A); 高
渗透(20% PEG-6000)(B)分别处理 0、1、3、6、12、24和 48小
时; 淹水(灌水没根)处理 3、4、5或 7 d, 然后恢复正常温室条件
3 d和 7 d (C)。正常温室条件下生长、未处理的苗子作为对照。
柱状图显示三次独立的生物学重复 ZmPP6C/Tubulin的相对平均
值, 误差线代表标准差。
The seedlings of maize inbred line B73 were grown in normal
green-house condition (16-h-light/8-h-dark, 22℃) for 13 d, then
treated with high salt (200 mmol L–1 NaCl) (A); high osmosis (20%
PEG-6000) (B) for 1, 3, 6, 12, 24, and 48 h; waterlogging for 3, 4, 5,
or 7 d, then sent back to the normal green-house condition for more
3 d, or 7 d (C) (see the Material and Methods above). The seedlings
grown in normal green-house condition were used as CK. Each
column shows the mean relative expression of ZmPP6C/Tubulin of
three biological repeats. Error bars indicate the standard deviation.
尽管对光敏色素的激酶活性还没有完全了解, 但业
已证明它们磷酸化与其活性密切相关 [38]; 很可能
AtFyPP1 和 AtFyPP3 通过与 phyA 和 phyB 的互作,
导致它们磷酸化的丧失, 从而影响其活性。由于玉
米仅有一个 ZmPP6C 基因, 而玉米 PHYA 和 PHYB
基因各有 2个拷贝, ZmPP6C与 ZmphyA1、ZmphyA2,
ZmphyB1和ZmphyB2的互作模式, 以及在互作与它
们活性之间的关系有待进一步验证。
模式植物拟南芥中的研究表明, 高等植物开花
的光周期调控是由光信号转导途径的基因与开花相
关的生物钟途径 (circadian clock)相关基因如 GI
(GIGANTEA)、CO (CONSTANS)和 FT (FLOWERING
LOCUS T)共同完成的 [47-50]。在光周期敏感自交系
CML288中, CO的同源基因 ZmCOL的表达在长短日
照条件下均有 2 个峰值 [51,52]。本研究表明玉米
ZmPP6C的表达响应长日和短日处理(图 7), ZmPP6C
在长日下的第 1 个高峰是光照后 10 h, 低谷是进入
黑暗之前(图 7), 这与光周期敏感自交系 CML288的
ZmCOL 完全一致 [51,52]; 我们还发现 , 在短日照下
ZmPP6C 表达高峰发生的时间都提前于长日照, 前
人对 ZmGI研究也有着同样的现象[51,52]。ZmPP6C与
开花调控基因 ZmGI、ZmCOL 和 ZmFT 之间是否存
在关联, 能否利用RNAi或转基因技术修饰 ZmPP6C
基因进行开花性状的改良, 值得探讨。此外, 水稻基
因组中含有 5 个 PP2Ac 类磷酸酶基因, 在盐敏感水
稻品种 9311中OsPP2Ac-2、OsPP2Ac-3和OsPP2Ac-5
的表达上调、OsPP2Ac-4 的表达下调; 在耐盐水稻
品种“兰胜”中OsPP2Ac-4的表达上调[5,53]; 并且小麦
TaPP2Ac-1 基因的表达受高盐、ABA 和低温诱导[25]。
本研究表明 ZmPP6C 不但包含 1 个 PP2Ac 结构域,
同时 ZmPP6C 的表达响应盐渍、高渗透和淹水胁迫
处理, 表明玉米 ZmPP6C 参与了植株对胁迫的应答,
但其作用机制需要进一步的验证。
4 结论
ZmPP6C 与高粱和拟南芥的 PP6C 具有高度同
源性, 具有 PP2Ac结构域; ZmPP6C在玉米叶片中高
表达, 能受到不同光质的影响, 特别响应远红光和
红光处理; 也对长日和短日处理响应, 其表达在长
日条件下的光照和黑暗阶段各有 1 个明显的表达高
峰, 在短日条件下的光照和黑暗阶段分别有 2个和 3
个表达峰值; 同时, ZmPP6C还响应高渗透、盐渍和
淹水等胁迫处理, 出现明显的上调表达。ZmPP6C在
玉米光信号转导、开花与胁迫应答方面发挥重要作
用, 其分子与生化机制值得进一步探讨。
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