全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(5): 806−815 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2009ZX08009-090B)项目资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 谢宗铭, E-mail: xiezm2008@yahoo.com.cn; Tel: 0993-6683583; 陈受宜, E-mail: sychen@genetics.ac.cn, Tel:
010-64806621
第一作者联系方式: E-mail: liyue6905@126.com, Tel: 13999502286
Received(收稿日期): 2012-09-25; Accepted(接受日期): 2012-12-12; Published online(网络出版日期): 2013-01-28.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130128.0920.011.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00806
棉花转录因子 GhGT30基因的克隆及转录功能分析
李 月 1,2,3 孙 杰 1 陈受宜 2,* 谢宗铭 3,*
1 石河子大学农学院 / 新疆兵团绿洲生态农业重点实验室, 新疆石河子 832003; 2 中国科学院遗传与发育生物学研究所 / 国家植物
基因组重点实验室, 北京 100101; 3 新疆农垦科学院 / 分子农业技术育种中心, 新疆石河子 832000
摘 要: Trihelix转录因子广泛参与植物生长发育、非生物胁迫应答等一系列生理活动。本研究根据表达序列标签(EST)
电子拼接, 结合 cDNA 末端快速扩增技术(RACE)和 RT-PCR 技术, 从棉花中克隆了一个 cDNA 全长为 2210 bp 的新
基因, 其开放读码框为 2025 bp, 编码一个 675氨基酸的蛋白, 分子量约 76.26 kD, 等电点为 6.21。SMART蛋白结构
预测发现, 该基因在N端和C端各有一个 trihelix结构域, 属于GT-2型 trihelix转录因子, 被命名为GhGT30 (GenBank
登录号为 JQ013098)。氨基酸序列比对显示, 该蛋白和其他高等植物的 GT 蛋白有较高的同源性。进化树分析表明,
GhGT30基因和大豆 GmGT-2B基因处在同一进化树分支。拟南芥原生质体中瞬时表达分析表明, GhGT30主要定位于
细胞核中。实时荧光定量 PCR分析表明, 该基因在棉花的花、纤维(12 DPA)中的表达量明显高于根、茎、叶及胚珠
(0 DPA), 同时, 该基因对干旱、高盐、低温及脱落酸(ABA)等处理都有一定程度的响应, 推测该基因对棉花非生物胁
迫的调控起重要作用。
关键词: trihelix转录因子; 棉花; 非生物胁迫; GhGT30
Cloning and Transcription Function Analysis of Cotton Transcription Factor
GhGT30 Gene
LI Yue1,2,3, SUN Jie1, CHEN Shou-Yi2,*, and XIE Zong-Ming3,*
1Agricultural college of Shihezi University / Key Laboratory of Oasis Eco-Agriculture, Xinjiang Production and Construction Group, Shihezi
832003, China; 2 National Key Laboratory of Plant Genomics / Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Bei-
jing 100101, China; 3 Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science / Center for Molecular Agrobiotechnology and Breeding, Shihezi
832003, China
Abstract: Trihelix transcription factors play an important role in the regulation of plant growth and development, as well as in
their response to many kinds of abiotic stress. According to expressed sequence tag (EST), full-length cDNA sequence of trihelix
transcription factor was cloned from upland cotton (Gossypium hirsutum L.) using the methods of rapid-amplification of cDNA
ends (RACE) and RT-PCR. Sequence analysis showed that the full-length of GhGT30 (GenBank accession No. JQ013098) was
2210 bp, containing a 2025 bp open reading frame which encoded a protein of 675 amino acids with predicted molecular weight
of 76.26 kD and a isoelectric point of 6.21. SMART analysis showed GhGT30 with each trihelix domain at N-terminal and
C-terminal, belonging to GT-2-type factors. Amino acid sequence alignment revealed that N-terminal of GhGT30 shared high
degree of identity with other higher plant GT proteins. The phylogenetic tree showed that GhGT30 was located at the same branch
with GmGT-2B. Transient expression of recombinant plasmid GhGT30/PBI221-GFP in Arabidopsis protoplasts showed that
GhGT30 was located in cell nuclei. Real-time quantitative PCR (qPCR) showed that GhGT30 was expressed in a higher level in
flower, fiber (12 DPA) than in root, stem leaf, and ovule (0 DPA). The gene was differentially respondes to various abiotic stresses
(dehydration, high salinity, and low temperature) and ABA, indicating that it may play important roles in response of cotton plant
to abiotic stresses.
Keywords: Trihelix transcription factor; Cotton; Abiotic stress; GhGT30
第 5期 李 月等: 棉花转录因子 GhGT30基因的克隆及转录功能分析 807


植物在生长发育过程中会面临各种不利的环境
胁迫, 包括生物胁迫和非生物胁迫(高盐、干旱、低
温等), 都对农作物生产造成影响, 严重时可使农作
物的平均产量损失超过 50% [1]。为了适应这些不利
的环境条件, 植物已经形成了一系列生理、代谢以
及系统的防御体系以维持其生命和持续生长。
转录因子又称反式作用因子, 是指能够与真核
基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合
的蛋白质, 通过它们之间的相互作用, 激活或抑制
基因的转录。植物中存在大量的转录因子, 拟南芥
和水稻中大约分别有 1581 个和 1611 个转录因子[2],
它们对植物的逆境信号转导起着非常重要的作用[3-4]。
当植物受到外界的胁迫时 , 通过一系列信号传递 ,
激发转录因子与相应的顺式作用元件结合, 启动特
定的基因转录表达, 引起植物生理生化的变化, 从
而调控植物的抗逆性[5]。
trihelix转录因子是植物中特有的一个小家族[6],
大约有 60 多个亚家族[4]。由于其识别的 DNA 基序
称为 GT 元件[7]该家族又称为 GT 因子。GT 元件最
早是参与光应答反应而受到广泛关注的。自 1987年,
Green等[8]从豌豆细胞核 rbcS-3A基因的启动子中鉴
定出第 1个 GT元件以来, 已经在大豆(Glycine max
Merr.) Chsl5/SCaM-4、玉米(Zea mays L.) lat52、菠
菜(Spinacia oleracea L.) rps1和拟南芥(Arabidopsis)
cab2/rbcS-1A、水稻(Oryza sativa) phyA等植物基因
的启动子中克隆到相似功能的 GT 元件[6,9-16]。目前
已经分离得到许多植物 GT 元件和 GT 因子, GT 因
子与相应的 GT 元件或其他转录因子的调节元件特
异结合, 产生功能的多样性是近年来的研究热点。研
究表明 GT 因子不仅参与了光应答基因的调控[15,17-21],
而且还广泛参与植物生长发育的各个过程, 例如花
器官形态建成 [22-24]、表皮毛和气孔形成 [25-27]、胚
囊[28]、种子离层[29-30]和植物晚期胚胎[31]等多种器官
的发育。近年来, 越来越多的报道认为, trihelix转录
因子受非生物胁迫包括冷害、干旱和高盐[27,32-34]的
强烈诱导, 并广泛参与植物对非生物胁迫的应答反
应。除此之外, GT 基因也参与生物胁迫应答反应,
拟南芥 AtGT-3b在病原体胁迫处理 30 min内, 能够
快速诱导转录[10]。
棉花既是主要的纤维作物, 也是重要的油料作
物, 干旱、盐碱、低温等非生物逆境, 不仅限制其生
长, 而且还影响其产量及纤维品质, 给棉花生产造
成极大的危害。研究棉花的耐逆分子机制将为利用
转基因手段改良棉花抗逆性奠定基础。本研究采用
表达序列标签(EST)的电子拼接及 cDNA 末端快速
扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术,
从陆地棉品种新陆早 26 中克隆了一个 GT 基因
GhGT30, 并对其序列特征、表达特性、在非生物胁
迫下表达模式及亚细胞定位进行了研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料及处理
棉花品种新陆早 26由新疆农垦科学院提供。将
棉花种子均匀播种于装满蛭石的营养钵中 , 在
(25±2)℃和连续光照下培养。取一部分幼苗(15 d的
棉苗)分别进行干旱、高盐、4℃低温和外源 ABA等
处理, 以正常生长的幼苗为对照。同时将另一部分
正常生长的幼苗移至土壤进一步生长, 于花期, 分
别采集花、开花后当天胚珠以及开花后 12 d (12 days
post anthesis, DPA)纤维, 提取总 RNA, 用于组织表
达分析。干旱处理为小心拔出 15 d龄棉苗, 滤纸吸
干根表面水分 , 室温下进行大气干旱 ; 盐处理为
200 mmol L–1 NaCl溶液培养; 冷处理为持续光照下,
4℃培养箱处理; 外源 ABA 处理为以 100 μmol L–1
ABA溶液浸幼苗的根。将干旱、NaCl和 ABA处理
的植株放在 25℃培养箱中培养。分别采集胁迫处理
1、3、6和 12 h的棉株叶片, 同时采集对照根、茎、
叶, 分包装后, 迅速置液氮中, 用于总 RNA提取。
1.2 总 RNA的提取纯化和 cDNA的制备
采用 CTAB 法提取棉花不同组织和不同处理时
间点叶片的总 RNA。按照 TransGen Biotech (公司)
TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix
Kit操作说明合成 cDNA, –20℃保存备用。
1.3 GhGT30基因全长的获得
经 Blast 分析, 候选基因的 EST 不包含完整的
ORF, 缺少 3′端序列, 需进一步用 3′RACE方法克隆
全长基因。根据已知 EST序列, 设计嵌套引物 GSP2
和 NGSP2 (表 1), 以棉花总 RNA 为模板 , 按照
Clontech SMART RACE cDNA Amplification Kit 的
说明克隆 3′端 , 并测序。将已有的 EST 序列和
3′RACE片段用DNAstar软件拼接和组装, 设计长距
离 PCR引物 LongF和 LongR (表 1), 扩增目的基因
全长 cDNA。据 GhGT30基因的全长序列, 设计全长
引物 GT30P1和 GT30P2 (表 1), 并在 2条引物上分
别引入 Sal I/Sal I酶切位点。用高保真酶 KOD FX
(TOYOBO)进行 PCR 扩增, 将扩增产物回收, 连接
808 作 物 学 报 第 39卷

到 pMD 18T (TaKaRa)载体并测序验证。对测序正确
的阳性克隆提取质粒, 命名 pMD 18T-GhGT30。高
保真酶 KOD FX(TOYOBO)扩增反应体系含 2×PCR
buffer 25 μL; 2 mmol L–1 dNTPs 10 μL; KOD FX 1 μL;
模板 1 μL; 正反向引物各 1 μL, 补充水至 50 μL。反
应条件为 94 2 min; 98 10 s℃ ℃ , 60 30 s, 68 2 ℃ ℃
min, 30个循环; 68 5 min℃ 。
1.4 蛋白序列及进化树分析
将所得的基因 ORF 用 DNAStar 软件翻译成蛋
白序列, 并用在线软件 EXPASy 的 ProtParam tool
在线程 (http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/prot
param)预测蛋白的分子量和等电点。由 DNAMAN
软件完成多序列比对, 用 MEGA 程序(Ver.4.0)分析
该蛋白同源性, 构建系统进化树。
1.5 实时定量 PCR分析
根据 GhGT30 基因的 EST 序列设计定量 PCR
引物 Gh30rF1和 Gh30rR1 (表 1), 以棉花 Ubiquitin7
基因(GenBank 登录号为 DQ116441)的引物 U7F、
U7R为内参。利用 Roche LightCycler 480II实时定
量 PCR仪对棉花根、茎、叶、0天胚珠和 12 d的纤
维及各个胁迫处理时间点的样品进行 Real-time
PCR分析。根据 TOYOBO的 SYBR qPCR Mix Kit
说明操作, 反应体系含 2 μL一链 cDNA, 10 μmol L–1
正反向引物各 0.5 μL、10 μL SYBR qPCR Mix, 用
ddH2O补至 20 μL。反应条件为 95 30 s; 95 5 s, ℃ ℃
58 30 s, 40℃ 个循环; 72 30 s℃ 。采用 2–ΔΔCT法分析
数据, 确定基因的相对表达量。
1.6 GhGT30 蛋白在拟南芥原生质体中亚细胞
定位分析
用 pBI221作为瞬时表达载体, Sal I限制性内切

表 1 本研究所用的引物
Table 1 Primers used in this study
引物
Primer
序列
Sequence (5′–3′)
GSP2 TCCTCCTCATCATCATAGCCAGC
NGSP2 CTGCCCAACACAACAAG
LongF ATGTTTGATGGAGTGCCAGA
LongR GTCATTAGCGATTGTAATACC
Gh30rF1 TGGGTTCAAGAGGAGTGCAGACAA
Gh30rR1 TGCTGCTGGCTATGATGATGAGGA
U7F AGAGGTCGAGTCTTCGGACA
U7R GCTTGATCTTCTTGGGCTTG
GT30P1 ACGGTCGACATGTTTGATGGAGTGCC
GT30P2 ACGGTCGACGAATTCAAATTCAAAACCTGG

酶酶切 pMD 18T-GhGT30 质粒, 获得双酶切后的
GhGT30 片段, 凝胶回收后连接到经过同样粘性末
端的 pBI221-GFP载体, 与GFP基因的 5′端融合, 构
建由 35S启动子驱动GFP基因及其融合蛋白表达的
GhGT30-GFP 融合蛋白。参照 http://genetics.mgh.
harvard.edu/sheenweb/protocols/方法, 将 GFP-GhGT30
融合蛋白和 pBI221-GFP 载体质粒, 转化到拟南芥
原生质体中, 用 Leica TCS SP5显微镜观察分析。以
不含有目的基因的 pBI221-GFP 融合蛋白作为正对
照。
2 结果与分析
2.1 GhGT30基因全长 cDNA的克隆
根据已知 EST序列, 经 NCBI Blast分析, 发现
该 EST序列缺少 3′端。通过 3′RACE和 RT-PCR, 从
棉花中克隆了该基因的 3′端序列(图1-A)长度为 1238
bp, 与已知的 EST 序列比对拼接, 进行长距离 PCR
扩增(图 1-B), 获得全长为 2210 bp 的 cDNA 序列,
分析发现该基因的最大开放阅读框(ORF) 2025 bp,
编码 675 个氨基酸残基。将该基因命名为 GhGT30,
并提交 GenBank (登录号为 JQ013098)。

图 1 GhGT30基因的克隆
Fig. 1 Cloning of gene GhGT30
A: 3′RACE PCR产物; M: DNA marker III; 1: 3′RACE第 1轮扩增
产物; 2: 3′RACE第 2轮扩增产物; B: 长距离 PCR产物。
A: 3′RACE PCR product; M: DNA marker III; 1: PCR product for
the first round; 2: PCR product for the second round; B: Long
distance PCR product;

2.2 GhGT30基因生物信息学分析
根据测序结果对该基因进行相关的生物信息学
分析。蛋白的氨基酸序列分析表明(图 2-A), GhGT30
蛋白由 675 个氨基酸组成, 其中: 含强碱性氨基酸
(K和 R) 51个, 强酸性氨基酸(D和 E) 92个, 疏水性
氨基酸(A、I、L、F、W和 V) 174个, 极性氨基酸(N、
C、O、S、T和 Y) 212个。GhGT30蛋白分子量为
第 5期 李 月等: 棉花转录因子 GhGT30基因的克隆及转录功能分析 809


76.26 kD, 理论等电点为 6.21, 带正电荷的氨基酸
(Arg+Lys)占 12.1%, 带负电荷的氨基酸(Asp+Glu)占
13.6%, 蛋白不稳定系数(Instability index)为 59.49,
是个不稳定蛋白。用 SMART (http://smart.emblhei-
delberg.de/)预测蛋白表明, GhGT30基因在 N端和 C
端各有一个 trihelix SANT结构域, 分别由第 117的
组氨酸(H)起到 174 的酪氨酸(Y)以及第 518 位的亮
氨酸(L)到 584位的酪氨酸(Y)组成(图 2-B)。

图 2 GhGT30蛋白的氨基酸序列(A)以及蛋白结构示意图(B)
Fig. 2 Amino acid sequence and schematic diagram of GhGT30
黑色线条和 表示 trihelix结构域。The black line and stand for the trihelix domain.

2.3 蛋白多序列比对与进化树分析
以 SMART预测蛋白序列表明, GhGT30基因在
N端和 C端各有一个 trihelix SANT结构域(图 2-A)。
根据 trihelix 转录因子家族基因种类分类方法 ,
GhGT30基因应属于 GT-2类型转录因子。在整个氨
基酸水平上, GhGT30和GmGT-2B有 43%的相似性。
在 N端和 C端 trihelix结构域水平上, 这 2个基因的
相似性分别为 80%和 73% (图 3-A, B)。系统进化树
分析表明, GhGT30 基因和 GmGT-2B 基因的蛋白距
离最近, 共同组成一个分支, 且都被聚类到 GT-2 型
中(图 4), 这和前面的 GhGT30 基因应属于 GT-2 类
型转录因子的推断也是相一致的。

图 3 GhGT30基因的氨基酸序列比对
Fig. 3 Multiple alignments of the amino acid sequences from various GT factors
A: N端 trihelix结构域氨基酸序列比对; B: C端 trihelix结构域氨基酸序列比对; 图中虚线表示 trihelix结构域中的螺旋结构;
NLS表示可能的核定位信号。
A: amino-terminal trihelix DBD; B: carboxyl-terminal trihelix DBD; Dotted line denotes α-helices in the trihelix DBDs;
NLS indicates putative nuclear localization signal.
810 作 物 学 报 第 39卷


图 4 GT蛋白系统进化树
Fig. 4 Phylogenetic tree of GT proteins
多种植物的系统进化树用 MEGA4.0程序构建, 分支上的数字 Bootstrap验证该树支可信度的百分比。
The analysis was performed by using MEGA4.0 program with neighbor joining method. Number on the cluster nodes is the percentage of
homology among GT verfied by bootstrap. Accession numbers are as follows: AtGT-2 (At1g76890), AtGTL1 (At1g33240), AtGTL2
(At1g76880, also known as AtDF1), DF1 (BAB41080), GmGT-2A (EF221753), GmGT-2B (EF221754), OsGT-2 (CAA48328), AtGT-1
(At1g13450), AtGT-4 (At3g25990), AtGT-3a (At5g01380), AtGT-3b (At2g38250).

2.4 GhGT30基因的诱导表达和组织表达分析
qPCR结果表明(图 5), GhGT30基因在各处理下
表达趋势不同 , 基因表达量存在明显差异。200
mmol L–1 NaCl处理后, 基因表达呈现复杂趋势, 在
处理 1 h后表达量迅速提高, 在 3 h后又急剧下降, 6
h后又快速上升达到最大, 之后又回到 3 h的表达水
平上。在干旱和 ABA处理下都呈现先升高后下降的
表达趋势, 具体的表达模式也不同。在干旱胁迫下,
基因在处理 1 h 后急速增加, 达到其最大转录水平,
之后随着时间延长, 表达量慢慢下降, 12 h后下降到
最低。而 ABA处理下, 随着时间的延长基因表达量
逐渐增加, 在 6 h达到最大转录水平, 在 12 h其转录
虽有下降, 但仍大于 0 h。在冷处理下, 基因在 6 h
的表达量最低, 之后虽有增加, 但仍低于未处理前。
基因表达模式的差异说明 , 在不同的胁迫处理下 ,
基因可能参与不同的调控途径。
图 6表明, GhGT30基因虽然在各种组织里都有
表达, 但表达水平不同。在花和纤维中(12 DPA)的表
达量最高, 在胚珠、根、茎和叶中的表达量相对很
低, 推测 GhGT30基因可能与棉花的纤维发育有关。
2.5 GhGT30基因的亚细胞定位分析
蛋白预测发现 GhGT30蛋白包含了核定位信号,
通过原生质体瞬时表达系统检测 GhGT30 蛋白的核
定位情况。将 GhGT30 基因连接到载体 pBI221 上,
构建了GhGT30-GFP的融合蛋白(图 7), 并将此融合
蛋白和对照 pBI221-GFP 融合蛋白分别转化到拟南
芥原生质体中, 暗培养 16~18 h 后在激光扫描共聚
焦显微成像系统下观察定位情况。结果表明, 对照
pBI221-GFP 融合蛋白的绿色荧光分布在细胞核和
细胞质中, 而 GhGT30-GFP 融合蛋白的绿色荧光富
集于细胞核区域中, 红色荧光表示叶绿体的位置(图
8)。这些结果表明 GhGT30蛋白是核定位蛋白, 这与
转录因子是核定位的特征是一致的。
第 5期 李 月等: 棉花转录因子 GhGT30基因的克隆及转录功能分析 811



图 5 各种非生物胁迫下基因的表达谱
Fig. 5 Expression profiles of GhGT30 under various abiotic stresses


图 6 组织表达分析
Fig. 6 Tissue-specific expression profiles of GhGT30

图 7 35S:: GhGT30-GFP and 35S::GFP融合示意图
Fig. 7 Schematic representation of 35S:: GhGT30-GFP fusion
construct and 35S::GFP construct

3 讨论
已有的研究表明, 在逆境条件下, 植物在细胞
水平会发生一系列的生理生化反应。首先是植物对
环境刺激的多途径感应, 接着将这种刺激信号传递
到细胞内部, 细胞内部发生磷酸化级联反应, 将信
号传递到胁迫应答转录因子。转录因子与顺式作用
元件结合, 启动相关抗逆基因的表达, 从而增强植
物的逆境耐受性。因此, 转录因子在植物逆境信号
传递过程中发挥着关键作用。近年来, 对一些模式
植物的研究表明, 转录因子在植物抵御非生物胁迫
的防御过程中起着重要作用。大豆 GmWRKY21的转
基因拟南芥植株的耐冷性增强, GmWRKY54 的过表
达提高了拟南芥的耐盐性和耐旱性, 而 GmWRKY13
增加了拟南芥对盐和旱的敏感性, 减少了对ABA的
敏感性[35]。OsWRKY11 的超表达提高了植物的耐热
性和耐旱性[36]。棉花 GhDREB1L和 GhDBP2/3基因
的表达不仅受低温、高盐和干旱的诱导, 并通过和
DRE元件发生特异性结合来调控棉花对非生物胁迫
反应[37]。水稻的 Osmyb4 转基因植株能显著提高植
株的耐干旱和高盐性[38]。拟南芥的 AtMYB2[39]和
AtMYB60[40]参与了植物的抗旱胁迫应答。相对于
MYB、DREB、WRKY 等大的转录因子家族在植物
耐受性的研究, 有关 trihelix小家族的研究报道相对
812 作 物 学 报 第 39卷


图 8 GhGT30蛋白在拟南芥原生质体中的亚细胞定位分析
Fig. 8 Subcelluar localization of GhGT30 as revealed by GFP fusion proteins in Arabidopisis protoplasts

较少, 其机制也不是很清楚, 尤其是在非生物胁迫
下, 棉花中 trihelix基因的表达模式更是鲜有报道。
植物特有的 trihelix 转录因子家族尽管相对较
小, 但与其他转录因子家族相比, 它具有独特的特
点。trihelix 转录因子的 DNA 结合域富含碱性、酸
性氨基酸以及脯氨酸/谷氨酸, 含 3 个 α-螺旋, 呈螺
旋-环-螺旋-环-螺旋构象[6,15,21]。trihelix转录因子(GT
因子)含有 1 个或 2 个 DNA 结合域, 它们各自与特
定的 GT 元件结合[6-7], 根据其识别的结合元件的不
同, 可以分为 3 类, GT-1 和 GT-3 型只有一个 DNA
结构域结合 Box II (5′-GTGTGGTTAATATG-3′)和
5′-GTTAC-3′序列[8,14], GT-2型转录因子有 2个 DNA
结构域 , 识别 GT-2box (5′-GCGGTAATTAA-3′)和
GT-3box (5′-GAGGTAAATCCGCGA-3′)[15]。SMART
结构预测显示, GhGT30 蛋白在 N 端和 C 端各有一
个 trihelix SANT结构域, 符合GT-2型转录因子的特
征。同源性和进化树分析结果表明, GhGT30基因和
GmGT-2B 基因具有较高的同源性, 且聚集在进化树
的同一分支上, 亲缘关系较近。GmGT-2B蛋白属于
GT-2 型的 trihelix 转录因子, 因此可以将 GhGT30
归为 GT-2型转录因子。
转录因子必须进入细胞核 , 才能起到调控基
因表达的目的。核定位信号存在于转录因子中, 并
介导转录因子由细胞质向细胞核转运的富含精氨酸
和赖氨酸残基的区域。转录因子在细胞质合成后 ,
由核定位信号引导进入细胞核, 然后发挥调控其他
基因表达的作用[41-43]。转录因子可以含有一个或多
个核定位序列 , 核定位信号的氨基酸序列没有专一
性, 且不规则存在, 一般通过软件预测得到, 也存
在预测不出核定位序列的转录因子 , 它们通过其
他途径进入细胞核。目前 , 水稻中的 GT-2、番茄
中的 HSFA1-2、玉米的 O2 和碗豆的 PS-IAA4 等转
录因子中的核定位序列都已被鉴定 [41,43]。蛋白结构
预测显示, GhGT30 基因编码的蛋白序列中有一个
核定位信号序列。通过拟南芥原生质体的亚细胞定
位分析表明, GhGT30是在细胞核内定位的, 即它们
在细胞质中合成后, 进入细胞核发挥调控作用。这
些结果为利用生物信息学手段解析 trihelix 家族功
能提供了有益的借鉴, 也为研究该家族在耐逆过程
中的功能及其调控提供依据。
GhGT30基因在棉花的根、茎、叶、花、胚珠(0
DPA)、纤维(12 DPA)等各种组织中都表达, 但其表
达存在明显差异。在花和纤维中的表达量最高, 在
根中的表达量最低, 几乎检测不到表达量, 其次是
茎中的表达量, 说明 GhGT30 的表达积累具有组织
特异性。这与 Xie等[32]报道的大豆 GmGT2A在茎中
的表达量最高的结果存在明显不同。可见 , 植物
trihelix转录因子家族的不同成员在植物生长发育过
程中存在不同的表达模式, 这预示着不同的 GT 因
子在植物生长发育过程中可能发挥着不同的调控功
能。
基因的表达情况与基因行使的功能密切相关。
第 5期 李 月等: 棉花转录因子 GhGT30基因的克隆及转录功能分析 813


许多研究证明 GT-2 类 trihelix 转录因子作为干旱、
低温及盐害等非生物胁迫下的主要响应因子, 在植
物抗逆能力综合改良中具有重要作用。大豆
GmGT2A 和 GmGT2B 基因受盐、干旱、冷和 ABA
诱导表达, 在转基因拟南芥中, 过量表达 GmGT2A
和 GmGT2B 可以显著提高对盐害, 干旱和冷害的抗
性, 而且GmGT2B在ABA处理下萌发生长能获得更
高的绿苗率[32], 说明 GmGT2B不仅参与植物的逆境
胁迫耐受性过程, 而且也降低了植物对ABA的敏感
性。在转基因水稻中, OsGTγ-1基因过量表达可以显
著提高植株对高盐的抗性[33]。拟南芥 AtGTL1 基因
的超表达提高了植株的抗旱性[27]。拟南芥 AtGT2L
受冷、盐和 ABA诱导表达, 推测该蛋白在抵御非生
物胁迫的抗性中起着重要作用[34]。GhGT30 蛋白属
于 trihelix 转录因子家族中的 GT-2 类, 并且和大豆
GmGT2B 具有很高的同源相似性, 推测 GhGT30 蛋
白可能在植物逆境胁迫过程中起着与其他 GT-2 类
蛋白相类似的作用。本研究表明, 棉花 GhGT30 基
因对高盐、干旱和低温胁迫都有响应, 但是应答模
式不完全相同。在盐和旱处理下, 基因表达总体呈
现先升高后下降的趋势, 到 12 h 均低于处理前, 在
冷胁迫下总体上是下降趋势, 虽在 12 h 有升高, 但
表达水平仍低于未处理前。由此推测, GhGT30基因
的转录水平受到渗透胁迫的调节, 但是在不同的胁
迫因子下, 基因调控的方式和程度不同。
植物激素在植物抵御生物和非生物胁迫中起着
关键性的作用。ABA作为一种具有广泛生理作用的
植物激素, 不仅对种子的成熟、休眠、植物开花时
间、果实成熟等植物发育相关的生理过程起调节作
用, 也可以调节植物对高盐、干旱、低温和病原菌
等逆境胁迫的应答。许多研究表明, 干旱或高盐引
起的胁迫信号转导至少通过 ABA依赖和 ABA不依
赖的两条途径, 而低温胁迫诱导的基因表达大部分
是通过 ABA 不依赖途径[44]。GhGT30 基因对 ABA
处理具有一定程度的响应, 推测 GhGT30 可能通过
依赖 ABA 信号通路参与棉花对非生物胁迫的抗性
反应。关于 GhGT30 基因在棉花逆境胁迫中的表达
调控功能有待进一步研究, 以明确其在植物抗逆境
胁迫下生物防卫反应, 丰富棉花 trihelix家族基因研
究内容, 为研究棉花的耐逆分子机理及耐逆基因工
程提供科学依据, 为利用基因工程的方法改良作物
的耐逆性提供候选基因。
4 结论
克隆了一个 GT基因, 命名为 GhGT30。该基因
表达的蛋白在 N 端和 C 端各有一个 trhelix 结构域,
根据 GT因子的分类方法, GhGT30蛋白应属于 GT-2
类型 trhelix转录因子。在 C端有一个核定位信号序
列 KRCK。该蛋白被定位在细胞核中。GhGT30 表
达量在棉花的花中最高, 根中最低, 并参与 ABA、
干旱、高盐和低温等非生物胁迫的响应。基于
GhGT30 基因响应各种非生物胁迫和在棉花花、纤
维中高表达的事实, 推测该基因在棉花防御反应和
纤维发育过程中起作用。
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814 作 物 学 报 第 39卷

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