全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(11): 2094−2098 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家科技支撑计划项目(2011BAD35B03), 国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2013ZX08002001-004, 011ZX08002-001)
和西北农林科技大学基础科研业务费项目(ZD2012001)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 张增艳, E-mail: zhangzengyan@caas.cn; 马翎健, E-mail: malingjian@nwsuaf.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: liufei3139@126.com, Tel: 15029618691
Received(收稿日期): 2013-03-25; Accepted(接受日期): 2013-06-24; Published online(网络出版日期): 2013-08-12.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130812.1751.020.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.02094
转 TiERF1-RC7双价基因小麦的鉴定及其全蚀病抗性
刘 菲 1 杨丽华 1,2 王爱云 3 刘 欣 2 马小飞 1 杜丽璞 2
李盼松 1 张增艳 2,* 马翎健 1,*
1西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100; 2中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 /
农业部麦类生物学与遗传育种重点实验室, 北京 100081; 3中南林业科技大学生命科学与技术学院, 湖南长沙 410004
摘 要: 为探讨 TiERF1和 RC7基因对小麦抗全蚀病的防御反应, 本研究对转 TiERF1-RC7双价基因小麦进行了分子检
测以及全蚀病抗性的室内和田间鉴定。结果表明, 转入的 TiERF1和 RC7基因在转基因小麦中可以遗传和转录; 与受体
扬麦 18相比, 5个转 TiERF1-RC7小麦株系在整个生育期抗病性显著提高, 苗期的全蚀病严重度在 10%以下, 成熟期的
白穗率在 13%以下, 而扬麦 18的严重度为 62.98%, 白穗率为 26.09%。电子显微镜观察结果表明抗病转基因小麦根表的
全蚀病原菌菌丝数量及生长势明显低于感病材料。上述结果说明, 转入的 TiERF1和 RC7基因抑制了全蚀病原菌的侵染
及在转基因小麦中繁殖, 进而提高了转基因小麦对全蚀病的抗性。
关键词: 全蚀病; Gaeumannomyces graminis var. tritic; 转基因小麦; 扫描电镜
Molecular Detection and Take-all Response Assays of TiERF1-RC7 Transgenic
Wheat
LIU Fei1, YANG Li-Hua1,2, WANG Ai-Yun3, LIU Xin2, MA Xiao-Fei1, DU Li-Pu2, LI Pan-Song1, ZHANG
Zeng-Yan2,*, and MA Ling-Jian1,*
1 College of Agronomg, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2 National Key Facility of Crop Gene Resources and Genetic Improve-
ment / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crops, Ministry of Agriculture / Institute of Crop Science, Chinese Academy
of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3 College of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology,
Changsha 410004, China
Abstract: The aim of this study was to understand the role of TiERF1 and RC7 genes in wheat defense response to take-all. Both
genes were simultaneously transformed into wheat cultivar Yangmai 18. The resistance to talk-all in five transgenic lines were
analyzed by PCR and RT-PCR methods, and evaluated by artificial inoculation in greenhouse and field tests. Scanning electron
microscope technique was used to observe the morphology and number of the pathogen mycelia on the root surfaces of resistant
transgenic and susceptible receptor wheat plants. The PCR assay showed that both TiERF1 and RC7 genes were integrated into the
transgenic lines and inherited to the T3 generation. The RT-PCR assay confirmed expressions of both genes in the transgenic lines.
The results showed that five transgenic lines exhibited stable and efficient resistance to take-all with disease severity lower than
10% at seedling stage in greenhouse and rate of white spike lower than 13% at maturity in field. In the contrast of Yangmai 18, the
severity was 62.98%, rate of white spike was 26.09%. Electron microscope observation revealed that the number and growth ten-
dency of hyphae on roots of the resistant transgenic wheat were significantly lower and weaker than those of the wild type. The
expressions of TiERF1 and RC7 inhibit the growth of pathogen hyphae in the transgenic wheat plants, leading to improved resis-
tance to take-all.
Keywords: Take-all; Gaeumannomyces graminis var. tritici; Transgenic wheat; Scanning electron microscope
小麦全蚀病是由禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomyces graminis var. tritici)引起的一种小麦根部土传病害, 可造
第 11期 刘 菲等: 转 TiERF1-RC7双价基因小麦的鉴定及其全蚀病抗性 2095


成小麦减产 40%~60% [1]。在我国河南、河北、陕西、内
蒙古、山东、宁夏、甘肃等多个麦区均有发生, 目前已成
为河南、山东、陕西、河北等地小麦优质高产的严重威胁。
选育和种植抗病小麦品种是防治全蚀病最有效、最直接的
途径[2], 但迄今, 常规育种中还没有抗全蚀病小麦品种的
相关报道。采用转基因技术培育抗全蚀病小麦新种质成为
拓宽小麦全蚀病抗源的重要途径。
ERF转录因子即乙烯答应因子, 是具有单个ERF/AP2
DNA结合域的调控蛋白。一些ERF转录因子与植物抗病反
应有关,如超量表达拟南芥ERF1的转基因拟南芥植株对坏
死营养型真菌和土传病原菌的抗性显著提高[3]。中间偃麦
草ERF转录因子基因TiERF1受病原菌诱导 , 该基因转入
烟草后提高了植株对烟草赤星病菌和烟草花叶病毒的
抗性 [4]。现已发现TiERF1具有正向调控防御反应的作用,
其过表达可以提高转基因小麦对纹枯病抗性[5]。几丁质酶
可通过水解真菌菌丝生长点初生细胞壁中的几丁质 , 引
起真菌细胞壁变薄, 导致真菌细胞溶解, 从而达到抑菌的
效果。Anuratha等[6]从接种立枯纹枯菌(Rhizoctonia solani)
的水稻中分离出的一个几丁质酶基因RC7, Datta等 [7]将
RC7转入水稻, 发现RC7超量表达显著提高了转基因水稻
对纹枯病的抗性; 刘宝业等[8]通过体外抑菌实验证明RC7
基因表达产物可显著抑制水稻纹枯病菌、小麦纹枯病菌、
小麦赤霉病菌、棉花黄萎菌、烟草赤星菌的菌丝生长。为
了增强转基因小麦的抗病效果 , 我们构建了TiERF1和
RC7双价基因的表达载体pTiERF1-RC7, 并通过基因枪法
将TiERF1-RC7基因转入小麦(张增艳等未发表)。本试验对
转TiERF1-RC7双价基因小麦进行分子检测和全蚀病的抗
性鉴定, 并对其抗性机制进行初步探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
转基因小麦的受体为小麦推广品种扬麦18 (江苏里下
河农业科学研究所程顺和院士提供)。转 TiERF1-RC7扬麦
18的 T2代和 T3代10个株系。小麦全蚀病菌(Gaeum an-
nomyces graminis var. tritici, Ggt)由西北农林科技大学植
保学院提供。
1.2 转基因植株的 PCR检测
采用改良的 CTAB 法[9], 从 T2至 T3代植株叶片中提
取基因组 DNA。
根据转基因载体 pTiERF1-RC7 (图 1)的序列, 设计 2
对特异引物 (RC7-U/TNOS-23L 和 RSS1P-1038U/TIET-
2088L)用于检测 RC7和 TiERF1基因, 预期扩增片段分别
为 260 bp 和 1050 bp。RC7-U (5′-GGCAACCTCGACTG
CTACAA-3′)位于 RC7 读码框 3′端, TNOS-23L (5′-TGTA
TAATTGCGGGACTCTAAT-3′)位于 Tnos 终止序列上 ;
RSS1P-1038U (5′-CATCCCCAACCAGTCCTTTT-3′)位于
RSS1P 启动子序列上 , TIET-2088L (5′-CTCGGTAGTGC
TTCCCCCT-3′)位于 TiERF1序列上[10]。

图 1 pTiERF1-RC7双价基因的植物表达载体框架图
Fig. 1 Scheme of pTiERF1-RC7 expression vector
箭头指示区为用特异引物 PCR检测转基因的片段。
The arrows indicate the regions amplified by PCR assays.

1.3 转基因植株的 RT-PCR分析
利用 TRIZOL 试剂(Invitrogen)提取 PCR 阳性植株和
未转基因扬麦18的叶片总 RNA, 纯化后采用 RNA kit
ver.3.0 cDNA 合成试剂盒(TaKaRa)合成第1条链 cDNA。
以小麦 cDNA 为模板, 利用小麦 actin 基因(ActA: 5′-CA
CTGGAATGGTCAAGGCTG-3′, ActB: 5′-CTCCATGTC
ATCCCAGTTG-3′)进行模板均一化; 然后用 TiERF1特异
引物(TIE1-317U: 5′-CGTCGTGCTTCGGTTTCCT-3′, TIE1-
743L: 5′-TCGCCTCTCTTCCTTCTTTT-3′)和 RC7特异引物
(RC7Q-649U: 5′-ATCGGGGTGGACCTGCTGA-3′, RC7Q-
855L: 5′-GCCGTTGACGATGTTGGTG-3′) 进 行 半 定 量
RT-PCR 分析。
1.4 转基因小麦全蚀病抗性鉴定
1.4.1 苗期人工接种鉴定 利用 PDA培养基在 25℃下培
养小麦全蚀病菌 12~15 d, 待菌丝布满培养基后切成直径
1 cm的圆形菌饼, 按照 Penrose[11]菌饼法接种。小麦种子经
1% H2O2消毒 24 h并催芽, 待露白后将其接入菌饼, 置含灭
菌沙的塑料盆中, 并用细沙覆盖, 每 2~3 d 浇水一次, 保持
沙子湿润。每盆接种 5 粒, 在人工气候培养箱中培养 28 d
(18~22℃、12 h 光照), 然后按 0~6 级记录反应型。其中, 0
级为无病 ; 1~6 级分别为黑根面积占总根面积的<5%、
5%~10%、11%~25%、26%~40%、41%~65%和 66%~100%。
1.4.2 田间成株抗病鉴定 选出苗期花盆鉴定出的抗
性好的转 TiERF1-RC7基因小麦10个株系 T3代植株及其受
体对照 , 单株播种 , 每株系30个单株进行全蚀病病圃鉴
定。参照高小宁等[12]的方法制备接种体, 将谷粒与水按照
1.0∶1.5的比例置1000 mL锥形瓶中, 连续3 d高压灭菌1
h, 待冷却后在无菌操作室中接种小麦全蚀病菌。接种后,
室内放置培养4周晾干备用。
在西北农林科技大学全蚀病专用病圃(陕西杨凌)进
行田间鉴定。每小区 10行, 行长 1.5 m, 播种深度 15 cm;
每行均匀播撒 6 g上述接种体, 小麦种子每行 30粒, 间隔
2096 作 物 学 报 第 39卷


5 cm; 同时设受体感病对照(未转基因扬麦 18), 小麦生长
期的管理与大田一致。以苗期死苗率及成株期的死亡率和
白穗率反映其抗病性。
1.5 小麦全蚀病菌的电镜观察
选择室内鉴定抗性好的转基因小麦材料和感病对照
各 8 粒, 经消毒、催芽后, 按苗期室内鉴定方法接种小麦
全蚀病菌, 分别在接种后的 48、60和 120 h切取穿过菌饼
的幼根 7~8 段, 每段长约 7 mm; 用 4%戊二醛固定 24 h,
再经 CO2干燥和喷金处理, 于 SEM6360LV扫描电镜下观
察菌丝及小麦细胞生长情况。
2 结果与分析
2.1 转基因小麦的 PCR检测和外源基因转录分析
在 T2和 T3代植株中, 特异引物 PCR 检测出 10 个转
TiERF1-RC7 双价基因小麦株系, 这些转基因株系均呈现
260 bp (RC7)和 1050 bp (TiERF1 基因)的预期扩增片段,
而未转基因的受体扬麦 18 无此扩增条带(图 2-A, B)。抗
病 T3代植株中目标基因的阳性检出率是 100%, 说明这 10
个 T3 代株系中外源转 TiERF1-RC7 基因已基本纯合。
选择 5 个全生育期抗病的转基因株系 T3代植株进行
半定量 RT-PCR分析, 结果这些植株中 TiERF1与 RC7 基
因的转录水平均明显高于未转基因扬麦 18 (图 2-C)。
2.2 转基因小麦材料的苗期盆栽全蚀病抗性鉴定
苗期人工接种鉴定结果表明, 转 TiERF1-RC7基因小
麦 T2代10个株系的各项抗病指标均好于受体扬麦18。对
T3代转 TiERF1-RC7基因小麦的10个株系继续鉴定, 其抗
性显著增强, 其反应等级均在1~2级, 根部、茎基部的感病
程度明显减轻 , 且根系长度和根系面积均显著大于受体
扬麦18 (表1)。说明转基因小麦苗期的抗病性显著高于受
体小麦, 并增强了转基因小麦根系的生长势。

图 2 转 TiERF1-RC7基因扬麦 18的 T3代 PCR及 RT-PCR分析
Fig. 2 PCR and RT-PCR assays on T3 plants of TiERF1-RC7 transgenic wheat Yangmai 18
A: RC7特异引物扩增结果; B: TiERF1特异引物扩增结果; C: RT-PCR结果。P: 质粒; WT: 受体扬麦 18; CK: 水对照; 1~10: 转
TiERF1-RC7双价基因小麦株系, 依次是 10ZGY-14、10ZGY-49、10ZGY-75、10ZGY-92、10ZGY-34、10ZGY-113、10ZGY-152、10ZGY-15、
10ZGY-157和 10ZGY-165。
A: amplification of RC7 specific primers; B: amplification of TiERF1RC7 specific primers; C: RT-PCR. P: plasmid; WT: Yangmai 18; CK:
water control; 1–10: transgenic bivalent genes TiERF1-RC7 wheat lines: they are 10ZGY-14, 10ZGY-49, 10ZGY-75, 10ZGY-92, 10ZGY-34,
10ZGY-113, 10ZGY-152, 10ZGY-15, 10ZGY-157, and 10ZGY-165.

表 1 转基因小麦及其对照苗期对全蚀病的抗性评价
Table 1 Resistance evaluation of transgenic wheat to take-all disease at seedling stage
株系
Line
严重度
Severity (%)
黑茎率
Black stem rate (%)
根长
Root length (cm)
总根面积
Total root area (m2)
反应型
Infection type
WT 62.98 a 15.00 a 14.02 k 44.87 i 5
10ZGY-34 6.68 b 0.00 b 22.17 i 75.00 h 2
10ZGY-165 6.67 b 0.00 b 27.59 f 79.12 f 2
10ZGY-157 6.55 c 0.00 b 34.21 a 75.73 g 2
10ZGY-14 5.93 d 0.00 b 28.52 e 91.99 b 2
10ZGY-75 5.60 e 0.00 b 30.79 d 83.94 d 2
10ZGY-49 5.42 f 0.00 b 32.08 b 90.27 c 2
10ZGY-152 4.96 g 0.00 b 22.34 h 83.15 e 1
10ZGY-92 4.76 h 0.00 b 31.70 c 91.99 b 1
10ZGY-113 4.78 h 0.00 b 21.08 j 82.88 e 1
10ZGY-15 4.26 i 0.00 b 26.14 g 112.73 a 1
WT: 未转基因扬麦 18。数据后不同字母表示株系间存在显著差异 (P<0.05)。
WT: untransformed Yangmai 18. Values followed by different letters are significantly different among lines (P < 0.05).

2.3 转基因小麦材料的病圃抗性鉴定
在病圃抗性鉴定中, 受体扬麦 18 苗期死苗率达 30%,
成株期死亡率达 45%, 白穗率达 26.09%; 而 5 个转基因株
系的苗期死苗率为 15%~25%, 成株期死亡率为 20~30%,
白穗率为 0.00~12.5%, 均显著低于受体扬麦 18 (表 2), 说
明在整个生育期中转基因小麦对全蚀病抗性均显著提高。
第 11期 刘 菲等: 转 TiERF1-RC7双价基因小麦的鉴定及其全蚀病抗性 2097


表 2 病圃中转基因小麦材料的全蚀病抗性评价
Table 2 Resistance evaluation on transgenic wheat to wheat
take-all disease at nursery (%)
株系
Line
苗期死苗率
Rate of dead
seedling
成株期死亡率
Mortality rate at
maturity
白穗率
White spike
rate
WT 30.00 a 45.00 a 26.09 a
10ZGY-49 25.00 b 30.00 c 0.00 e
10ZGY-92 20.00 c 30.00 c 5.41 c
10ZGY-113 15.00 d 32.00 b 3.57 d
10ZGY-152 15.00 d 25.00 d 12.50 b
10ZGY-15 15.00 d 20.00 e 12.00 b
WT: 未转基因扬麦 18。数据后不同字母表示株系间存在显
著差异(P<0.05)。
WT: Untransformed Yangmai 18. Values followed by different
letters are significantly different among lines (P < 0.05) .
2.4 小麦全蚀病菌侵染的扫描电镜观察
以感病受体扬麦18为对照, 转基因株系10ZGY-92为
试材, 进行全蚀病菌侵染过程的电镜对比分析。接种全蚀
病病菌48 h, 根表面形成了平行菌丝, 菌丝数量较少, 且
匍匐于根细胞表面, 没有侵入到皮层细胞, 10ZGY-92根细
胞表面上菌丝比感病受体的菌丝细(图2-A, B), 说明抗性
好的材料中菌丝生长更慢。在接种60 h小麦根部细胞表面
布满大量菌丝, 且多缠绕在根毛周围, 说明根毛是菌丝侵
入皮层的重要途径, 同样看到10ZGY-92中的菌丝数量明
显少于感病对照(图3-C, D), 菌丝侵入感病受体的皮层细
胞, 且菌丝形成“∧”形。接种120 h 感病受体的中柱层已
有菌丝出现(图3-E), 说明此时菌丝已经进入中柱 , 这与
刘常宏和商鸿生[13]的研究结果一致, 而10ZGY-92的中柱
中并未发现菌丝(图3-F)。

图 3 小麦全蚀病菌菌丝侵染转基因小麦及受体扬麦 18根表的扫描电镜观察
Fig. 3 Scanning electron microscope observation of invasion on the root surfaces of the transgenic and Yangmai 18 plants by take-all
pathogen
A和 B: 接种 48 h转基因小麦 10ZGY-92和扬麦 18根表面有少量菌丝(48 h); C和 D: 接种 60 h菌丝在 10ZGY-92和扬麦 18的根毛上
缠绕, 与受体小麦扬麦 18 (D)相比, 抗病转基因小麦 10ZGY-92细胞表面的 Ggt菌丝数量少且菌丝细(C); E: 接种 120 h菌丝未进入转
基因小麦 10ZGY-92的中柱; F: 接种 120 h后菌丝穿过扬麦 18的中柱。
A and B: a small amount of hyphae was on the root surfaces of transgenic wheat 10ZGY-92 and Yangmai 18 at inoculation for 48 h; C and D:
mycelium winded root hairs in transgenic wheat 10ZGY-92 and Yangmai 18 at inoculation for 60 h; Ggt was less and thinner in resistant
transgenic wheat 10ZGY-92 than in Yangmai 18; E: no mycelium invaded columns in transgenic wheat 10ZGY-92 at inoculation for120 h;
F: mycelium invaded column layer in Yangmai 18 at inoculation for 120 h.
2098 作 物 学 报 第 39卷


3 讨论
小麦全蚀病菌是由根到茎依次侵染的, 侵染后根系
的发育情况也可以说明不同小麦材料对全蚀病的耐病性。
因此, 本研究依据温室接种后小麦材料的黑根面积、总根
面积、严重度(黑根面积与总根面积的比值)[14]、黑茎面积、
黑茎率等指标鉴定苗期的抗病性, 并结合病圃评价小麦
苗期、成株期抗性, 同时对导入转 TiERF1-RC7 基因小麦
进行分子检测及利用扫描电镜观察病原菌丝情况, 进一
步探讨了转 TiERF1-RC7基因小麦抗全蚀病机制。
本研究表明, 转入的 TiERF1和 RC7基因在10个转基
因小麦株系中可以遗传, 并显著提高了转基因小麦株系
苗期对全蚀病的抗性; 这10个转 TiERF1和 RC7基因小麦
株系的苗期反应型均在2级以下, 而受体扬麦18的反应型
等级为 5级 ; 在病圃抗 性鉴定中 , 其中 5个 株 系
(10ZGY-15、10ZGY-49、10ZGY-92、10ZGY-113和10ZGY-
152)的苗期死苗率、成株期死亡率和白穗率均显著低于受
体扬麦18对照。对这5个株系抗病植株中 TiERF1与 RC7
基因的 RT-PCR 分析表明, 这些转基因植株中 TiERF1与
RC7基因的转录水平明显高于未转基因小麦扬麦18。扫描
电镜(SEM)表明, 全蚀病菌的侵入部位大多集中在根毛区,
少数从茎侵入, 这与王裕中等[15]及郝祥之等[16]的报道结
果相同; 抗病转基因小麦根表附着的全蚀病菌丝明显少
于感病小麦的, 且在同一时期抗病转基因小麦根表的菌
丝更细。上述结果说明, 转 TiERF1-RC7基因的转录表达
抑制了全蚀病菌侵入与发育, 从而提高了转基因小麦对
全蚀病的抗性。

致谢: 衷心感谢中国农业科学院作物科学研究所徐惠君研
究员、庄洪涛、李钊和祝秀亮等研究生在载体构建、转基
因小麦材料创制与早代(T0 和 T1)分子检测工作中的贡献。
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