全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(5): 675683 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31560534)和新疆维吾尔自治区研究生科研创新项目(XJGRI2015084)资助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31560534) and the Science and Technology Innovation Pro-
jects for Graduate Students in Xinjiang Uygur Autonomous Region (XJGRI2015084).
 通讯作者(Corresponding authors): 刘晓东, E-mail: xiaodongliu75@aliyun.com; 张巨松, E-mail: xjndzjs@163.com
第一作者联系方式: E-mail: 15299175640@163.com
Received(收稿日期): 2015-10-25; Accepted(接受日期): 2016-01-11; Published online(网络出版日期): 2016-02-18.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160218.1503.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00675
棉花不同 GbU6启动子截短克隆及功能鉴定
雷建峰 1 李 月 1 徐新霞 2 阿尔祖古丽·塔什 1 蒲 艳 1 张巨松 1
刘晓东 1,*
1 新疆农业大学农学院 / 新疆农业大学农业生物技术重点实验室, 新疆乌鲁木齐 830052; 2 新疆巴州农业技术推广中心, 新疆库尔勒
841000
摘 要: U6启动子是 CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动 sgRNA转录的重要元件, 而使用较短序列的启动子也
是构建 CRISPR/Cas9基因组编辑载体的基本要求之一。将已经克隆的海岛棉 GbU6-5P启动子(长度为 1166 bp), 采用
Transfer PCR方法成功地截出 6个长度不同的 U6启动子, 其长度分别为 672、468、358、280、202和 105 bp, 并分
别构建了 6个启动子驱动的 GUS融合植物表达载体。将构建好的 6个 GbU6-5Ps::GUS-pCAMBIA1300与初始克隆的
GbU6-5P::GUS-pCAMBIA1300 植物表达载体一起利用农杆菌真空渗透转化法分别转染棉花花粉。GUS 组织化学染
色显示, 克隆到的 7个不同截短大小的 GbU6-5P启动子均能驱动 GUS基因在棉花花粉中转录, 棉花花粉被染成蓝色
但颜色深浅存在显著差异。结果显示启动子长度越短, 其转录活性越高。而且另外两种棉花 U6 启动子 GbU6-1P 和
GbU6-7P 也表现出类似的结果。本研究克隆了 3 个短小的、在棉花花粉细胞中具有转录功能的 GbU6 启动子。结果
显示更短的 U6 启动子具有更高的转录活性, 而且这一特点在不同 U6 启动子上具有共性。这预示着使用更短 U6 启
动子不仅符合构建 CRISPR/Cas9基因组编辑载体的要求, 而且会提高 sgRNA的转录水平, 进而可能提高基因组编辑
效率。
关键词: 棉花; GbU6启动子; 截短克隆; 真空渗透; 棉花花粉
Cloning and Functional Analysis of Different Truncated GbU6 Promoters in
Cotton
LEI Jian-Feng1, LI Yue1, XU Xin-Xia2, AERZUGULI·Tashi1, PU Yan1, ZHANG Ju-Song1, and LIU
Xiao-Dong1,*
College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Laboratory of Agricultural Biotechnology of Xinjiang Agricultural University, Urumqi
830052, China; Center of Bazhou Agricultural Technology Promotion, Korla 841000, China
Abstract: U6 promoter is an important element for the transcription of sgRNA in the CRISPR/Cas9 genome editing system.
Using a short promoter is also one of the basic requirements for the construction of CRISPR/Cas9 genome editing vector.
According to the sequence of GbU6-5P promoter cloned, six different truncated U6 promoters were successfully cloned using
Transfer PCR method and their length were 672, 468, 358, 280, 202, and 105 bp, respectively. Together with GbU6-5P::GUS-
pCAMBIA1300, GUS fusion expression vectors driven by corresponding truncated promoter were constructed and transformed
into cotton pollen by the vacuum in filtration transformation method. Results of GUS histochemical staining showed that the
cloned seven truncated GbU6-5P promoters could drive GUS expression in cotton pollen and all corresponding cotton pollen
could be stained blue, but there exist different shades among them. Results showed that the shorter promoter, the stronger tran-
scription activity, and so did the two other GbU6 promoter. In this study three short GbU6 promoters with transcription activity in
cotton pollen were cloned. GUS staining results showed that the shorter U6 promoter had higher transcriptional activity, which
was the common characteristics in different U6 promoter. The above results indicated that using shorter U6 promoter not only
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conform to the requirement of constructing CRISPR/Cas9 genome editing vector, but also improve the transcription of sgRNA,
which may enhance the efficiency of genome editing finally.
Keywords: Cotton; GbU6 promoter; Truncated cloning; Vacuum infiltration; Cotton pollen
基因组编辑技术是一种研究基因功能的重要工
具, 它能精确改变受体细胞染色体特定位点的基因
序列 , 可以高效产生特定基因的功能失活突变体 ,
能为生物功能基因组研究提供优质的遗传材料。所
以该技术自诞生以来 , 就受到广大生物学家的青
睐。ΙΙ 型 CRISPR/Cas9 基因组编辑系统是继锌指核
酸酶(ZFN)和 TALE 核酸酶(TALEN)之后, 另一种可
以对基因组高效定点修饰的新技术[1-3]。sgRNA 和
Cas9是该技术系统的 2个必要成员, 其中 sgRNA是
由 crRNA和 tracerRNA(trans-activating crRNA)融合
而成 , 具有靶向结合目的基因位点的功能。在
CRISPR/Cas9技术系统中, sgRNA的转录通常由 U6
启动子或者 U3 启动子完成, 二者转录活性相对较
高, 且都有明确的转录起始位点: 前者以 G 碱基开
头, 后者以 A 碱基开头。精确起始转录具有靶向功
能的 sgRNA 能消除无关 DNA 序列的转录, 从而大
大减少脱靶效应的产生[4-6]。
多项研究结果表明 U6 启动子是驱动带有靶向
位点 sgRNA转录的理想启动子。Hyun等[7]构建了由
AtU6 启动子驱动 sgRNA 转录, 靶向修饰拟南芥 FT
基因和 SPBPlike-4基因的 CRISPR/Cas9基因组编辑
系统 , 并在 T1 代转化子中检测到靶位点突变。
Thomas等[8]克隆了大豆 U6启动子, 并成功修饰了 9
个大豆内源基因。Jiang 等[9]克隆了水稻 U6 启动子驱
动 sgRNA 的转录 , 并在水稻原生质体中敲除了
OsSWEET14和 OsSWEET11基因。U6启动子虽然具有
高效转录的特点, 但是它在同源关系较远的不同物种
之间不一定适用[10], 而且同一物种基因组中存在多个
U6启动子, 这些启动子的转录效率也不相同[6,11]。
棉花是我国重要的经济作物和纺织工业原料。
目前用于棉花 CRISPR/Cas9 基因组编辑系统的 U6
启动子还未见报道。预测棉花基因组中至少有 10种
U6 启动子。本课题组在前期工作中已克隆了 5 种
U6启动子, 并利用基因枪瞬时转化棉花花粉的方法
从中筛选出一个转录效率相对较高的 GbU6-5P启动
子 (长度为 1166 bp)[12], 但已有研究表明 , 用于
CRISPR/Cas9 基因组编辑技术的 U6 启动子通常只
有 200~400 bp 长[13-14], 甚至短于 100 bp[15]。由于
Cas9基因巨大(大于 4000 bp), 而且驱动Cas9基因表
达的 35S启动子长度也在 1000 bp左右[14-15], 这 2个
片段上分布着绝大多数常用的限制性内切酶位点。
因此在构建 sgRNA 和 Cas9 共表达载体时, 可用于
sgRNA重组片段连接的酶切位点非常少。所以这就
要求U6启动子上不能再出现这些酶切位点, 而只有
更短的片段才有可能满足这个要求。因此克隆的 U6
启动子片段越短越便于 CRISPR/Cas9载体的构建。
本研究以前期获得的 5种棉花U6启动子为模板,
克隆不同截短大小的 GbU6 启动子并构建相应的
GUS融合表达载体。采用农杆菌真空渗透法[16-17]转
化棉花花粉, 并验证它们的转录活性, 以克隆出较
短的而且具有高效转录活性的棉花 U6启动子。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验所用 AtU6-26P::sgRNA[18]、pBI101载体、
农杆菌 GV3101、棉花品种新海 16 均为新疆农业大
学农业生物技术重点实验室保存。各种限制性内切
酶购于 Fermentas公司; T4 DNA连接酶、Blunt Zero
平端载体、Trans1-T1感受态细胞、琼脂糖凝胶回收
试剂盒、Taq DNA聚合酶、RNase A、KD Plus DNA
聚合酶、1 kb Plus DNA Ladder均购自于北京全式金
生物技术有限公司; Phusion 超保真 DNA 聚合酶购
自于纽英伦生物技术(北京)有限公司; 其他常规试
剂均为国产分析纯; 引物合成及测序均由上海杰李
生物技术有限公司完成。
1.2 GbU6-5P不同截短大小启动子的克隆
根据前期已克隆的 GbU6-5P 启动子序列和
AtU6-26P::sgRNA 载体序列设计了 6 对截短 GbU6-
5P 启动子的 Transfer PCR 引物(表 1)。本课题组于
2014年已完成对 GbU6-5P (1787 bp)的第一轮克隆。
第二轮是精确克隆不同截短的 GbU6-5P 启动子, 以
第一轮 PCR克隆的GbU6-5P启动子质粒为供体质粒
模板, 以拟南芥 AtU6-26P::sgRNA 的质粒为受体质
粒模板进行由两轮 PCR组成的 Transfer PCR[19], 对
GbU6-5P 启动子进行不同长度的截短。对电泳检测
正确的 Transfer PCR产物进行 Dpn I (4 U)酶切处理,
37℃酶切 3 h 以上, 取 10 µL 消化产物转化大肠杆
菌。对获得的不同截短的 GbU6-5P质粒采用 BamH I
和 Hind III 酶切鉴定及测序验证, 将正确的克隆命
名为 T-GbU6-5Ps。
第 5期 雷建峰等: 棉花不同 GbU6启动子截短克隆及功能鉴定 677



表 1 本研究中使用的引物序列
Table 1 Primer sequences used in this study
引物名称
Primer name
上游引物序列
Forward sequence (5–3)
下游引物序列
Reverse sequence (5–3)
T-GbU6-5P2
CCGCCAGTGTGCTGGAATTGCCCT
TAACAGACTATCAACAAGCCAAGC
CTAGCTCTAAAACAGGTCTTCTCGAA
GACCCACTTATTTGACGCTTCTTTCGC
T-GbU6-5P3
CCGCCAGTGTGCTGGAATTGCCCTTA
AGAATGCTGTTGAATTCCCATC
CTAGCTCTAAAACAGGTCTTCTCGAAG
ACCCACTTATTTGACGCTTCTTTCGC
T-GbU6-5P4
CCGCCAGTGTGCTGGAATTGCCCTTAAC
TAATATACATTGGTTCCAAGG
CTAGCTCTAAAACAGGTCTTCTCGAAGA
CCCACTTATTTGACGCTTCTTTCGC
T-GbU6-5P5
CCGCCAGTGTGCTGGAATTGCCCTTAAA
CCCGATTGTAATGTGAAGTC
CTAGCTCTAAAACAGGTCTTCTCGAAGA
CCCACTTATTTGACGCTTCTTTCGC
T-GbU6-5P6
CCGCCAGTGTGCTGGAATTGCCCTTAAGGA
TAAGTGATAAACACTGAGC
CTAGCTCTAAAACAGGTCTTCTCGAAGACCC
ACTTATTTGACGCTTCTTTCGC
T-GbU6-5P7
CCGCCAGTGTGCTGGAATTGCCCTTAA
AGGACGTGGTAGCATACTTC
CTAGCTCTAAAACAGGTCTTCTCGAAGACCC
ACTTATTTGACGCTTCTTTCGC
GUS TAAGTGGGTCTTCATGTTACGTCCTGTAGAAAC TAAACAGGTCTTCGAATTCCCGATCTAGTAACA
T-GbU6-1P4
CCGCCAGTGTGCTGGAATTGCCCTTAAGCC
AAAATTATAATGACTCGAAC
GGGTTTCTACAGGACGTAACATGAAGACCC
GATAATAAGTTTCTTCCTTTGCC
T-GbU6-1P5
CCGCCAGTGTGCTGGAATTGCCCTTAATTTTCC
CATTGAAGGGACAAC
GGGTTTCTACAGGACGTAACATGAAGACCCGAT
AATAAGTTTCTTCCTTTGCC
T-GbU6-3P4
CCGCCAGTGTGCTGGAATTGCCCTTAATTTTCC
CATTGAAGGGACAAC
GGGTTTCTACAGGACGTAACATGAAGACCCAGC
CAAGTGATCCTTCTTTTAC
T-GbU6-3P5
CCGCCAGTGTGCTGGAATTGCCCTTAACCTGTC
AGATAGACGCCATT
GGGTTTCTACAGGACGTAACATGAAGACCC
AGCCAAGTGATCCTTCTTTTAC
T-GbU6-7P4
CCGCCAGTGTGCTGGAATTGCCCTTAACTTAA
CGAGAGTTGAGTTGGT
GGGTTTCTACAGGACGTAACATGAAGACCC
ATTACCTGCTAGCTGCTTCTT
T-GbU6-7P5
CCGCCAGTGTGCTGGAATTGCCCTTAATCCC
ACTCTACAGCCATAAG
GGGTTTCTACAGGACGTAACATGAAGACCC
ATTACCTGCTAGCTGCTTCTT
T-GbU6-9P4
CCGCCAGTGTGCTGGAATTGCCCTTAAAGT
AAAAGGTTGTTCCCAACC
GGGTTTCTACAGGACGTAACATGAAGACCC
AGCCTAAGCTGGCTGCTGT
T-GbU6-9P5
CCGCCAGTGTGCTGGAATTGCCCTTAA
GTTGAGGGAGTTGTGACAC
GGGTTTCTACAGGACGTAACATGAAGA
CCCAGCCTAAGCTGGCTGCTGT
下画线部分为受体质粒部分碱基序列。
Underlined sequences are the part of receptor plasmid partial nucleotide sequence.

1.3 不同截短 GbU6-5P::GUS 融合的植物表达
载体的构建
将已克隆的GUS基因和 T-GbU6-5Ps质粒用 Bbs
I 酶切, 回收目标片段, 连接, 转化, 然后进行菌落
PCR 和酶切鉴定 , 酶切正确的质粒命名为 GbU6-
5Ps::GUS。分别用 Hind III和 BamH I酶切植物表达
载体 pCAMBIA1300 和 6 个构建好的 GbU6-5Ps::
GUS 的融合表达载体, 回收目标片段, 连接, 转化,
对重组质粒进行酶切鉴定, 酶切正确的质粒被命名
为 GbU6-5Ps::GUS-P1300。不同截短的 GbU6-5Ps
启动子对应的 GbU6-5Ps::GUS融合表达载体示意图
见图 1。将鉴定正确的表达载体转入农杆菌 GV3101,
用于下一步侵染。
1.4 农杆菌真空渗透转化棉花花粉
将构建好的不同 GbU6-5Ps::GUS-P1300 以及阳
性对照 CaMV35S::GUS 和阴性对照 pCAMBIA1300
空载体的农杆菌按 1∶100比例接种于 LB培养基(含
50 µg mL–1 Kan和 25 µg mL–1 Rif)中活化。28℃, 180
转 min–1摇菌, 摇至菌液的 OD600 = 0.6~1.2时, 分别
吸取不同体积的活化菌液接种到 6 mL LB培养基(含
50 µg mL–1 Kan和 25 µg mL–1 Rif)中, 使得每种农杆
菌起始菌液 OD值相同, 再次 28℃, 180转 min–1摇
菌, 统一摇至菌液的 OD600 = 1.6时, 12 000×g离心 5
min 收集菌体, 弃上清液, 重悬于花粉萌发培养基[17]
中[0.1% H3BO3、0.3% Ca(NO3)2、0.2% MgSO4·7H2O、
0.1% KNO3、45%蔗糖], 收集新鲜棉花花粉, 等量分
678 作 物 学 报 第 42卷



图 1 不同截短 GbU6-5P启动子驱动报告基因 GUS的融合表达载体构建
Fig. 1 Construction of GUS reporter gene fusion expression vector driven by different truncated GbU6-5P promoters

成多份。每份各加入上述不同的农杆菌重悬液, 并
在–0.05 MPa压力下抽真空 30 min。每种农杆菌转化
进行技术重复 3次, 生物学重复 2次。
1.5 不同截短 GbU6-5Ps::GUS 在棉花花粉中的
瞬时表达分析
将抽完真空后的棉花花粉悬浮液 100×g 离心 1
min, 弃上清液, 收集转化后的花粉, 并用蒸馏水漂
洗 4~5次, 每次 100×g离心 1 min, 弃上清液, 以去
除农杆菌。然后加入适量的 GUS 染液(0.5 mol L–1
磷酸缓冲液, pH 7.0; 0.5 mol L–1 EDTA, pH 8.0; 10%
Triton X-100; 20 mmol L–1 X-Gluc), 37℃, 180 转
min–1振荡染色 3~4 h, 100×g离心 1 min, 吸取上清
GUS 染液保留备用。用蒸馏水漂洗染色后的花粉
4~5次, 每次 100×g离心 1 min, 以确保去除残留的
GUS染液。最后收集花粉在体视显微镜下观察拍照。
同时取每种花粉 GUS 染液的蓝色上清液在 620 nm
波长(蓝色上清液的最大吸收波长)处测定光吸收值。
1.6 农杆菌真空渗透与非真空渗透转化效率的
比较
根据上一试验结果选取2个转录效率相对较高
的截短启动子 GbU6-5P6和 GbU6-5P7进行真空渗透
与非真空渗透转化处理, 分别统计在真空渗透和非
真空渗透条件下棉花花粉的转化效率 , 转化效率
(%) = (被染成蓝色花粉的个数/花粉的总个数)×100,
每个处理重复3次 , 以探究农杆菌介导转化棉花花
粉的试验中, 在转化效率上, 真空渗透与非真空渗
透是否存在显著差异。
1.7 其他 4 种海岛棉 U6 启动子以及相应截短启
动子的克隆与转录活性分析
采用两轮 PCR 方法, 在海岛棉中分别克隆其他
4 种 U6 启动子, 分别命名为 GbU6-1P、GbU6-3P、
GbU6-7P、GbU6-9P。然后采用 Transfer PCR方法对
这 4种 U6启动子进行 2种长度的截短克隆(表 1)。
以截短的 GbU6-5P2::GUS 为受体质粒模板, 分别截
短 GbU6-1P、GbU6-3P、GbU6-7P、GbU6-9P 启动
子。同时完成 U6 启动子与 GUS 基因融合载体的构
建 , 克 隆 测 序 正 确 后 再 连 入 植 物 表 达 载 体
pCAMBIA1300中并酶切鉴定。分别命名正确的质粒
为 GbU6-1P4::GUS、GbU6-1P5::GUS、GbU6-3P4::
GUS、GbU6-3P5::GUS、GbU6-7P4::GUS、GbU6-7P5::
GUS、GbU6-9P4::GUS、GbU6-9P5::GUS。最后转化
农杆菌 GV3101。同样采用上述农杆菌真空渗透法转
化棉花花粉, 分析启动子转录活性。
2 结果与分析
2.1 不同截短 GbU6-5P启动子扩增产物鉴定
以测序正确的 GbU6-5P 启动子克隆质粒为模板,
进行 Transfer PCR, 成功克隆了 6个不同截短的
GbU6-5P 启动子片段(图2), 截取的启动子大小分别
为 GbU6-5P2: 672 bp、GbU6-5P3: 468 bp、GbU6-5P4:
358 bp、GbU6-5P5: 280 bp、GbU6-5P6: 202 bp、
GbU6-5P7: 105 bp。以上截短的启动子质粒经 BamH I
和 Hind III酶切鉴定与预期目标片段大小相符(图略),
经测序比对为预期的截短 GbU6-5P启动子。
第 5期 雷建峰等: 棉花不同 GbU6启动子截短克隆及功能鉴定 679



图 2 6个不同截短 GbU6-5P启动子的 Transfer PCR扩增产物
电泳检测
Fig. 2 Transfer PCR amplification of six truncated GbU6-5P
promoters
M: 1kb DNA marker; 1:T-GbU6-5P2, 2: T-GbU6-5P3, 3:
T-GbU6-5P4, 4: T-GbU6-5P5, 5: T-GbU6-5P6, 6:T-GbU6-5P7.

2.2 不同截短 GbU6-5P::GUS 融合表达载体的
构建
将 6个截短的 GbU6-5Ps启动子与 GUS基因片
段连接, 对重组的质粒进行酶切鉴定: 用 EcoR I 单
酶 GbU6-5P2::GUS 重组质粒切, 产生了 3272 bp和
2608 bp两条带; 用 EcoR V分别单酶切 GbU6-5P3::
GUS、GbU6-5P4::GUS、GbU6-5P5::GUS重组质粒,
结果为 GbU6-5P3::GUS产生 4096、1495 和 231 bp
条带, GbU6-5P4::GUS产生 3986、1495和 231 bp条
带, GbU6-5P5::GUS产生 3908、1495和 231 bp条带;
GbU6-5P6::GUS、GbU6-5P7::GUS 重组质粒分别用
Pst I和 Mfe I双酶切, 结果是 GbU6-5P6::GUS产生
3404 bp和 2149 bp条带, GbU6-5P7::GUS产生 3307
bp和 2149 bp条带(图 3), 所有酶切结果与预期相符。
将 6 个构建好的 GbU6-5P::GUS 的重组基因片段连
入植物表达载体 pCAMBIA1300, 经酶切鉴定, 酶切
结果与预期酶切片段大小相符 , 表明不同截短的
GbU6-5P 驱动 GUS 基因的植物表达载体 GbU6-5P::
GUS-P1300构建成功(图略)。

图 3 GbU6-5Ps::GUS表达载体的酶切鉴定
Fig. 3 Identification of different truncated GbU6-5Ps::GUS expression vectors by restriction enzyme digestion
M: 1 kb DNA marker: A: GbU6-5P2::GUS; B: GbU6-5P3::GUS; C: GbU6-5P4::GUS; D: GbU6-5P5::GUS; E: GbU6-5P6::GUS;
F: GbU6-5P7::GUS.

2.3 不同截短 GbU6-5P启动子功能分析
通过 GUS组织化学染色发现, GbU6-5P启动子
以及 6 个截短的 GbU6-5P 启动子均能驱动 GUS 表
达, 棉花花粉被染成蓝色, 但其染色水平存在明显
差异。GbU6-5P6::GUS和 GbU6-5P7::GUS染色相对
较深 , 接近于阳性对照 , 而其他长度启动子驱动
GUS 基因的转化花粉染色相对较弱。其中一个明显
的趋势是启动子长度越短, 花粉染色越深(图 4)。
2.4 GUS活性测定
为了进一步量化不同截短 GbU6-5P启动子的转
录活性, 取每种处理转化后的 GUS 染液上清液, 在
其最大光吸收波长 620 nm 处测定其光吸收值, 以
pCAMBIA1300 的 GUS 染液为对照。3 次重复结果
表明, CaMV35S启动子的GUS染色液光吸收值最大,
其次是 GbU6-5P7 和 GbU6-5P6, 其他截短启动子随
着长度的增加, 其光吸收值也依次降低(图 5), 这与
棉花花粉本身染色的结果相吻合。
2.5 真空渗透与非真空渗透转化效率比较
为了探究农杆菌抽真空和不抽真空转化棉花花
粉的转化效率是否存在差异, 选用转录活性相对较
高的 GbU6-5P6和 GbU6-5P7试验。结果表明, 抽真
空和不抽真空处理存在显著差异(图 6)。GbU6-5P6
真空渗透转化效率为 23.7%, 非真空转化效率为
12.1%, 真空渗透转化效率比非真空转化效率提高
了 95.9%; GbU6-5P7真空渗透转化效率为 25.1%, 非
真空转化效率为 14.5%, 真空渗透转化效率比非真
空转化效率提高了 73.1%。
2.6 其他 4 种海岛棉 U6 启动子的相应截短启动
子的转录活性分析
其他 4种海岛棉U6启动子的相应截短片段被分
680 作 物 学 报 第 42卷



图 4 不同截短 GbU6-5P启动子驱动 GUS在棉花花粉中的瞬时表达
Fig. 4 GUS expression driven by different truncated GbU6-5P promoters in cotton pollen

图 5 不同截短 GbU6-5P启动子对应的花粉 GUS染色后染液光吸收值
Fig. 5 Light absorbance value at 620 nm of staining solution after histochemical stain corresponding to different truncated GbU6-5P
promoters
不同小写字母表示处理间在 0.05的水平上差异显著。
Different letters indicate significant difference among different treatments at the 0.05 probability level.

别命名为 GbU6-1P4 (440 bp), GbU6-1P5 (192 bp);
GbU6-3P4 (460 bp), GbU6-3P5 (211 bp); GbU6-7P4
(415 bp), GbU6-7P5 (190 bp); GbU6-9P4 (470 bp),
GbU6-9P5 (200 bp), GUS融合表达载体酶切鉴定结
果图略。通过农杆菌真空渗透转化棉花花粉 , 经
GUS 组织化学染色发现, 对于 GbU6-1P4::GUS、
GbU6-1P5::GUS、GbU6-7P5::GUS 可以检测到蓝色
花粉, 而其他克隆的不同截短的 GbU6 启动子并没
有检测到蓝色花粉 (图略 )。结果还显示较短的
GbU6-1P5::GUS、GbU6-7P5::GUS 比对应长片段的
GbU6-1P4::GUS、GbU6-7P4::GUS染色显著增强(图
7)。在 620 nm处光吸收值的结果也显示, GbU6-1P5
显著高于 GbU6-1P4; 在 GbU6-7P4几乎没有光吸收
值的情况下, GbU6-7P5的光吸收值却很高(图 8)。
3 讨论
ΙΙ型CRISPR/Cas9基因组编辑系统自2013年诞生
以来, 已在水稻[9,20-22]、小麦[20,23]、玉米[24]、番茄[25]、
大豆[8]等作物中成功应用。U6启动子作为利用CRISPR/
Cas9基因编辑技术进行棉花分子育种的重要组成部
分, 需要它能在生殖细胞中具有高效转录活性, 产
生可遗传的新种质。研究表明, 在真核生物中, USE
第 5期 雷建峰等: 棉花不同 GbU6启动子截短克隆及功能鉴定 681




图 6 真空与非真空处理转化效率比较
Fig. 6 Comparison of transformation efficiency between
vacuum and non-vacuum treatments
不同小写字母表示处理间在 0.05的水平上差异显著。
Different letters indicate significant difference among different
treatments at the 0.05 probability level.

图 7 其他截短 GbU6启动子花粉 GUS染色
Fig. 7 GUS staining analysis of other truncated GbU6
promoter in cotton pollen

图 8 其他截短 GbU6启动子 GUS染液光吸收值
Fig. 8 Light absorbance value of GUS staining solution for
other truncated GbU6 promoter
不同小写字母表示处理间在 0.05的水平上差异显著。
Different letters indicate significant difference among different
treatments at the 0.05 probability level.
和 TATA框是 U6启动子发挥转录功能的 2个重要元
件[6,26]。本课题组在前期的工作中已克隆了 5种棉花
GbU6启动子, 这 5种 GbU6启动子同样含有比较保
守的–60 bp位置的 USE元件和–30 bp位置的 TATA
框, 利用基因枪瞬时转化的方法从克隆的 5种 GbU6
启动子中筛选出一个转录效率相对较高的 GbU6-5P
启动子(1166 bp)。然而由于构建 CRISPR/Cas9基因
组编辑载体的需要, 所用的 U6 启动子在保证具有
高转录活性的基础上, 通常不宜过长。因此有必要
克隆有效截短的棉花 U6 启动子。首先将 GbU6-5P
启动子截成 6 种长短不等的片段, 但都包含完整的
USE 和 TATA 框元件。转录活性分析结果显示, 随
着启动子长度的不断截短, 启动子的转录活性却逐
渐增强(图 4和图 5)。在另外 2种棉花 U6启动子中
的分析结果表明, 短片段的 U6 启动子的转录活性
也显著高于长片段的 U6启动子(图 7)。不仅如此, 本
实验室在番茄 U6 启动子克隆与功能分析中也发现
了同样的现象(未发表)。以上结果暗示较长的 U6启
动子上可能含有抑制转录活性的调控元件, 而且这
种负调控机制可能在不同物种中非常保守。然而到
目前为止, 除 USE元件和 TATA框外, 在 U6启动子
上还没有鉴定出其他调控转录的序列元件, 因此有
必要对这一现象进一步深入研究。Nekrasov 等[15]在
基因组编辑技术研究中使用了 79 bp长度的 U6启动
子, 并且取得了理想的实验结果。本研究截短克隆
的GbU6-5P7功能启动子长度仅为 105 bp, 这也暗示
植物中 U6启动子可以克隆的更短。是否可以仅保留
U6启动子–60 bp位置的 USE元件和–30 bp位置的
TATA 框就能达到理想的转录活性还需要进一步研
究。另外结果显示 GbU6-3P 和 GbU6-9P 即使启动
子被截短后也依然没有表现出转录活性, 原因一方
面可能是 GbU6-3P 和 GbU6-9P 完全没有功能, 另
一种可能是其 U6 启动子的功能具有组织特异性,
它们在棉花花粉中没有转录活性, 而在其他组织可
能具有功能, 这些问题也需要在后续工作中进一步
研究。
棉花是双子叶植物, 易受农杆菌感染, 转化效
率较高, 以 GUS作为标记基因辅助显微分析等手段
在棉花中对瞬时表达跟踪分析能更加快速地鉴定出
启动子的转录活性。因此本研究采用农杆菌介导法
转化花粉, 对棉花 U6启动子的功能进行分析。前人
研究表明, 在农杆菌介导的转化过程中, 改变受体
材料所处环境的压强以负压真空渗透的形式可以显
682 作 物 学 报 第 42卷


著提高农杆菌对植物的转化效率[17,27]。棉花花粉在
适当的负压下 , 组织表面会形成许多微小的创伤 ,
同时分泌一些酚类物质 , 有利于对农杆菌的吸附 ,
使得农杆菌通过细胞间隙转移到细胞组织中, 提高
转化效率。将构建好的 GbU6-5P::GUS 的表达载体
利用基因枪瞬时转化法转化棉花花粉, 虽然能够转
化成功 , 但是存在明显不足 , 转化效率较低 , 实验
成本较高。本研究充分借鉴前人鉴定花粉特异性启
动子的方法[16-17], 采用农杆菌真空渗透法转化棉花
花粉, 结果显示抽真空处理与不抽真空处理存在显
著差异, GbU6-5P6 和 GbU6-5P7 真空处理转化效率
分别较非真空处理提高了 95.9%和 73.1%。由此可见,
在农杆菌介导转化法中, 人为增加负压的方式可以
明显提高棉花花粉转化的效率。
以上结果显示有效截短的 GbU6 启动子转录活
性更高, 采用较短的 U6 启动子可提高 sgRNA 的转
录水平, 最终可能会大幅度提高 CRISPR/Cas9 系统
基因编辑的效率。
4 结论
克隆了 3 个短小的、在棉花花粉细胞中具有转
录功能的GbU6启动子; 同一GbU6启动子不同片段
大小的转录活性并不相同, 较短的启动子转录活性
更强。研究结果也暗示在较长片段的棉花 U6启动子
上, 可能含有抑制转录活性的调控元件。短的具有
转录活性的 GbU6-5P7、GbU6-1P5、GbU6-7P5片段
可为构建棉花 CRISPR/Cas9基因组编辑载体提供更
多有效的启动子。
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