全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(4): 727734 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(31071406, 31101093)和江苏省普通高校研究生科研创新计划项目(立项类, 2011-997)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 陈建民, E-mail: jmchen@yzu.edu.cn, Tel: 0514-87979286
第一作者联系方式: E-mail:sqchen1116@163.com, Tel: 18752741813
Received(收稿日期): 2012-11-15; Accepted(接受日期): 2013-01-16; Published online(网络出版日期): 2013-01-00.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130100.0000.000.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00727
基于 SLAF-seq技术开发长穗偃麦草染色体特异分子标记
陈士强 秦树文 黄泽峰 戴 毅 张璐璐 高营营 高 勇 陈建民*
扬州大学生物科学与技术学院, 江苏扬州 225009
摘 要: 长穗偃麦草 1E 及 7E 染色体上带有重要的抗赤霉病基因, 开发大量相关染色体特异分子标记有助于准确定
位抗性基因及获得可用于辅助育种紧密连锁的标记。基于 SLAF-seq 技术, 获得了 368 个长穗偃麦草 1E 染色体特异
片段, 随机选取 80 个特异片段设计引物, 开发了 20 个长穗偃麦草 1E 染色体特异分子标记、2 个长穗偃麦草基因组
特异分子标记及 26 个其他特异分子标记, 效率达 60%。用这些特异标记能稳定检测出不同小麦–长穗偃麦草衍生材
料中的 1E染色体或片段。通过标记与优良性状的共分离特性, 获得与相关基因紧密连锁的标记, 将为小麦抗性育种
中的分子标记辅助选择提供依据。
关键词: 长穗偃麦草; SLAF-seq 技术; 染色体特异分子标记; 小麦赤霉病; 分子标记辅助选择
Development of Specific Molecular Markers for Thinopyrum elongatum
Chromosome Using SLAF-seq Technique
CHEN Shi-Qiang, QIN Shu-Wen, HUANG Ze-Feng, DAI Yi, ZHANG Lu-Lu, GAO Ying-Ying, GAO Yong,
and CHEN Jian-Min*
College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
Abstract: The 1E and 7E chromosomes of Thinopyrum elongatum carry important resistance genes to wheat Fusarium head
blight. Mapping and utilization of these resistance genes require numerous molecular markers specific to the 1E or 7E chromo-
some. In this study, we developed 368 specific fragments of Thinopyrum elongatum 1E chromosome using SLAF-seq technique,
and randomly selected 80 fragments to design specific primers. Finally, 20 1E-specific, 2 genome-specific, and 26 other specific
molecular markers were obtained, with the efficiency up to 60%. All the newly developed markers could amplify the specific
bands in different lines derived from wheat–Th. elongatum progenies. According to the cosegregation of the specific markers and
elite traits, some markers detected could be closely linked to the genes corresponding to target traits.
Keywords: Thinopyrum elongatum; SLAF-seq technique; Chromosome specific molecular marker; Wheat Fusarium head blight;
Marker-assisted selection
长穗偃麦草(Thinopyrum elongatum, syn. Lophopyrum
elongatum, Agropyron elongatum)是重要的小麦近缘种 ,
一般认为有二倍体(2n=2x=14, EE 或 EeEe或 E1E1)、四倍
体(2n=4x=28, EeEeEbEb或 E1E1E2E2)及十倍体(2n=10x=70,
EeEeEbEbExExStStStSt 或 EEE1E1E2E2E4E4E5E5) 3 种类型,
但也有人认为存在六倍体长穗偃麦草(2n=6x=42)[1], 二倍
体长穗偃麦草的 E 基因组是该物种的基本基因组[2-3]。长
穗偃麦草主要分布于温带和寒带, 为多年生草本, 具有长
穗、多花、籽粒蛋白含量高、适应性和繁殖力强等优良性
状, 其基因组中蕴含着丰富的抗病、抗寒、抗旱、耐盐碱
等对小麦改良极为有用的基因[4-6]。由于其 E 基因组与小
麦 A、B、D 基因组的遗传分化程度较小, 在进化上与小
麦亲缘关系较近, 与小麦易于杂交结实, 一直被认为是小
麦的宝贵外源基因资源库 , 已成为小麦遗传改良的重要
野生种质资源[7-10]。李振声等利用长穗偃麦草与小麦杂交
育成了小偃 6号为代表的系列小麦品种, 美国科学家也获
得了大量表现优良的长穗偃麦草与小麦杂交后代 [11], 充
分证明其在小麦遗传改良中的重要作用。普通小麦中国春
–二倍体长穗偃麦草染色体异附加系、代换系的培育成功,
使二倍体长穗偃草的抗病、抗逆和品质特性在染色体水平
上得以广泛深入研究[12-13]。
小麦赤霉病(Fusarium head blight, FHB)是由禾谷镰
728 作 物 学 报 第 39卷
刀菌(Fusarium graminearum Sehw.)等多种镰刀菌引起的
小麦主要病害之一 , 尽管小麦自身种质中有一些抗性资
源[14-16], 但仍然难以满足小麦抗赤霉病育种的需要。长穗
偃麦草因其基因组中存在大量优良抗病基因而备受关注。目
前的研究发现, 长穗偃麦草的 1E[9,11,17-18]和 7E染色体[8-9,19-21]
上带有小麦赤霉病抗性基因, 因此, 充分挖掘和利用这些
抗性基因, 将丰富小麦育种中的抗性基因资源。
分子标记辅助选择(MAS)是基于分子标记筛选有利
的连锁基因或培育多基因品种的技术, 开发与优良基因紧
密连锁的分子标记对分子标记辅助选择育种意义重大[22]。
由于长穗偃麦草染色体上具有抗病基因 , 开发大量长穗
偃麦草染色体特异分子标记 , 将提高获得与抗病基因紧
密连锁的分子标记概率, 加快小麦抗性育种进程。目前,
已利用 RAPD[23-24]、SSR[2,11,19,25-26]、RFLP[27-28]、AFLP[29-30]、
SCAR[24,31-32]、CAPS[19,33]、RGAP[34]、STS[30]、TRAP[11]、
SSH[35]等技术开发了一些长穗偃麦草特异分子标记。然而,
小麦和长穗偃麦草的基因组序列的同源性较高 , 加之目
前还没有小麦和长穗偃麦草基因组的全序列信息 , 开发
长穗偃麦草的特异分子标记普遍存在成本高、周期长、效
率低等缺点, 难以获得大量染色体特异分子标记。获得与
抗性基因紧密连锁的分子标记用于辅助选择 , 必须建立
在大量的分子标记可供选择的基础上。因此, 开发大量长
穗偃麦草染色体特异分子标记 , 将为小麦育种中导入长
穗偃麦草优良基因进行分子标记辅助选择提供重要基础。
SLAF-seq (specific length amplified fragment se-
quencing)技术是由高通量测序技术发展而来。通过生物信
息学进行实验方案系统设计, 构建 SLAF-seq 文库, 筛选
特异长度 DNA 片段, 以高通量测序技术获得海量序列,
利用软件进行数据分析比对, 获得大量特异 DNA 片段,
进而依据其序列发展出特异分子标记。SLAF-seq 技术具
有通量高、准确性高、成本低、周期短等突出优势, 依其
测序结果可直接开发大量特异分子标记。该技术可用于单
体型图谱、遗传图谱、关联性图谱、多态性图谱的构建, 为
分子育种、系统进化、种质资源鉴定提供重要技术保障。
本文首次利用 SLAF-seq 技术获得大量长穗偃麦草 1E 染
色体特异片段, 开发了一批特异性强、稳定性高的 1E 染
色体特异分子标记, 其开发效率明显提高。SLAF-seq 技
术的应用为丰富植物染色体特异分子标记提供了一个便
捷途径。
1 材料与方法
1.1 植物材料
二倍体长穗偃麦草(Th. elongatum, 2n=2x)、普通小麦
中国春、中国春–长穗偃麦草 1E~7E 染色体异附加系(DA
系列)、部分中国春–长穗偃麦草 1E~7E 染色体异代换系
(DS系列)、四倍体小麦 Langdon、Langdon–长穗偃麦草双二
倍体(8801)、四倍体长穗偃麦草(Th. elongatum, 2n=4x)及十倍
体长穗偃麦草(Th. elongatum, 2n=10x)(PI179162/PI204383)
用于长穗偃麦草 1E 染色体特异标记开发及其稳定性检测,
由加拿大农业部的 Fedak 博士惠赠。普通小麦品种扬麦
10号、扬麦 14、扬麦 16、扬麦 18、扬麦 158、宁麦 13、
安农 8455 和苏麦 3 号用于特异分子标记的稳定性检测,
由江苏省里下河地区农业科学研究所程顺和院士提供。安
农 8455与 DS1E(1D)正交 F1 (AD-F1)及 F2代 (AD-F2)用于
特异标记的稳定性检测, 由本实验室通过杂交获得。
1.2 长穗偃麦草 1E染色体特异 SLAF片段的获得
取两叶一心期的各材料嫩叶, 采用改良的 SDS 法提
取其基因组 DNA[36]。经 0.8%琼脂糖电泳检测浓度, 稀释
至 100 ng µL1。利用酶切预测软件 SLAF_Predict (北京百
迈客公司开发, 北京市顺义区空港科技创业园)系统分析
小麦基因组, 根据其 GC含量、重复序列和基因特点等确
定酶切方案、切胶范围及测序量, 以保证分子标记的密度
和均匀性。
分别取中国春、长穗偃麦草(2n=2x)及附加系 DA1E
的基因组 DNA各 500 ng, 加 0.6 U Mse I (NEB, Hitchin,
Herts, UK)、T4 DNA连接酶(NEB)、ATP (NEB)和 Mse I
接头(NEB)在 37℃下反应 15 h, 65℃退火 1 h, 然后加限制
性内切酶 Hae III和 Bfa I在 37℃下反应 3 h。反应结束后
用 Quick Spin column (Qiagen)纯化酶切产物, 并用 33 μL
EB回溶。
以回收的酶切产物为模板进行 PCR 反应, 反应体系
25 µL, 包括模板 DNA 100ng、10×buffer 2.5 μL、2.5 mmol
L–1 dNTP 2 μL、5 U μL–1的 Taq DNA合成酶(NEB) 0.3 µL、
10 μmol L–1 Mse I引物 2 µL、ddH2O加至 25 μL。PCR产
物经 E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (Omega)纯化后, 加入Mse I、
T4 DNA连接酶、ATP及 Solexa接头, 37℃下反应 5 h。利
用 Quick Spin Column (Qiagen)纯化产物, 2%琼脂糖胶电
泳。利用 Gel Extraction Kit (Qiagen)回收琼脂糖胶中 300~
500 bp的条带, 并以其为模板, 在含 Phusion Master Mix
(NEB)和Solexa引物混合物中进行PCR扩增, 扩增产物经纯
化后用 Illumina GAIIx (Illumina, San Diego, CA, USA)测序。
每个样品的测序有效数据量需达到 50 000 个以上,
测序深度 5×以上。利用软件 SLAF_Poly.pl. (北京百迈客
公司开发)对测序结果进行识别和低质量过滤, 得到中国
春、长穗偃麦草(2n=2x)及 DA1E的有效原始 DNA序列数
据, 再利用比对软件 BLAT [37]将各样品有效数据分别进
行相似度聚类, 并通过深度识别, 纠正测序错误, 得到各
样品有效序列。
以 DA1E 及长穗偃麦草(2n=2x)的测序结果分别与所
获得的中国春的 DNA序列、北京百迈客公司的小麦 BAC
数据库及 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/和 http://www.cere
alsdb.uk.net/网站上公布的小麦 DNA序列进行比对, 获得
与小麦同源性小于 50%的特异片段, 可分别视为长穗偃
麦草 E 基因组和 1E 染色体特异片段, 再将上述片段进行
序列比对, 获得同源性高于 80%的序列, 即为长穗偃麦草
1E染色体特异片段。
1.3 长穗偃麦草染色体特异分子标记的开发及稳定性检测
根据长穗偃麦草 1E 染色体特异序列设计引物, 在
第 4期 陈士强等: 基于 SLAF-seq技术开发长穗偃麦草染色体特异分子标记 729
DA1E 及中国春中进行 DNA 扩增。PCR 体系 25 µL, 含
100 ng μL–1模板 DNA 1 μL、10× buffer 2.5 μL、2.5 mmol
L–1 dNTP 2 μL、10 μmol L–1正向和反向引物各 1 μL、5 U
μL–1 Taq DNA合成酶 0.3 µL、ddH2O 17.2 μL。PCR程序
为 94℃预变性 5 min; 94℃变性 45 s, 45~60 ℃ (依引物而
定)退火 1 min, 72℃延伸 1.5 min, 35个循环; 72℃ 终延伸
10 min。用 0.8%琼脂糖胶电泳检测扩增产物。将只在
DA1E 中有扩增产物而在中国春中没有扩增产物的标记
作为长穗偃麦草 1E染色体特异分子标记。
为了验证这些标记的重复性、稳定性及特异性, 将其
在长穗偃麦草二倍体 (2n=2x)、四倍体 (2n=4x)和十倍体
(2n=10x)、中国春、DA 系列、DS 系列、Langdon、扬麦
10号、扬麦 14、扬麦 16、扬麦 18、扬麦 158、宁麦 13、
安农 8455、苏麦 3号、8801及 AD-F1和 AD-F2中进行扩
增, 用 0.8%琼脂糖胶电泳检测结果。特异扩增条带经切
胶回收、重测序, 将其 DNA序列再次与已知小麦的 DNA
序列比对, 检测其特异性。
2 结果与分析
2.1 长穗偃麦草(2n=2x)基因组及其 1E 染色体特异序列
的筛选
采用 SLAF-seq 技术 , 获得中国春、长穗偃麦草
(2n=2x)及 DA1E 的原始序列。经测序, 3 个样品的 Raeds
数分别达 1 038 100、459 827和 516 390, 有效 SLAF片段
数为 70 152、49 848和 51 852, 平均测序深度均在 5×以
上, 达到预期目标。
测序得到的长穗偃麦草 (2n=2x)和 DA1E 的有效
SLAF 片段 , 其 DNA 序列经与中国春及其他已知小麦
DNA序列比对, 初步获得 20 170个长穗偃麦草基因组特
异片段和 3257个长穗偃麦草 1E染色体特异片段。进一步
比对两者, 最终获得同源性高于 80%的序列 368个, 即长
穗偃麦草 1E染色体特异序列。
2.2 引物设计与长穗偃麦草染色体特异分子标记的开发
根据长穗偃麦草 1E染色体特异 SLAF序列的筛选结
果, 任意选择 80个序列分别设计 1对引物, 以中国春、长
穗偃麦草(2n=2x)、DA1E~DA7E的基因组 DNA为模板进
行扩增, 共开发了 48个长穗偃麦草特异分子标记(表 1),
效率达 60%。其中, 1E染色体特异分子标记 20个(图 1-A),
效率为 25%; 基因组特异分子标记 2 个(图 1-B); 其他染
色体的特异标记 26个, 包括 17个仅出现在 1E和 5E染色
体上的标记(图 1-C)。
2.3 长穗偃麦草染色体特异分子标记的重复性、稳定性
及特异性检测
对中国春–长穗偃麦草 DA 系列和 DS 系列、8801、
多倍体长穗偃麦草、不同小麦品种及安农 8455 与 DS1E
(1D)杂交后代的分子标记特异性和稳定性鉴定。表明本研
究开发的长穗偃麦草染色体特异分子标记具有很高的重
复性、稳定性和特异性。以标记 M1E_No.1 为例, 其在
7 份 DA 系列材料中, 仅出现在 DA1E 中(图 1-A); 在 19
份 DS 系列材料中, 仅在含有 1E 染色体的材料中检测到
特异扩增片段(图 2); 在 8801及长穗偃麦草二倍体、四倍
体和十倍体中均有稳定的扩增产物 , 但在四倍体小麦
Langdon 及普通小麦品种扬麦 10号、扬麦 14、扬麦 16、
扬麦 18、扬麦 158、宁麦 13、安农 8455、苏麦 3 号中没
有检测到目标片段(图 3); 在安农 8455 与 DS1E(1D)杂交
后代中, 目标片段出现在 AD-F1中, 而在 60 个 AD-F2单
株中表现分离(图 4), 其中有扩增片段的单株 42 个, 没有
扩增片段的单株 18个, 符合 3∶1的分离比(χ2=0.800, P=
0.371)。
随机选取 10 个长穗偃麦草染色体特异分子标记, 经
PCR 扩增、切胶回收、重新测序, 其所对应的 DNA 序列
在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/和 http://www.cerealsdb.uk.
net/进行比对, 结果这些标记与已知小麦序列均无同源性
或同源性低于 50%, 而与所获得长穗偃麦草(2n=2x)序列
的同源性均高于 80%。
3 讨论
3.1 SLAF-seq技术在分子标记开发上的可行性及优势
长穗偃麦草是小麦近缘种, 其 DNA序列与小麦存在
很高的同源性, 利用常规方法开发长穗偃麦草基因组特
异分子标记难度较大, 开发其染色体特异分子标记难度
更大, 从而影响了长穗偃麦草特异分子标记的开发及对
其优良基因的利用。SLAF-seq 技术是基于生物信息学、
高通量测序仪等的高度自动化技术, 获得的海量序列信
息可满足任何密度的全基因组分布, 以实现候选功能区
域的精细定位, 数字化信号和高覆盖保证了获得标签的
准确性, 高通量分子标记开发成本低于常规分子标记, 可
以一次性获得大量的特异 DNA 序列, 为开发大量的特异
分子标记提供了序列基础。本研究利用 SLAF-seq技术获
得 368个长穗偃麦草 1E染色体特异片段, 利用其中 80个
序列成功开发出 48个长穗偃麦草特异分子标记, 其中包
括 20个长穗偃麦草 1E染色体特异分子标记, 成功效率高
达 25%。而通过常规方法开发长穗偃麦草染色体特异分子
标记效率很低, 如刘树兵等[23]利用 26对 RAPD 引物获得
94个长穗偃麦草特异条带, 仅获得 3个长穗偃麦草 1E及
3E 染色体特异分子标记; 尤明山等[24]利用 100 对 RAPD
引物仅获得 1 个长穗偃麦草特异 SCAR 标记, 利用 40 对
SSR引物获得 108个长穗偃麦草特异位点, 但发展了 1个
长穗偃麦草基因组特异分子标记[25]; 张丽等[30]利用 5 对
AFLP引物进行分析, 共筛选出 28个长穗偃麦草特异片段,
仅发展了 4个长穗偃麦草染色体特异分子标记 ; 葛江燕
等[35]利用 SSH方法获得 65个长穗偃麦草特异序列, 仅发
展了 1个长穗偃麦草染色体特异分子标记。另据北京百迈
客公司统计, SLAF-seq 技术开发分子标记的平均成本不
到 AFLP 技术的 1/8, 而其效率却高近 27 倍(http://www.
biomarker.com.cn/)。可见, SLAF-seq技术不仅可以很好地
730 作 物 学 报 第 39卷
表 1 长穗偃麦草染色体特异分子标记及其引物
Table 1 Chromosome specific molecular markers and primers of Th. elongatum
引物序列 Sequences of primer (5′–3′) 标记
Marker
引物
Primer 正向引物 Forward primer 反向引物 Reverse primer
扩增染色体
Amplified chromosome
原始片段
Original fragment
M1E_No.1 SP1E_No.1 TATCAAATAATATGTGCATG CATGACAGAGATATGAAAAG 1E SLAF17868
M1E_No.2 SP1E_No.2 GGGACCATGATTTTGTGTGA TGCCCATCCCCTCAAA 1E, 5E SLAF219201
M1E_No.3 SP1E_No.3 TGATCTTGTGTCGAAGTAGG CCCCTACTTGTTGATTATGA 1E, 5E SLAF10586
M1E_No.4 SP1E_No.4 AGTACAACCACATATGCTCA AATCTCAAAGACGTAAAACC 1E, 5E SLAF17577
M1E_No.5 SP1E_No.5 ATCTACTTTACTGCATTACC AGCACTTTATCTGGGAAC 1E–7E SLAF4683
M1E_No.6 SP1E_No.6 TTAGTATTGTTACATCATCA CGTGTTATTCTTAGAAGTTA 1E, 5E SLAF143423
M1E_No.7 SP1E_No.7 ATAAAAGAATCAACTAAAAT GTTCATTTATATAAAGTGTA 1E, 5E SLAF235277
M1E_No.8 SP1E_No.8 AATATTTATGGCGCACGCAG TCATCAGGGGAGTGAGGAGC 1E SLAF16627
M1E_No.9 SP1E_No.9 ACCACAGGGAAATCA CCAGAATCTTCTTGCA 1E, 5E SLAF44229
M1E_No.10 SP1E_No.10 CTGTGGAAATAGGAAGGATG ATCCCAACATTGGCTATTTA 1E, 5E SLAF28060
M1E_No.11 SP1E_No.11 TTTTTTCGCAAGTTCAAGTA TGCTCAGTGGCTTTGTAATA 1E, 5E SLAF23072
M1E_No.12 SP1E_No.12 GCCAAACTCTTAGCTTATAT CTGCACATATTTATAGAGCC 1E, 5E SLAF145543
M1E_No.13 SP1E_No.13 AATGCTTAGACCTTTGTATC TGACATTACAACAACAACTG 1E–7E SLAF33256
M1E_No.14 SP1E_No.14 CATCCAGATACTTGATTACT ATGTCAACTTTTGTATTTTC 1E, 5E SLAF83735
M1E_No.15 SP1E_No.15 GGAATCTCGTCCAAAA AAAATGAACCAAACCC 1E, 5E SLAF13551
M1E_No.16 SP1E_No.16 TGACTGCCTTTGGTTG CGTAGTGATGATGGAGC 1E, 2E, 5E SLAF74711
M1E_No.17 SP1E_No.17 TACTCTTGAGTTACCACCAC ATGCTACATATTGTCTTTTG 1E, 5E SLAF128326
M1E_No.18 SP1E_No.18 AACCCCGAAATAGAATAAAC TGATCCTTTAGATATTTGCA 1E, 3E, 5E SLAF15991
M1E_No.19 SP1E_No.19 GTCTGAATAGCACTCTGTTA TGTTTCTGATGTAAGATGTT 1E, 5E SLAF183157
M1E_No.20 SP1E_No.20 TCACCGATAAATAACAAGAG ATATGATATACAACAACGCG 1E, 5E SLAF230456
M1E_No.21 SP1E_No.21 CATCATATAAGAATGCAGGA TCAACAGCACGCCAAC 1E SLAF10897
M1E_No.22 SP1E_No.22 AGCACATTCCTGAAGTTGAT GCCATCAATAATATCCAGTG 1E, 2E, 5E, 6E SLAF352
M1E_No.23 SP1E_No.23 TAGGAAAGAAATCTGAAATA TGAGACAGCAGCAAAA 1E SLAF44318
M1E_No.24 SP1E_No.24 GTGTTATTTTGTGCCA AGCAAAGAATAGCATG 1E, 5E SLAF21954
M1E_No.25 SP1E_No.25 GCTACTGGGATGGTTA TGTTCCTGTTCTTTGAC 1E, 5E SLAF732
M1E_No.26 SP1E_No.26 CTGGTAATTCTAATTTGGTA TGCGAATAAAATTTGATC 1E, 5E SLAF29540
M1E_No.27 SP1E_No.27 GGCTGATGCACTGACGT TCCGAAATCTGAAAAGGAG 1E SLAF35023
M1E_No.28 SP1E_No.28 GAGGGGTTCAAGTTCT ATGCTCAATCAATCTTCT 1E, 4E, 6E SLAF17880
M1E_No.29 SP1E_No.29 ACTGTTTTTTTTTTCGAG AGCGCACAAGATGAGAC 1E SLAF15923
M1E_No.30 SP1E_No.30 TTAGAAAAATTCAACCCG AATCTTGAAACATGGGAG 1E SLAF235066
M1E_No.31 SP1E_No.31 CCGGTTTGAAAGAAGAGA CAACAAGCAAATGAGGGA 1E SLAF186552
M1E_No.32 SP1E_No.32 GAGCCTGTGGGTGATAG TGTGTCGTAGAGAGGTGTT 1E, 2E, 4E, 5E, 7E SLAF2934
M1E_No.33 SP1E_No.33 TCACCTATGAGATCGCT TATCCGAAGAACCTGTAC 1E SLAF6492
M1E_No.34 SP1E_No.34 TGTTCCTTGCATCATCT AACTCACCTATCGGTCTAT 1E SLAF125713
M1E_No.35 SP1E_No.35 TTGACAACCCAATCTG TCACTGATAAATAACAAGAG 1E SLAF16723
M1E_No.36 SP1E_No.36 TGACGGCAACGGAGTG TCTGCCGAACATGGAATC 1E SLAF33089
M1E_No.37 SP1E_No.37 AGCACTTGGGTTTTCAT GGATTGGAGGGTCACTA 1E SLAF13087
M1E_No.38 SP1E_No.38 TTCAAGAAGTATAGCTCGTT AACCATAAAGTCCCAACA 1E SLAF26496
M1E_No.39 SP1E_No.39 GAAAACCTTAGACTTACATC TTCTATTGAAAGTTGGACT 1E, 2E, 6E SLAF25800
M1E_No.40 SP1E_No.40 GGAATTCAAAGAAGAACA TTCGTCCATATCCTATTT 1E, 2E, 4E SLAF24694
M1E_No.41 SP1E_No.41 GGAAAGGGCACTCCAACC GCGTCACATCCTGGTTCG 1E SLAF210166
M1E_No.42 SP1E_No.42 CTCCATCCCTCCACTT AACATCAGCAGTTGGG 1E SLAF19498
M1E_No.43 SP1E_No.43 TTAGCGAAATACGGACAC TCTGAAAAGAAGCTCGTT 1E, 3E, 4E SLAF21191
M1E_No.44 SP1E_No.44 TTGACTTCTCCCAAGTTG AATGGAAAGGAAAATCTG 1E SLAF7533
M1E_No.45 SP1E_No.45 TCTATTTTGCTATTTGCC TTTTGTCTTCATCACCAT 1E SLAF6377
M1E_No.46 SP1E_No.46 AAATACACTTTGGGCACC TCTGAATTGGATGTTGGA 1E, 4E, 5E, 6E SLAF40734
M1E_No.47 SP1E_No.47 TACTCGCTACTTACAATCT GAACATTATTGTGAAGCA 1E SLAF14535
M1E_No.48 SP1E_No.48 CGGAATGTCCTCACA ATTGGCTAATGCTATGA 1E SLAF33510
标记名称由 M (表示分子标记)、1E (表示长穗偃麦草 1E染色体)和标记顺序号构成。引物名称由 SP (表示特异引物)、1E (长穗
偃麦草 1E染色体)和引物排序编号构成。原始片段名称由 SLAF (表示特异长度扩增片段)和编号组成。
The marker name is composed of “M” for molecular marker, “1E” for Th. elongatum chromosome 1E, and the marker series number.
The primer number is composed of “SP” for specific primer, “1E” for Th. elongatum chromosome 1E, and the series number of the primer..
The name of original fragment is composed of “SLAF” for specific length of amplified fragment and its number.
第 4期 陈士强等: 基于 SLAF-seq技术开发长穗偃麦草染色体特异分子标记 731
图 1 长穗偃麦草特性标记在中国春、长穗偃麦草及其附加系中
的扩增结果
Fig. 1 Amplification result of Th. elongatum specific primers
in Chinese Spring, Th. elongatum (2n=2x), and addition lines
A: M1E_No.1; B: M1E_No.5; C: MIE_No.14。M: DL2000; 1~7: 中
国春–长穗偃麦草 1E~7E染色体异附加系; 8: 中国春; 9: 二倍体
长穗偃麦草。
A: M1E_No.1(A); B: M1E_No.5(B); C: MIE E_No.14. M: DL2000;
1–7: DA1E to DA7E; 8: Chinese Spring; 9: Th. elongatum (2n=2x).
应用于植物染色体特异分子标记开发 , 并且其效率远远
高于 RAPD、SSR、AFLP、SSH等常规分子标记技术。
3.2 SLAF-seq 技术开发长穗偃麦草染色体特异分子标
记的可靠性
本研究所开发的特异分子标记经在 DA系列、DS系
列、8801、不同类型的长穗偃麦草(2n=2x, 2n=4x, 2n=10x)、
普通小麦品种及安农 8455与 DS1E(1D)杂交 F1及 F2中的
检测, 表明利用 SLAF-seq 技术所开发的长穗偃麦草染色
体特异分子标记具有很高的重复性、稳定性及特异性。其
中, 在 60 个 AD-F2中有扩增与无扩增的比例经 χ2检测符
合 3∶1 的理论值, 即符合孟德尔遗传规律。通过对长穗
偃麦草染色体特异标记所对应的 DNA序列与已知小麦序
列的比对, 均表明利用 SLAF-seq 技术所获得的特异片段
与中国春及其他已知小麦的 DNA序列无同源性或同源性
很低, 而与所获得的长穗偃麦草(2n=2x)的 DNA序列的同
源性很高, 这与预期结果是一致的。
研究还发现, 根据 SLAF-seq技术获得的染色体特异
片段所开发的特异标记中有许多不仅特异出现在 1E染色
体上, 还会出现在其他染色体上。由于本研究只对 DA1E
及其亲本中国春和长穗偃麦草(2n=2x)测序与比对, 排除
与中国春及其他小麦的同源性大于 50%的序列, 获得与
长穗偃麦草(2n=2x)同源性高于 80%的序列, 这些序列被
视为长穗偃麦草 1E 染色体特异序列, 因此无法排除长穗
偃麦草 7条染色体中的同源性很高的序列, 导致有些标记
不仅出现在 1E 染色体上还出现在其他染色体上。在 48
个长穗偃麦草特异标记中, 只有 20个特异出现在 1E染色
体上, 而 28个不仅出现在 1E染色体上还出现在其他染色
体上, 说明长穗偃麦草各染色体的 DNA 序列存在不同程
度的同源性。所发展的标记中, 能够同时出现在 1E和 5E
染色体上的标记有 24 个, 意味着长穗偃麦草的 1E 和 5E
染色体的 DNA 序列的同源性较高, 这与长穗偃麦草的染
色体间可能发生过重排有关[28]。该结果不仅表明长穗偃
图 2 长穗偃麦草 1E染色体分子标记 M1E_No.1在中国春-长穗偃麦草代换系中的特异性和稳定性
Fig. 2 Specification and stability of marker M1E_No.1 in CS-Th. elongatum substitution lines
M: DL2000; 1: DS1E(1A); 2: DS1E(1B); 3: DS1E(1D); 4: DS2E(2A); 5: DS2E(2B); 6: DS2E(2D); 7: DS3E(3A); 8: DS3E(3B); 9: DS3E(3D);
10: DS4E(4A); 11: DS4E(4B); 12: DS4E(4D); 13: DS5E(5B); 14: DS5E(5D); 15: DS6E(6A); 16: DS6E(6D); 17: DS7E(7A); 18: DS7E(7B);
19: DS7E(7D); 20: CS; 21: Th.elongatum (2n = 2x).
图 3 长穗偃麦草 1E染色体分子标记 M1E_No.1在不同遗传背景长穗偃麦草和小麦品种中的特异性和稳定性
Fig. 3 Specification and stability of marker M1E_No.1 in Th. elongatum and common wheat materials with different backgrounds
M: DL2000; 1: Langdon; 2: 扬麦 10号; 3: 扬麦 14; 4: 扬麦 16; 5:扬麦 18; 6: 扬麦 158; 7: 宁麦 13; 8: 安农 8455; 9: 苏麦 3号; 10:
Langdon-长穗偃麦草双二倍体 8801; 11: 四倍体长穗偃麦草; 12: 十倍体长穗偃麦草(PI179162); 13: 十倍体长穗偃麦草(PI204383); 14:
中国春; 15: 二倍体长穗偃麦草。
M: DL2000; 1: Landon; 2: Yangmai 10; 3: Yangmai 14; 4: Yangmai 16; 5: Yangmai 18; 6: Yangmai 158; 7: Ningmai 13; 8: Annong 8455;
9: Sumai 3; 10: Langdon-Th. elongatum amphidiploid 8801; 11: Th. elongatum (2n = 4x); 12: Th. elongatum (2n = 10x, PI179162);
13: Th. elongatum (2n = 10x, PI204383); 14: Chinese Spring; 15: Th. elongatum (2n = 2x).
732 作 物 学 报 第 39卷
图 4 长穗偃麦草 1E染色体分子标记 M1E_No.1在 AD-F1及 AD-F2中的扩增特异性和稳定性
Fig. 4 Specification and stability of M1E_No.1 in AD-F1 and AD-F2
M: DL2000; 1: 安农 8455与 DS1E(1D)杂交 F1代; 2~61: 安农 8455与 DS1E(1D)杂交 F2代; 62: 安农 8455; 63: DS1E(1D)。
M: DL2000; 1: AD-F1; 2–61: AD-F2; 62: Annong 8455; 63: DS1E(1D).
麦草染色体特异分子标记的开发难度较大 , 也说明用
SLAF-seq 技术开发长穗偃麦草染色体特异分子标记的高
效性及可靠性。
3.3 长穗偃麦草染色体特异分子标记的应用
本研究所开发的长穗偃麦草染色体特异分子标记为
显性标记, 为其后续应用提供了良好的基础。利用所开发
的长穗偃麦草 1E 染色体特异分子标记对具有 1E 染色体
的相关群体进行分析, 结合对不同个体进行表型鉴定, 依
据分子标记与相关性状的共分离 , 既可以获得与抗性基
因紧密连锁的标记, 又可以精确定位优良基因, 不仅加快
了相关基因的研究 , 还为分子标记辅助育种提供重要途
径[8]。利用长穗偃麦草代换系与栽培小麦的杂交及反复回
交, 或借助 Ph 基因突变系获得含有长穗偃麦草 E 组染色
体的小片段交换重组个体,使长穗偃麦草中抗病基因的片
段导入小麦基因组 , 通过抗性鉴定和染色体特异分子标
记筛选, 可准确快速获得具有抗病性的后代[11,38]。利用长
穗偃麦草代换系与栽培小麦杂交的后代进行辐射 , 促使
染色体片段的断裂和重接 , 获得具有长穗偃麦草不同染
色体片段长度的易位系 , 通过发展的特异分子标记进行
选择 , 可获得具有优良性状的易位系作为亲本用于小麦
育种 , 确保准确获得理想的后代 [11,39], 该工作正在进行
中。
本研究所开发的一些标记不仅在长穗偃麦草 1E染色
体上出现, 也在 5E 染色体上出现, 它们也可作为特异标
记用于含 5E 染色体的相关群体的分析。因此, 开发大量
长穗偃麦草染色体特异分子标记不仅可快速便捷地检测
不同背景中的长穗偃麦草染色体 , 而且可促进长穗偃麦
草中优良基因的挖掘和利用 , 不断丰富小麦优良抗性基
因资源, 为进一步加快抗病、抗逆小麦育种步伐提供强有
力的保障。
References
[1] Mao P S, Huang Y, Wang X G, Meng L, Mao P C, Zhang G F.
Cytological evaluation and karyotype analysis in plant germ-
plasms of Elytrigia Desv. Agric Sci China, 2010, 9: 1553–1560
[2] Li N(李娜), Wang X-P(王献平), Cao S-H(曹双河), Zhang
X-Q(张相岐). Genome constitution of Agropyron elongatum 4x
by biochemical and SSR markers. Acta Genet Sin (遗传学报),
2005, 32(6): 571–578 (in Chinese with English abstract)
[3] Yan X-D(闫小丹), Li J-L(李集临), Zhang Y-M(张延明). Appli-
cation study of genetic resources in Elytrigia. Biotechnol Bull (生
物技术通报), 2010(6): 18–21 (in Chinese with English abstract)
[4] Chen S Y, Xia G M, Quan T Y, Xiang F N, Jin Y, Chen H M. In-
trogression of salt-tolerance from somatic hybrids between com-
mon wheat and Thinopyrum ponticum. Plant Sci, 2004, 167:
773–779
[5] Li Z, Li B, Tong Y. The contribution of distant hybridization with
decaploid Agropyron elongatum to wheat improvement in China.
J Genet Genomics, 2008, 35: 451–456
[6] Garg M, Tanaka H, Ishikawa N, Takata K, Yanaka M, Tsujimoto
H. Agropyron elongatum HMW-glutenins have a potential to im-
prove wheat end-product quality through targeted chromosome
introgression. J Cereal Sci, 2009, 50: 358–363
[7] Lammer D, Cai X W, Arterburn M, Chatelain J, Murray T, Jones
S. A single chromosome addition from Thinopyrum elongatum
confers a polycarpic, perennial habit to annual wheat. J Exp Bot,
2004, 55: 1715–1720
[8] Zhang X L, Shen X R, Hao Y F, Cai J J, Ohm H W, Kong L R. A
genetic map of Lophopyrum ponticum chromosome 7E harboring
resistance genes to Fusarium head blight and leaf rust. Theor
第 4期 陈士强等: 基于 SLAF-seq技术开发长穗偃麦草染色体特异分子标记 733
Appl Genet, 2011, 122: 263–270
[9] Fu S L, Lü Z L, Qi B, Guo X, Li J, Liu B, Han F P. Molecular
cytogenetic characterization of wheat-Thinopyrum elongatum ad-
dition, substitution and translocation lines with a novel source of
resistance to wheat Fusarium head blight. J Genet Genomics,
2012, 39: 103–110
[10] Hu L J, Liu C, Zeng Z X, Li G R, Song X J, Yang Z J. Genomic
rearrangement between wheat and Thinopyrum elongatum re-
vealed by mapped functional molecular markers. Genes Geno-
mics, 2012, 34: 67–75
[11] Jauhar P P, Peterson T S, Xu S S. Cytogenetic and molecular
characterization of a durum alien disomic addition line with en-
hanced tolerance to Fusarium head blight. Genome, 2009, 52:
467–483
[12] Dvorák J, Knott D R. Disomic and ditelosomic additions of dip-
loid Agropyron elongatum chromosomes to Triticum aestivum.
Can J Genet Cytol, 1974, 16: 399–417
[13] Dvorák J, Sosulski F W. Effects of additions and substitutions of
Agropyron elongatum chromosomes on characters in wheat. Can
J Genet Cytol, 1974, 16: 627–637
[14] Cuthbert P A, Somers D J, Thomas J, Cloutier S, Brule-Babel A.
Fine mapping Fhb1, a major gene controlling Fusarium head
blight resistance in bread wheat (Triticum aestivum L.). Theor
Appl Genet, 2006, 112: 1465–1472
[15] Cuthbert P A, Somers D J, Brule-Babel A. Mapping of Fhb2 on
chromosome 6BS: a gene controlling Fusarium head blight field
resistance in bread wheat (Triticum aestivum L.). Theor Appl
Genet, 2007, 114: 429–437
[16] Qi L L, Pumphrey M O, Friebe B, Chen P D, Gill B S. Molecular
cytogenetic characterization of alien introgressions with gene
Fhb3 for resistance to Fusarium head blight disease of wheat.
Theor Appl Genet, 2008, 117: 1155–1166
[17] Liu D-C(刘登才), Zheng Y-L(郑有良), Wang Z-R(王志容), Hou
Y-C(侯永翠), Lan X-J(兰秀锦), Wei Y-M(魏育明). Distribution
of chromosomes in diploid Lophopyrum elongatum (Host) A.
Love that influences resistance to head scab of common wheat. J
Sichuan Agric Univ (四川农业大学学报), 2001, 19(3): 200–205
(in Chinese with English abstract)
[18] Chen S-Q(陈士强), Huang Z-F(黄泽峰), Zhang Y(张勇), Ge
J-Y(葛江燕), Zhu X(朱雪), Gao Y(高勇), Chen J-M(陈建民).
Chromosomal location of the genes associated with FHB resis-
tance of Lophopyrum elongatum in Chinese Spring background. J
Triticeae Crops (麦类作物学报), 2012, 32(5): 839–845 (in Chi-
nese with English abstract)
[19] Shen X R, Kong L R, Ohm H. Fusarium head blight resistance in
hexaploid wheat (Triticum aestivum)-Lophopyrum genetic lines
and tagging of the alien chromatin by PCR markers. Theor Appl
Genet, 2004, 108: 808–813
[20] Shen X R, Ohm H. Fusarium head blight resistance derived from
Lophopyrum elongatum chromosome 7E and its augmentation
with Fhb1 in wheat. Plant Breed, 2006, 125: 424–429
[21] Wang J R, Wang L, Gulden S, Rocheleau H, Balcerzak M, Hattori
J, Cao W, Han F, Zheng Y L, Fedak G, Ouellet T. RNA profiling
of Fusarium head blight-resistant wheat addition lines containing
the Thinopyrum elongatum chromosome 7E. Can J Plant Pathol,
2010, 32: 188–214
[22] Du J-K(杜军凯), Yu G-H(余桂红), Wang X-E(王秀娥), Ma
H-X(马鸿翔). Development and validation of a SSCP marker for
Fusarium head blight resistance QTL region in wheat. J Triticeae
Crops (麦类作物学报), 2010, 30(5): 829–834 (in Chinese with
English abstract)
[23] Liu S-B(刘树兵), Jia J-Z(贾继增), Wang H-G(王洪刚), Kong
L-R(孔令让), Zhou R-H(周荣华). Special chromosome markers
for E genome and DNA polymorphism between Agropyron elon-
gatum (2n = 14) and common wheat detected by RAPD markers.
Acta Agron Sin (作物学报), 1998, 24(6): 687–690 (in Chinese
with English abstract)
[24] You M-S(尤明山), Li B-Y(李保云), Tang Z-H(唐朝晖), Liu
S-B(刘守斌), Song J-M(宋健民), Mao S-F(毛善峰). Establish-
ment of E-genome specific RAPD and SCAR markers for Thi-
nopyrum spp. J China Agric Univ (中国农业大学学报), 2002,
7(5): 1–6 (in Chinese with English abstract)
[25] You M-S(尤明山), Li B-Y(李保云), Tian Z-H(田志会), Tang
Z-H(唐朝晖), Liu S-B(刘守斌), Liu G-T(刘广田). Development
of specific SSR marker for Ee-genome of Thinopymm sp. by
using wheat microsatellites. J Agric Biotechnol (农业生物技术
学报), 2003, 11(6): 577–581 (in Chinese with English abstract)
[26] Wang R R, Larson S R, Jensen K B. Analyses of Thinopyrum
bessarabicum, T. elongatum, and T. junceum chromosomes using
EST-SSR markers. Genome, 2010, 53: 1083–1089
[27] Autrique E, Tanksley S D, Sorrells M E, Singh R P. Molecular
markers for four leaf rust resistance genes introgressed into wheat
from wild relatives. Genome, 1995, 38: 75–83
[28] Liu S-B(刘树兵), Jia J-Z(贾继增), Wang H-G(王洪刚), Kong
L-R(孔令让), Zhou R-H(周荣华). Identification of homoeology
between the Elytrigia elongatum (2n = 14, EE) and wheat chro-
mosomes using biochemical and molecular markers. Acta Agron
Sin (作物学报), 1999, 26(1): 37–42 (in Chinese with English ab-
stract)
[29] Prins R, Groenewa J Z, Marais G F, Snape J W, Koebner R M D.
AFLP and STS tagging of Lr19, a gene conferring resistance to
leaf rust in wheat. Theor Appl Genet, 2001, 103: 618–624
[30] Zhang L(张丽), Yan Z-H(颜泽洪), Zheng Y-L(郑有良), Liu
D-C(刘登才), Dai S-F(代寿芬), Zhang L-Q(张连全), Wei Y-M
(魏育明). Development of Ee-chromosome specific AFLP and
STS molecular marker for Lophopyrum elongatum in Chinese
734 作 物 学 报 第 39卷
Spring wheat background. J Agric Biotechnol (农业生物技术学
报), 2008, 16(3): 465–473 (in Chinese with English abstract)
[31] Prabhu K V, Gupta S K, Charpe A, Koul S. SCAR marker tagged
to the alien leaf rust resistance gene Lr19 uniquely marking the
Agropyron elongatum-derived gene Lr24 in wheat: a revision.
Plant Breed, 2004, 123: 417-420
[32] Yan H-F(闫红飞), Yang W-X(杨文香), Chen Y-F(陈云芳),
Meng Q-F(孟庆芳), Liu D-Q(刘大群). Specificity and stability
of E-chromosome specific SCAR marker from Thinopyrum spp.
for Lr19. Acta Phytopathol Sin (植物病理学报), 2009, 39(1):
76–81 (in Chinese with English abstract)
[33] Li X M, Lee B S, Mammadov A C, Koo B C, Mott I W, Wang R
C. CAPS markers specific to Eb, Ee, and R genomes in the tribe
Triticeae. Genome, 2007, 50: 400–411
[34] Chen G-Y(陈国跃), Dong P(董攀), Wei Y-M(魏育明), He K(何
坤), Li W(李伟), Zheng Y-L(郑有良). Development of Ee- chro-
mosome-specific RGAP markers for Lophopyrum elongatum
(Host) in wheat background by using resistance gene analog
polymorphism. Acta Agron Sin (作物学报 ), 2007, 33(11):
1782–1787 (in Chinese with English abstract)
[35] Ge J-Y(葛江燕), Chen S-Q(陈士强), Gao Y-Y(高营营), Gao
Y(高勇), Zhu X(朱雪), Huang Z-F(黄泽峰), Chen J-M(陈建民).
Development of genome-specific molecular markers for Lo-
phopyrum elongatum based on suppression subtractive hybridiza-
tion. Acta Agron Sin (作物学报), 2012, 38(10): 1818–1826 (in
Chinese with English abstract)
[36] Wang J-X(王景雪), Sun Y(孙毅), Gao W-J(高武军). A simple of
practical method for extracting plant total DNA. J Shanxi Univ
(Nat Sci Edn) (山西大学学报 ·自然科学版 ), 2000, 23(3):
271–272 (in Chinese with English abstract)
[37] Kent W J. BLAT: the BLAST-Like alignment tool. Genome Res,
2002, 12: 656–664
[38] Ma J-X(马渐新), Zhou R-H(周荣华), Dong Y-C(董玉琛), Jia
J-Z(贾继增). Chromosomal location of the genes resistant to
wheat stripe rust from Lophopyrum elongatum. Chin Sci Bull (科
学通报), 1999, 44(1): 65–69 (in Chinese)
[39] Sears E R. Use of radiation to transfer alien segments to wheat.
Crop Sci, 1993, 33: 897–901