全 文 ：武汉植物学研究 1999, 17 (4) : 297～ 302
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
烟草雌蕊的花粉管生长途径中几种植物
激素的免疫金电镜观察Ξ
陈以峰　梁世平　杨弘远
(武汉大学生命科学学院发育生物学研究中心　武汉　430072)
周　燮
(南京农业大学农学系　南京　210095)
提　要　用免疫金电镜法观察了大叶烟花柱、珠孔及助细胞内玉米素 ( t2Z)、吲哚乙酸
( IAA )、赤霉素 (GA 7 与 GA 4)和脱落酸〔(+ )ABA 〕的分布。刚授粉时的花柱引导组织细胞内
与胞间基质中 t2Z 较多、IAA、GA 7ö4、(+ )ABA 较少; 授粉后 24 h (此时花粉管已穿过花柱中
部) , 该部位 t2Z 显著减少, IAA 略增加, GA 7ö4显著增加, 而 (+ )ABA 仍较少。授粉后 24 h, 花
柱中段薄壁组织细胞内与胞间基质中 IAA 比刚授粉时显著增加。增加的 IAA、GA 7ö4主要分
布在淀粉体、液泡与胞间基质中。穿过花柱中部的花粉管壁上有 IAA。刚授粉时珠孔与助细
胞内 t2Z 较多, 丝状器内有大量的 t2Z; 授粉后 96 h, 这些部位的 t2Z 显著减少。刚授粉时珠孔
与助细胞内 IAA、GA 7ö4、(+ )ABA 较少; 授粉后 96 h, 除退化助细胞与宿存助细胞内 GA 7ö4较
多外, 其它部位的这些激素仍较少。根据这些结果, 讨论了雌蕊内这 4 类植物激素的分布特点
和花粉管定向生长的关系。
关键词　雌蕊, 花粉管生长, 植物激素, 免疫金电镜观察, 烟草
近年的研究揭示出花粉管在雌蕊中定向生长的可能机理〔1〕。与花粉粒直径相当的乳胶珠粒可在花
柱引导组织内向子房移动, 其移动速率与花粉管生长速率相当〔2〕。花柱组织内一种类玻璃粘连蛋白 (vit2
ronectin2like p ro tein)可能是花粉管生长所需的一种驱动分子〔3〕。烟草引导组织中特异的糖蛋白分子呈
梯度分布, 可引导花粉管生长〔4〕。拟南芥胚珠突变体实验显示胚囊内存在吸引花粉管的特异因子〔5〕。这
些结果启发人们多方面探索雌蕊内特异的调节因子。
早期的证据已初步显示雌蕊内的生长素可能与花粉管定向生长有关〔6〕。但由于激素定位技术上的
限制, 迄今尚未获得雌蕊内花粉管生长途径中生长素与其他植物激素分布的直接证据。我们用免疫金电
镜方法对烟草花柱、珠孔及助细胞内的玉米素 ( t2Z)、吲哚乙酸 ( IAA )、赤霉素 (GA 7、GA 4) 及脱落酸
〔(+ )ABA 〕分布状况进行了探查, 并讨论它们与花粉管生长的相关性。
1　材料和方法
材料为大叶烟 (N icotiana tabacum var. m acrop hy lla)刚授粉及授粉后 24 h 时的花柱中段 (3 mm )、刚Ξ 收稿日: 1998210230, 修回日: 1999202227。第一作者: 男, 1965 年出生, 博士后, 从事植物激素的细胞生物学与分子生物学研究。国家自然科学基金资助的课题 (39730260)。
授粉及授粉后 96 h 时的胚珠。花柱切成 1 mm 小段, 参照文献〔7, 8〕的方法制备透射电镜样品和进行免
疫细胞化学反应。一部分材料用 2% EDC〔12乙基 32(32二甲氨丙基) 碳二亚胺〕室温下抽气固定 2 h 后,
转入 4% 多聚甲醛与 1% 戊二醛, 室温抽气 2 h 并于 4℃过夜; 再以 015% 锇酸处理 30 m in, 常规乙醇脱
水, 环氧丙烷过渡, Epon812 包埋, 此部分样品用于酸性激素定位。另一部分材料除省去 EDC 外, 其余制
样步骤不变, 用于玉米素定位。前人研究〔8～ 10〕表明醛试剂主要固定细胞分裂素中的游离碱基形式。在
M T 6000 型超薄切片机上切片, 捞在覆有 Fo rm var 膜的镍网上, 载片镍网经 10% H 2O 2 蚀刻 10 m in, 阻
断液 (012 mo löL 甘氨酸、2% 鸡卵清蛋白溶于 PBST 液, pH 712) 阻断 20 m in (PBST 液组成: 10 mmo löL
磷酸钠缓冲液, 0115 mo löL N aC l, 0102% Tw een220, 0102% N aN 3, pH 712) ; 在免抗 t2Z 多克隆抗体液滴
( 1∶1 500, PBST 稀释, 并含 1% BSA ) 上 30℃温育 3 h, 或在免抗 IAA 多克隆抗体、鼠抗 GA 7ö4, (+ )
ABA 单克隆抗体液滴 (分别为 1∶400, 1∶25 000, 1∶12 000, PBST 稀释, 并含 1% BSA ) 上 30℃温育 4
h, PBST 洗涤后在金标A 蛋白 (识别多克隆抗体) 或金标羊抗鼠抗体 (识别单克隆抗体) 液滴 (1∶40,
PBST 稀释, 并含 1% BSA ) 上 30℃温育 60 或 70 m in, 充分洗涤后醋酸铀与柠檬酸铅双染, 在 JEM
100öÊ 型透射电镜上观察与摄影。设置 3 个阴性对照: ①省去 4 种特异识别激素的抗体; ②用正常免血
清代替兔抗 t2Z 及 IAA 多克隆抗体; ③预先用 2 mmo löL t2Z、1 mmo löL IAA 甲酯、1 mmo löL GA 4 甲
酯、115 mmo löL (+ )ABA 甲酯与相应的抗体 37℃温育 2 h, 其余步骤不变。
10 nm 胶体金及金标A 蛋白与金标羊抗鼠抗体的制备按文献〔11〕的方法进行。
特异识别 t2Z、IAA 甲酯、GA 7ö4甲酯、(+ )ABA 甲酯的抗体制备方法及抗体质量参数见文献〔12～ 15〕。
2　结果
2. 1　花柱
发育完全的大叶烟花柱全长约 318 cm。中段花柱引导组织及薄壁组织细胞的超微结构与前人的报
道〔16〕一致。两种组织的细胞存在明显差异, 即横切面上引导组织细胞较小, 胞间基质层较厚, 细胞质较
浓, 液泡多位于细胞中央, 富含粗糙内质网、线粒体、淀粉体或质体; 而薄壁细胞较大, 胞间基质层较薄,
细胞质较稀, 胞内大部分空间被液泡占据, 细胞器较少。
刚授粉时, 引导组织胞间基质、细胞壁、质膜、细胞质中有较多 t2Z (图版É: 1) ; 薄壁组织细胞壁上有
一些 t2Z, 细胞质中则较多, 与引导组织细胞质中无明显差异。授粉 24 h 后, 引导组织与薄壁组织的胞间
基质、细胞壁及细胞内 t2Z 均明显减少 (图版É: 2)。此时已见花粉管穿过花柱中段引导组织 (图版É: 5, 图
版Ê: 11)。
刚授粉时, 引导组织与薄壁组织的胞间基质、细胞壁与细胞内 IAA 均较少 (图版É: 3, 4)。授粉 24 h
后, 引导组织胞间基质与细胞质基质内 IAA 略增加 (图版É: 5) , 淀粉体中有增多的 IAA (图版É: 6) ; 薄壁
组织胞间基质、细胞壁、液泡及淀粉体上 IAA 明显增加 (图版É: 7, 8)。花粉管壁有 IAA 分布 (图版É: 5)。
刚授粉时, 引导组织胞间基质、细胞壁、细胞核、胞质基质及液泡中均有一些 GA 7 与 GA 4 分布, 但不
多 (图版É: 9) ; 授粉 24 h 后, 引导组织胞间基质、细胞壁及淀粉中 GA 7 与 GA 4 明显增多 (图版Ê: 10) , 淀
粉体上这种增加尤为明显, 其他部位 (液泡与细胞核)内 GA 7 与 GA 4 的分布密度与刚授粉时相近。而授
粉前后薄壁组织内 GA 7 与 GA 4 均较少。
授粉前后引导组织与薄壁组织的各个部位 (+ )ABA 均较少或极少, 花粉管厚壁内有少量 (+ )ABA
(图版Ê: 11)。
2. 2　珠孔与助细胞
刚授粉时, 珠孔、胚囊壁、助细胞内有较多的 t2Z, 丝状器中则存在大量 t2Z (图版Ê: 12、14, 图版Ë:
16) , 并且总体上 2 个助细胞之间 t2Z 分布水平存在差异 (图版Ê: 14、15)。授粉 96 h 后, 助细胞、胚囊壁及
珠孔内 t2Z 均较少 (图版Ê: 13)。
892 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17 卷　
刚授粉时, 珠孔、胚囊壁、助细胞内 GA 7 与 GA 4, (+ )ABA 及 IAA 均不多或很少 (图版Ê: 18～ 21)。
授粉 96 h 后, 退化助细胞与宿存助细胞内 GA 7 与 GA 4 较多, IAA、(+ )ABA 仍然不多, 其他部位这 3 类
激素仍然较少。
2. 3　阴性对照
针对多克隆抗体 (识别 t2Z 或 IAA ) 设定了 3 个阴性对照, 针对单克隆抗体〔识别 (+ )ABA 或 GA 7
与 GA 4〕设定 2 个阴性对照。在所有激素的阴性对照中, 省去抗体或用正常兔血清替代多克隆抗体后, 花
柱、珠孔、助细胞等处几无金标记, 用过量的 t2Z、GA 4 甲酯、IAA 甲酯及 (+ )ABA 甲酯预先封闭各自特
异抗体的抗原结合部位后, 切片上金标记极少 (图版Ë: 17) , 表明上述定位检测结果的真实性
3　讨论
在实验中, 用免疫电镜法对雌蕊内花粉管生长途径及其周围细胞内 4 类植物激素的分布情况进行
观察与比较。根据初步实验结果, 提示花粉管生长途径及其周围细胞内的植物激素, 可能与花粉管定向
生长存在一定的相关性。具体可能包括以下几种情况:
(1) 由于位置关系, 花粉管生长途径中的 t2Z 与GA 7ö4可能与花粉管生长有着一定联系。这 2 类激素
的分布水平随着授粉进程而变化, 在变化方式上 2 类激素之间存在差异。花粉管生长途径的各个部分
(特别是丝状器)中的 t2Z 在花粉管到达之前保持较高水平, 穿过之后显著减少。丝状器内异常高的 t2Z
分布及其与授粉进程相协调的变化是否提示 t2Z 对花粉管生长起着引导作用, 值得今后进一步研究。花
柱内的花粉管生长途径中, GA 7 与 GA 4 在花粉管穿过之后增加。花粉管可能通过分泌 GA 并运输到助
细胞, 诱导后者退化〔6〕, 从而吸引花粉管向胚囊生长。花柱引导组织胞间基质内存在各种囊泡, 其内的植
物激素 (图版É: 4、9, 图版Ê: 11)可能也有某种生理功能。
(2)花柱引导组织细胞与薄壁细胞内的 IAA、GA 7ö4可能与花粉管生长的营养供应有着一定联系。曾
经推测, GA 4 活化淀粉酶为花粉管生长提供碳源〔6〕, 本文揭示的淀粉体上存在 GA 7ö4与 IAA 为此提供了
一定证据。液泡内的 IAA 可能还调节其他水解酶的活性。
(3) 番茄根冠细胞质外体 (包括细胞壁、粘液层) 中分布较多的ABA〔17〕, 而烟草花粉管生长途径中
ABA 分布水平较低, 说明质外体内ABA 水平存在组织差异性。这可能反映了ABA 功能上的差异, 前者
可能与根对环境刺激的反应有关〔17〕, 而后者可能与花粉管生长相适应。离体萌发试验表明, 外源ABA
抑制烟草花粉萌发〔18〕。已知ABA 能拮抗 GA 4 对淀粉酶的活化作用, 因而, 淀粉体上ABA 较少从另一个
侧面反映淀粉体的水解作用加强。
致谢　感谢武汉大学分析测试中心钟桂荣、黄大千先生在电镜观察技术上给予热情帮助。
参 考 文 献
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IMM UNOGOLD EL ECTRON M ICROSCOP IC
OBSERVATIONS ON D ISTR IBUTION OF SEVERAL
PHY TOHORMONES IN POLL EN TUBE GROW TH
TRACK THROUGH P ISTIL IN TOBACCO
Chen Y ifeng　L iang Sh ip ing　Yang Hongyuan
(R esearch Cen ter f or D evelopm en ta l B iology , Colleg e of L if e S ciences,W uhan U niversity　W uhan　430072)
Zhou X ie
(D ep artm en t of A g ronomy , N anj ing A g ricu ltu ra l U n iversity　N anjing　210095)
Abstract　U p to now , lit t le is know n about distribu tion and function of phytoho rmones in the po llen
tube grow th track th rough p ist ils. D istribu tion of trans2zeatin ( t2Z) , indele232acetic acid ( IAA ) , gib2
berellins A 7 and A 4 (GA 7ö4) , and (+ ) abscisic acid 〔(+ )ABA 〕in the style,m icropyle and synergids of
N icotiana tabacum var. m acrop hy lla w ere observed w ith imm unogo ld electron m icro scopy. Segm ents
from m iddle part of the styles and ovules at various stages at and after po llination w ere fixed w ith 2%
EDC 〔12ethyl232(32dim ethyl am inop ropyl) carbodiim ide〕and m ixed parafo rm aldehyde and glu taralde2
hyde fo r acidic phytoho rmones (o r on ly w ith the la t ter fo r t2Z) , then stigh tly po stfixed in 0. 5% O SO 4
003 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17 卷　
so lu tion fo r 30 m in. A fter dehydration, samp les w ere em bedded in Epon 812 resin. Fo llow ing etched in
10% H 2O 2 fo r 10 m in, u ltra th in sections w ere imm uno sta ined respectively w ith rabb it an ti2t2Z po lyclonal
an tibody (PA b) , an ti2IAA m ethyl ester PA b, mouse an ti2GA monoclonal an tibody (M A b, specifically
recogn izes m ethyl esters of GA 7 and GA 4) , o r an ti2(+ )ABA m ethyl ester M A b. P ro tein A co llo idal go ld
(5 10 nm ) w as used as a m arker fo r rabb it PA bs w h ile sheep an ti2mouse lgG2co llo idal go ld (5 10 nm ) fo r
mouse M A b. A t po llination p len ty of t2Z but a few IAA and GA 7ö4 w ere observed in cells and in tercellu2
lar m atrix of the transm itt ing tissue. O ne day after po llination, w hen po llen tubes had penetra ted the
transm itt ing tissue, the go ld granu les of t2Z rem arkab ly decreased, bu t tho se of IAA sligh tly increased;
and tho se of GA 7ö4 obviously increased in the sam e region. IAA in cells and in tercellu lar m atrix of stylar
parenchym a greatly increased from just a t po llination to one day after po llination. Increased IAA and
GA 7ö4 w ere m ain ly localized in am ylop lasts, vacuo les and in tercellu lar m atrix. IAA appeared in the w alls
of po llen tubes passing the transm itt ing tissue. H igh level of t2Z in them icropyle and the synergids (par2
t icu larly abundan t t2Z in the filifrom apparatus) greatly decreased from just a t po llination to 4 days after
po llination. GA 7ö4 w ere less in the synergids at po llination bu t increased in bo th the degenerate and per2
sisten t synergids 4 days after po llination. GA 7ö4 and IAA in the m icropyle o r IAA in the synergids m ain2
ta ined at low er levels 4 days after po llination. (+ )ABA in the po llen tube grow th track w as rarely ob2
served during the w ho le course. A cco rding to the resu lts, the rela t ionsh ip of the distribu tion mode of
these four phytoho rmones in tobacco p ist il w ith po llen tube gu idance is discussed.
Key words　P ist il, Po llen tube grow th, Phytoho rmones, Imm unogo ld electron m icro scopy, N icotiana
tabacum var. m acrop hy lla
图 版 说 明
a. 淀粉体; D S. 退化助细胞; er. 内质网; F. 丝状器; I. 珠被; im. 胞间基质; IT. 珠被绒毡层; m. 线粒体; mp. 珠孔;
PS. 宿存助细胞; p t. 花粉管; Sy. 助细胞; v. 液泡; ve. 小泡; w. 细胞壁
图 1～ 11 为花柱中段横切面, 图 12～ 21 为胚珠纵切面。箭头示金粒。
图 版 É
11 刚授粉时的引导组织, 示胞间基质中较多的玉米素 (t2Z) (×28 100) ; 21 授粉后 1 d 的引导组织 (此时花粉管已穿
过) , 示胞间基质 t2Z 很少 (×28 100) ; 31 刚授粉时的薄壁组织, 示胞间基质及细胞内吲哚乙酸 (IAA ) 很少 (×28 100) ;
41 刚授粉时的引导组织部分, 示胞间基质与细胞内 IAA 较少 (×28 100) ; 51 授粉后 1 d 的引导组织部分, 示胞间基质
内 IAA 略增加。花粉管壁由果胶纤维素外层与胼胝质内层组成, IAA 出现在内层上 (×28 100) ; 61 授粉后 1 d 的引导
组织细胞, 示淀粉体上有一些 IAA (×28 100) ; 71 授粉后 1 d 的薄壁组织, 示细胞质基质、液泡、淀粉体、壁及胞间基质
中较多的 IAA (×28 100) ; 81 授粉后 1 d 薄壁细胞的大液泡内分布 IAA (×28 100) ; 91 刚授粉时的引导组织, 示细胞
质、胞间基质有一些赤霉素 (GA 7 与 GA 4) (×28 100)
图 版 Ê
101 授粉后 1 d 的引导组织, 示淀粉体、胞间基质、壁、近壁细胞质基质内GA 7 与GA 4 明显增加 (×28 100) ; 111 授粉后
1 d 引导组织, 示胞间基质内脱落酸〔(+ )ABA 〕很少。花粉管壁中有少量 (+ )ABA (×28 100) ; 121 刚授粉时的助细
胞, 示丝状器内大量的 t2Z (×28 100) ; 131 授粉后 4 d 的胚囊珠孔端, 示助细胞、胚囊壁、珠被绒毡层细胞及珠孔内的
t2Z 很少 (×32 000) ; 141 刚授粉时的 1 个助细胞, 其内 t2Z 较多 (×32 000) ; 151 刚授粉时的另 1 个助细胞 (与图 14 中
的助细胞位于同一胚囊内) , 其内 t2Z 不多 (×28 100)
图 版 Ë
161 刚授粉时的胚囊珠孔端, 示丝状器、胚囊壁内 t2Z 较多 (×28 100) ; 171 阴性对照, 用 2 mmo löL t2Z 预饱和抗 t2Z 多
103　第 4 期　　　　　　陈以峰等: 烟草雌蕊的花粉管生长途径中几种植物激素的免疫金电镜观察
克隆抗体后, 刚授粉时珠孔端胚囊壁上金粒极少 (×28 100) ; 181 刚授粉时珠孔内端部分 GA 7 与 GA 4 很少 (×
28 100) ; 191 刚授粉时 1 个助细胞珠孔端, 示助细胞和壁内GA 7 与 GA 4 较少 (×32 000) ; 201 刚授粉时珠孔内端, 示珠
孔基质及助细胞内 (+ )ABA 较少 (×28 100) ; 211 刚授粉时珠孔内端, 示珠孔开口部位有一些 IAA , 但闭合部位及助
细胞内 IAA 很少 (×28 100)
Explanation of Plates
a1Am ylop last; D S1D egenerate synergid; er1Endop lasm ic reticu lum; F1filam en t; I1 In tegum ent; im 1 In tercellu lar m atrix;
IT 1 In tegum ental tapetum; m 1M itochondrium; mp1M icropyle; PS1Persisten t synergid; p t1Po llen tube; Sy1Synergid;
v1V acuo le; ve1V esicle; w 1Cell w all
T ransections of the m iddle part of styles (F igs. 1～ 11) and longisections of ovu les (F igs. 12～ 21) in tobacco.
Som e of go ld granu les are indicated w ith arrow heads
P late É
1. T ransm itt ing tissue at po llination, show ing p len ty of transzeation ( t2Z) in its in tercellu lar m atrix (×28 100) ; 2.
T ransm itt ing tissue 1 day after po llination w hen po llen tubes had penetrated the region, show ing few t2Z in its in tercel2
lu lar m atrix (×28 100) ; 3. Parenchym a at po llination, show ing few indo leacetic acid ( IAA ) in its cells and in tercellu lar
m atrix (×28 100) ; 4. T ransm itt ing tissue at po llination, show ing a few IAA in its in tercellu lar m atrix and cells (×
28 100) ; 5. T ransm itt ing tissue 1 day after po llination, show ing sligh t increase of IAA in its in tercellu lar m atrix. T he
po llen tube w all is compo sed of an ou ter pectocellu lo sic layer and an inner callo sic layer. IAA appeared at the callo sic
layer (×28 100) ; 6. T ransm itt ing tissue 1 day after po llination, show ing som e IAA in an am ylop last (×28 100) ; 7.
Parenchym a 1 day after po llination, show ing p len ty of IAA in its cytop lasm ic m atrix, vacuo le, am ylop last, cell w all and
in tercellu lar m atrix (×28 100) ; 8. L arge vacuo le of a parenchym atous cell 1 day after po llination, show ing IAA distri2
bu tion (×28 100) ; 9. T ransm itt ing tissue at po llination, show ing som e gibberellin s (GA 7ö4) in the cytop lasm and in ter2
cellu lar m atrix (×28 100)
P late Ê
10. T ransm itt ing tissue 1 day after po llination, show ing an obvious increase of GA 7ö4 in its in tercellu lar m atrix, cell
w all, cytop lasm ic m atrix adjacen t to cell w all and am ylop lasts (×28 100) ; 11. T ransm itt ing tissue 1 day after po llina2
t ion, show ing few (+ ) abscisic acid 〔(+ )ABA 〕in the in tercellu lar m atrix. N o te a few (+ )ABA localized in the cal2
lo sic layer of a po llen tube w all (×28 100) ; 12. F ilifo rm apparatus at po llination, show ing abundan t t2Z in it (×
28 100) ; 13. M icropylar region of em bryo sac 4 days after po llination, show ing few t2Z in degenerate and persisten t
synergids, em bryo sac w all, in tegum ent tapetum cells and inner m icropyle (×32 000) ; 14. A synergid at po llination,
show ing abundan t t2Z in its tochondria, vacuo les, endop lasm ic reticu lum and cytop lasm ic m atrix (×32 000) ; 15. A no th2
er synergid of the sam e em bryo sac as in F ig. 14, show ing less t2Z compared w ith its sister synergid (×28 100)
P late Ë
16. M icropylar region of em bryo sac at po llination, show ing p len ty of t2Z in the filifo rm apparatus and em bryo sac w all
(×28 100) ; 17. N egative con tro l, show ing very few go ld granu les in the em bryo sac w all at m icropylar end at po llina2
t ion w hen an ti2t2Z po lyclonal an tibody w as p resatu red w ith 2 mmo löL t2Z (×28 100) ; 18. Inner po rtion of m icropyle at
po llination, show ing few GA 7ö4 in it (×28 100) ; 19. M icropylar end of a synergid at po llination, show ing a few GA 7ö4 in
the em bryo sac w all and synergid (×32 000) ; 20. Inner po rtion of m icropyle at po llination, show ing a few (+ )ABA in
the m icropylar m atrix and synergid (×28 100) ; 21. Inner po rtion of m icropyle at po llination, show ing som e IAA in its
open part of m icropyle bu t few in its clo sed part and in the synergid (×28 100)
203 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17 卷