全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(6): 1011−1019 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31071802, 31000908), 重庆市自然科学基金重点项目(2011BA1002), 中央高校基本科研业务费专项
(XDJK2012B020)和国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2012CB113900)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 王小佳, E-mail: wxj@swu.edu.cn; 宋明, E-mail: swausongm@163.com, Tel: 023-68251093
第一作者联系方式: E-mail: xujunqiang101@163.com
Received(收稿日期): 2013-07-01; Accepted(接受日期): 2014-03-04; Published online(网络出版日期): 2014-04-08.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140408.0852.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01011
结球甘蓝雌蕊发育调控因子 SPT与 HEC1的基因克隆及相互作用
许俊强 孙梓健 刘智宇 杨朴丽 汤青林 王志敏 宋 明* 王小佳*
西南大学园艺园林学院 / 南方山地园艺学教育部重点实验室 / 重庆市蔬菜学重点实验室, 重庆 400715
摘 要: 为研究 SPT 和 HEC 及其相互作用对甘蓝雌蕊发育的影响, 以结球甘蓝自交不亲和系 E1 为材料, 提取雌蕊
总 RNA, 根据拟南芥中 SPT和 HEC1基因设计引物, 采用同源克隆方法克隆 SPT基因, 其序列 1085 bp, 开放阅读框
(ORF) 1062 bp; HEC1基因 ORF 696 bp。通过 cDNA推导得到的氨基酸序列表明, SPT编码 353个氨基酸残基, 预测
分子量为 37.67 kD, pI为 6.83; HEC1编码 231个氨基酸残基, 预测分子量为 25.26 kD, pI为 10.2。两基因在各器官中
均表达, 但 SPT在果实和雌蕊中表达量最高, 而 HEC1在根和花蕾中的表达量最高。为检测两者的相互作用, 构建原
核表达质粒 pCold I-SPT和 pGEX-HEC1, pull-down试验表明两蛋白能够在体外相互作用。同时构建 pGBKT7-SPT、
pGADT7-HEC1及互换载体 pGBKT7-HEC1和 pGADT7-SPT酵母表达载体, 分别转化酵母 Y2HGold和 Y187感受态
细胞后均未出现自激活和毒性现象, 融合后的二倍体酵母均能在 SD/–Trp–Leu–Ade–His/X-α-gal/AbA 板上长出蓝色
菌斑, 表明 SPT和 HEC1能够相互作用激活下游的 HIS3、AUR1-C、MEL1和 ADE2报告基因, 酵母双杂交试验结果
与 Pull-down检测一致, 说明 SPT和 HEC1能够相互作用以调控雌蕊的发育。
关键词: 结球甘蓝; 雌蕊; SPT; HEC1; 相互作用; 酵母双杂交
Gene Cloning and Interaction between Transcription Factors SPT and HEC1 for
Pistil Development in Brassica oleracea L. var. capitata L.
XU Jun-Qiang, SUN Zi-Jian, LIU Zhi-Yu, YANG Pu-Li, TANG Qing-Lin, WANG Zhi-Min, SONG Ming*,
and WANG Xiao-Jia*
Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions, Ministry of Education / Chongqing Key Laboratory of Olericulture /
College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400715, China
Abstract: To explore interaction of SPT and HECs in cabbage pistil development, we took stigma of self-incompatibility line E1
to obtain total RNA for first-strain cDNA synthesis, and cloned SPT gene fragment with the ORF of 1062 bp and HEC1 gene with
696 bp by using primers according to SPT and HEC1 genes in Arabidopsis. Amino acid sequence analysis showed that SPT and
HEC1 cloned encoded 353 and 231 amino acid residues, respectively. The predicted molecular weight of SPT protein was 37.67
kD, with pI of 6.83; the predicted molecular weight of HEC1 protein was 25.26 kD, with pI of 10.23. Relative expression of SPT
was the highest in the fruit and pistil, that of HEC1 was the highest in the root and bud. Prokaryotic expression plasmids pCold
I-SPT and pGEX-HEC1 were constructed and then transformed into E. coli Rosetta (DE3). The pull-down assay showed that the
two tagged expression products could interact with each other. To verify the interactions furtherly, we constructed yeast expression
vectors pGBKT7-SPT, pGADT7-HEC1, and pGADT7-SPT, pGBKT7-HEC1 to transform into yeast Y2HGold and Y187 strains,
respectively. Finally, diploid yeast showed positive results in SD/–Ade–Trp–Leu–His/X-α-gal/AbA synthetic dropout. It demon-
strated that interaction between SPT and HEC1 can activate HIS3, AUR1-C, and ADE2 reporter genes downstream. Yeast
two-hybrid experimental results as well as the pull-down assay showed that SPT and HEC1 can form heterodimer to regulate the
development of pistil.
Keywords: Brassica oleracea; Pistil; SPT; HEC1; Interaction; Yeast two-hybrid
1012 作 物 学 报 第 40卷


植物雌蕊是种子生产和传播的复杂器官, 它由
心皮、柱头及花柱、胚珠和子房组成。在受精过程
中 ,花粉粒在柱头萌发并向下生长通过柱头和传输
束伸向胚珠。传输束细胞分泌一种复杂的富含酸性
多糖和促进花粉管生长的细胞外基质(ECM), 控制
细胞死亡发育的过程, 传输束分化失败将导致花粉
管生长受限及生育能力降低[1-3]。研究提出了引导花
粉管从柱头到传输束并穿出传输束向胚珠的许多化
学梯度或信号分子机制[4-6]。
雌蕊发育对植物繁殖至关重要, 该过程可能受
到高度调控。包括 SPATULA (SPT)、 STYLISH1
(STY1)、STYLISH2 (STY2)和ETTIN (ETT)等许多基因
在柱头、花柱、隔膜和传输束中的鉴定。SPT编码在
隔膜和柱头发育早期表达的bHLH转录因子。bHLH
蛋白以二聚体的形式结合到DNA识别位点, 大部分
bHLH 蛋 白 识 别 E-box (CANNTG) 或 G-box
(CACGTG)[7]。SPT功能缺失导致隔膜和顶端心皮融
合缺陷、传输束丧失以及柱头组织发育减少[8-9]。STY1
和STY2编码在花柱发育中行使功能的环指蛋白[10-11]。
SPT突变体在sty1突变体上游 , 表明SPT和STY作用
于相同的路径[11]。编码生长素应答因子(ARF)的ETT
基因抑制SPT表达结构域。ett突变体中的传输束组织
在雌蕊外侧发育 , 从ett突变体中消除SPT功能来补
救突变缺陷[9]。SPT最初在拟南芥心皮器官发生上确
定 , 能影响雌蕊形态 [12], 且SPT是心皮边际及衍生
组织发育和增殖必需的[9-12]。此外, 拟南芥SPT在子
叶[13]、叶片[14]、雌蕊[9,12,15]、果实[16-17]、萌发的种子[18]
和根[19]不同器官行使其功能。SPT功能突变导致子
叶增大、下胚轴增长及叶片增大, 而超表达导致器
官变小[13,20-21]、细胞数目或细胞大小的变化表明SPT
调控细胞分化和细胞增殖过程。
Gremski等 [22]在拟南芥中报道的 HECATE1
(HEC1)、HECATE2 (HEC2)和HECATE3 (HEC3)是在
雌蕊发育过程中发挥重要作用3个基因 , 它们编码
具有重叠功能的bHLH转录因子。HEC缺失导致传输
束、隔膜和柱头缺陷及生殖能力降低, hec1突变体中
生殖能力降低, 包括花粉管畸形或减少。HEC基因超
表达导致异常柱头组织的产生和获得性功能表型 ,
表明它们是生长素信号途径组件。hec1突变体中柱
头和花柱都明显发育异常, 柱头明显变小。在酵母
双杂系统中HEC蛋白与SPT可能形成异源二聚体, 表
明这些蛋白很可能在控制发育中相互作用 [15,22]。
Gremski等 [22]对拟南芥研究表明 , SSPT和HEC之间
可能相互作用。SPT比HEC基因在雌蕊发育阶段表达
要早, 所以, SPT是HEC基因表达上游调控因子的这
种可能性是存在的 , 但SPT蛋白并不是HEC表达所
必需的。
目前, 拟南芥SPT和HEC基因的研究有了一定的
进展, 但在芸薹属作物上相对较少。本研究通过结球
甘蓝中SPT和HEC1基因的克隆、表达分析、体外相互
作用检测及酵母双杂交检测, 拟探索2个bHLH转录
因子相互作用机制, 揭示甘蓝雌蕊发育过程。
1 材料与方法
1.1 试验材料
结球甘蓝自交不亲和系E1由重庆市蔬菜学重点
实验室提供。在RXZ型智能人工气候箱中播种, 幼
苗在20℃ 16 h光照/18℃ 8 h黑暗的条件下生长, 成
苗后移至试验田, 经过冬天低温春化。2013年3月取
盛花期自交不亲和系材料于–80℃冻存 , 用于RNA
提取。
1.2 雌蕊 SPT和 HEC1基因的 cDNA克隆
使用TRIzol法提取甘蓝雌蕊总RNA, 根据拟南
芥SPT (NM_119857.2)和HEC1 (NP_201507.1)基因序
列设计PCR扩增引物SPT-F/SPT-R和HEC1-F/HEC1-R
(表1)用于cDNA序列的扩增 , RT-PCR扩增体系为 :
ddH2O 15.4 μL, 10×PCR缓冲液2.5 μL, 2 mmol L–1
dNTPs 2.5 μL, 25 mmol L–1 MgSO4 1.6 μL, 上下游引
物各1 μL, KOD DNA聚合酶0.5 μL, 模板DNA 0.5 μL。
PCR扩增参数为 94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 54℃ 30 s,
72℃ 30 s; 38个循环。回收目的片段, 分别连接到
pEASY-Bluntsimple克隆载体, 转化 E. coli JM109感
受态细胞, 经蓝白斑筛选后, 挑取阳性克隆酶切鉴定
并测序, 分别命名为 pB-SPT和 pB-HEC1。
1.3 结球甘蓝 SPT与 HEC1基因表达分析
分别采取结球甘蓝根、茎、叶、花蕾、花药、
雌蕊和果荚样本, 提取总 RNA, 反转录 cDNA。采用
Livak Method (2–ΔΔCt)在 C1000 Thermal Cycler (Bio-
Rad)上进行实时荧光定量 RT-PCR。以 β-Actin 和
Tublin为内参基因(表 1, Actin-F/Actin-R、Tub-F/Tub-
R), SPT和 HEC1基因表达分析引物为 Spt-F/Spt-R、
Hec1-F/Hec1-R (表 1), 使用SsoFastEvaGreen Supermix
(Bio-Rad)配制反应体系, 扩增条件为 95℃ 2 min;
95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 39循环; 72℃ 30 s。每个取样
点设 3个技术重复, 3个生物学重复。
1.4 原核表达载体构建及体外相互作用检测
提取 pB-SPT和 pB-HEC1质粒, pB-SPT和 pCold I
第 6期 许俊强等: 结球甘蓝雌蕊发育调控因子 SPT与 HEC1的基因克隆及相互作用 1013


表 1 试验中使用的引物序列
Table 1 Primers used in this experiment
引物名称
Primer
上游引物
Forward primer (5–3)
下游引物
Reverse primer (5–3)
SPT-F/ SPT-R
HEC1-F/HEC1-R
SPT-YF/SPT-YR
H1-YF/H1-YR
Actin-F/Actin-R
Tub-F/Tub-R
Spt-F/Spt-R
Hec1-F/Hec1-R
GCGCATATGATGGGAGATAAGAAATTGAT
CGCGAATTCATGGATTCTGACATAATGAACA
GCGCATATGATGGGAGATAAGAAATTGATTCC
GCGCATATGATGGATTCTGACATAATGAACAT
CCATCTTGGCATCCCTCAGCAC
TATCAACTACCAGCCACC
ACAATGAGGAATGGGGTAAAC
CTTACCCTTTTCTGTTCAA
GCGGAATTCTCAAGTAATTCGATCTTTTATG
GCGCTCGAGTCATCTAAGAATCTGTGCATTG
GCGGAATTCTTATGTCAGGTTGTTGCCCATTA
GCGGAATTCTCATCTAAGAATCTGTGCATTGC
CCACCACGAACCAGAAGGCAG
GAACACCTCAGCTACACTC
TGAAGTAAGGAGAGGGAAAGG
TCCTCTTAGGTGGCTTTAC
下画线为酶切位点。Restriction enzyme sites are underlined.

载体质粒经Nde I/EcoR I双酶切后连接, pGEX-4T-1
和pB-HEC1共同使用EcoR I/Xho I双酶切后连接, 将
重组质粒转化大肠杆菌JM109。提取重组质粒并命
名为pCold I-SPT和pGEX-HEC1, 分别双酶切鉴定后
送华大基因公司测序验证。
将重组质粒 pCold I-SPT和 pGEX-HEC1分别转
化表达菌株 E. coli Rosetta (DE3)。挑取单菌落, 接种
于 5 mL含有 50 μg mL–1氨苄青霉素的 LB液体培养
基, 37℃振荡培养过夜。次日, 1∶100扩大培养过夜
培养物按至 OD600为 0.4~0.6时将 pCold I-SPT置 15℃
放置 30 min, 加入终浓度为 0.5 mmol L–1的 IPTG,
分别于 15℃和 30℃振荡培养过夜。收集菌体, 并以
超声波破碎, 按 Mag Extractor-GST-tag-和 Mag Ex-
tractor-His-tag-蛋白纯化试剂盒说明纯化其体外表
达的重组蛋白产物。将纯化得到的 GST标签的融合
蛋白 pGEX-HEC1 加入吸附有 pCold I-SPT 的
Ni-NTA 柱中, 于 4℃避光孵育 2 h, 用 10 倍柱体积
的 MCAC 缓冲液清洗 , 用 2 倍柱体积的洗脱液
(MCAC 缓冲液含 250 mmol L–1咪唑)洗脱, 最后经
SDS-PAGE电泳并分析结果。
1.5 酵母载体的构建及蛋白相互作用检测
1.5.1 SPT与 HEC1相互作用的酵母载体构建
用引物对 SPT-FY/SPT-RY 从 pB-SPT 载体上扩增
SPT 的完整 ORF 序列; 引物对 H1-FY/H1-RY 从
pB-HEC1扩增 HEC1的完整 ORF序列。上下游分别
引入 Nde I、EcoR I酶切位点。
用Nde I和 EcoR I分别对扩增产物 SPT和HEC1
克隆载体质粒及酵母表达质粒 pGBKT7、pGADT7
进行双酶切; 将 SPT 片段与 pGBKT7 连接, 转化 E.
coli JM109感受态细胞, 涂于 LB平板上(含 Kan+抗
性); HEC1片段与 pGADT7连接, 转化 E. coli JM109
感受态细胞, 涂于 LB 平板上(含 Amp+抗性)。同时,
连接互换载体。37℃培养过夜, 筛选阳性重组子, 并
进行菌液 PCR 和酶切鉴定, 将含有插入目的片段的
阳性克隆送华大基因公司测序。将序列正确的重组
质粒分别命名为 pGBKT7-SPT、pGADT7-HEC1 及
pGBKT7-HEC1、pGADT7-SPT。
1.5.2 SPT 与 HEC1 酵母表达质粒毒性检测和自激
活检测 根据 Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid
System User Manual, 利用 LiAc 法制备酵母
Y2HGold 和 Y187 感受态细胞。用 PEG/LiAc 法将
pGBKT7空载体和重组诱饵载体 pGBKT7-SPT同时
转化 Y2HGold酵母感受态细胞, 30℃培养 3~5 d, 观
察其在 SD/–Trp 筛选平板上的生长情况。同样的方
法将 pGADT7 空载体和重组 AD 质粒 pGADT7-
HEC1转化 Y187感受态细胞, 观察其在 SD/–Leu平
板上的生长情况。其他重组质粒按上述方法进行毒
性检测。
用 PEG/LiAc 法将 pGBKT7-SPT转化 Y2HGold
酵母感受态细胞, 分别铺于 SD/–Trp、SD/–Trp/X-α-
gal、 SD/–Trp/X-α-gal/AbA 平板上 ; 将 pGADT7-
HEC1 转化 Y187 感受态细胞, 分别涂于 SD/–Leu、
SD/–Leu/X-α-gal 平板上 , 30℃孵育 3~5 d, 观察
Y2HGold [pGBKT7-SPT]、Y187 [pGADT7-HEC1]在
选择平板上的生长情况。同时设 Y2HGold [pGBKT7-
Lam] × Y187 [pGADT7-T](阴性对照)组和 Y2HGold
[pGBKT7-p53] × Y187 [pGADT7-T](阳性对照)组。其
他重组质粒按上述方法进行自激活检测。
1.5.3 SPT 与 HEC1 蛋白相互作用检测 分别挑
取 SD/–Trp、SD/–Leu平板上的单菌落, 将含有不同
基因片段的 Y2HGold 转化菌落与含有不同基因的
Y187转化菌落两两组合, 同时接种于 2 × YPDA液
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体(500 μL)培养基中, 30℃振荡培养 18~20 h, 在显微
镜下检测 Y2HGold与 Y187形成二倍体的情况; 并设
Y2HGold [pGBKT7-Lam] × Y187 [pGADT7-T] (阴性
对照)组和Y2HGold [pGBKT7-p53] × Y187 [pGADT7-T]
(阳性对照)组。然后将融合菌液涂布到 SD/–Trp–Leu、
SD/–Trp–Leu/X-α-gal/AbA 平板上, 30℃培养; 最后将
平板上的蓝色克隆画线至 SD/–Trp–Leu–Ade–His/X-
α-gal/AbA板, 观察其生长情况。
2 结果与分析
2.1 结球甘蓝 SPT和 HEC1基因的克隆
提取雌蕊总RNA反转录成cDNA, 克隆到SPT基
因cDNA序列, 其全长1085 bp, 开放阅读框1062 bp,
GC含量54.37%, 根据其cDNA序列推导得到SPT蛋
白共353个氨基酸残基, 预测分子量为37.67 kD, 等
电点为6.83。HEC1基因cDNA序列, 完整开放阅读
框696 bp, 编码231个氨基酸残基 , 预测分子量为
25.26 kD, 等电点为10.23。
2.2 甘蓝 SPT和 HEC1序列分析
通过 SignalP分析(http://genome.cbs.dtu.dk/services/
SignalP-2.0/), 该蛋白不含信号肽 ; TargetP (http://
genome.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)及 PSORT 软件
预测亚细胞定位表明, SPT 蛋白位于细胞核中的可
能性最大, 在其他部位可能性较小, 说明 SPT 蛋白
是一种核蛋白。基因结构在线预测分析(http://smart.
embl-heidelberg.de/)表明, SPT 蛋白具有 bHLH 家族
结构域(图 1), bHLH 结构域位于 173~221 位氨基酸
处, 两亲性螺旋位于(DEISLFLRHII) 34~44 位氨基
酸 , 酸性结构域 (ETDGYDCESEEGVE)位于 139~
152位氨基酸处, 2个核定位信号(KRCR、KRRR)分
别位于 169~172和 182~184处[23]。跨膜域分析表明
(http://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/), 该 蛋
白不含跨膜区 , 且位于膜外。HEC1 蛋白也具有
bHLH 家族结构域, 第 122 位为丙氨酸(图 1), HLH
结构域位于 127~170 位氨基酸处, 不含核定位信号
和信号肽。预测蛋白质的相互作用 (http://string.
embl.de/)发现 SPT 蛋白能与 ALC、IND、RLG2、
HEC1、HEC2、HEC3等共 10个蛋白存在不同程度
的相互作用, 其中与 IND蛋白相互作用的预测值最高,
为 0.872, 与 HEC1蛋白的相互作用预测值为 0.843。

图 1 SPT及 HEC序列 bHLH域序列比对
Fig. 1 Alignment of bHLH domains of SPT and HECs
*: 保守氨基酸, SPT中谷氨酸替代保守的丙氨酸。
*: Conserved amino acid. Glutamate replaces the conserved alanine in SPT.

2.3 甘蓝 SPT和 HEC1.蛋白进化树分析
经 NCBI氨基酸序列比对, SPT属于转录因子超
家族。序列分析结果显示 SPT具有动植物转录因子
特有的 bHLH 结构域。从 NCBI 数据库检索到部分
与 SPT氨基酸序列同源性较高的高等植物蛋白家族
氨基酸序列, 用ClustalX2比对, MEGA5软件构建系
统发生树(图 2)。系统发生树表明结球甘蓝 SPT与拟
南芥 AtSPT (NM_119857)和 AlSPT (XP_002866965)
位于相同进化支上, 与上述两者的同源性最高。而
BoHEC1 与拟南芥 AtHEC1(NP_201507)的同源性最
高(图 2), 与 AtHEC2的同源性也很高。
2.4 甘蓝 SPT与 HEC1基因表达分析
由图 3 可知, 结球甘蓝 SPT 和 HEC1 基因在植
株的多个器官中均表达, 但表达量不尽相同。SPT
在果实和雌蕊中的表达量最高, 叶片中的表达量最
低, 其他组织中的表达量相当, 说明 SPT 在甘蓝的
各个组织器官中均有不同的作用。HEC1 在各个器
官中的表达量差异较大, 在根和花蕾中最高且相近,
在雌蕊中较低, 而在果实和茎中极低。说明两基因
在雌蕊发育中均起一定的调控作用。
2.5 甘蓝 SPT与 HEC1的体外相互作用
2.5.1 SPT 与 HEC1 原核表达构建 得到的表达
质粒 pCold I-SPT和 pGEX-HEC1, 经双酶切分别得
到 1060 bp和 700 bp左右条带(图 4), 测序结果表明,
插入 pCold I 和 pGEX-4T-1 载体的位点和方向完全
正确。
2.5.2 重组蛋白的诱导表达及相互作用检测
图 5 的 SDS-PAGE 结果显示, 有 pCold I-SPT 和
pGEX-HEC1 重组蛋白表达的特异带出现, 分别表
达出 37 kD和 50 kD左右的融合蛋白, 蛋白质相对
第 6期 许俊强等: 结球甘蓝雌蕊发育调控因子 SPT与 HEC1的基因克隆及相互作用 1015


分子量均与预期值相当。表明表达质粒 pCold I-SPT
和 pGEX-HEC1 构建正确, 且融合蛋白在大肠杆菌
中正确表达。采用 TOYOBO Mag Extractor-His-tag-
和Mag Extractor–GST-tag-蛋白纯化试剂盒分别纯化
体外表达的两融合蛋白 pCold I-SPT (图 5, 泳道 5)
和 pGEX-HEC1 (图 5, 泳道 6)。由图 5 (泳道 7~8)结
果可以看出, 两融合蛋白形成异源二聚体, 说明两
者能够在体外进行相互作用。

图 2 SPT和 HEC1进化树分析
Fig. 2 Phylogenetic trees of SPT and HEC1
Bo: 结球甘蓝; At: 拟南芥; Al: 筷子芥; Gm: 大豆; Pp: 碧桃; Fa: 草莓; Sl: 番茄; Vv: 葡萄; Os: 粳稻; Zm: 玉米; Br: 大白菜;
Mt: 蒺藜苜蓿。
Bo: Brassica oleracea; At: Arabidopsis thaliana; Al: Arabidopsis lyrata subsp.; Gl: Glycine max; Pp: Prunus persica; Fa: Fragaria × ananassa;
Sl: Solanum lycopersicum; Vv: Vits vinifera; Os: Oryza sativa japonica Group; Zm: Zea mays; Br: Brassica rape, Mt: Medicago truncatula.

图 3 SPT和 HEC1基因在不同器官中的表达分析
Fig. 3 Relative expressions of SPT and HEC1 genes in different organs of cabbage
R: 根; S: 茎; L: 叶片; B: 花蕾; A: 花药; P: 雌蕊; F: 果实。
R: root; S: stem; L: leaf; B: buds; A: anther; P: pistil; F: fruit.


图 4 重组质粒 pCold I-SPT和 pGEX-HEC1双酶切检测
Fig. 4 Digestion of pCold I-SPT and pGEX-HEC1
A: pCold I-SPT双酶切; B: pGEX-HEC1双酶切。
A: pCold I-SPT digested; B: pGEX-HEC1 digested.

2.6 甘蓝 SPT与 HEC1酵母双杂交相互作用
2.6.1 SPT与 HEC1酵母载体的构建 图 6表明,
通过 SPT-FY/RY和 H1-FY/RY引物对分别从克隆载
体上克隆得到 SPT 和 HEC1 片段, 将各片段分别插
入酵母载体相应酶切位点。图 7 表明 , 重组质粒

图 5 pCold I-SPT和 pGEX-HEC1原核表达产物的体外相互
作用检测
Fig. 5 Interaction between pCold I-SPT and pGEX-HEC1
in vitro
M: 蛋白分子量标准; 1: 未诱导 pGEX-HEC1; 2: 未诱导 pCold
I-SPT; 3: 诱导 pGEX-HEC1融合蛋白; 4: 诱导 pCold I-SPT融合
蛋白; 5: 纯化的 pCold I-SPT融合蛋白; 6: 纯化的 pGEX-HEC1
融合蛋白; 7~8: pET43.1a-SPT融合蛋白与 pET43.1a-HEC1eSRK7
融合蛋白孵育结果。
M: protein standard; 1: pGEX-HEC1 induced without IPTG;
2: pCold I-SPT induced without IPTG; 3: pGEX-HEC1 induced
with IPTG; 4: pCold I-SPT induced without IPTG; 5: purified
6His-tagged pCold I-SPT; 6: purified GST-tagged pCold I-SPT;
7–8: interaction between pGEX-HEC1 and pCold I-SPT.
1016 作 物 学 报 第 40卷



图 6 SPT和 HEC1基因酵母载体片段的扩增
Fig. 6 PCR products of SPT and HEC1 genes
泳道 1和 2分别为 SPT和 HEC1扩增。
Lanes 1 and 2 are amplification of SPT and HEC1, respectively.

图 7 SPT和 HEC1基因酵母表达载体酶切检测
Fig. 7 Yeast expression vector digested by Nde I/EcoR I
1: pGBKT7-SPT; 2: pGADT7-SPT; 3: pGBKT7-HEC1;
4: pGADT7-HEC1双酶切鉴定。
1: pGBKT7-SPT; 2: pGADT7-SPT; 3: pGBKT7-HEC1;
4: pGADT7-HEC1digested by Nde I/EcoR I

pGBKT7-SPT、pGADT7-HEC1和 pGBKT7-HEC1、
pGADT7-SPT 的酶切检测结果与预期一致, 将测序
正确的质粒通过化学转化法转入相应酵母菌株。
2.6.2 融合蛋白的毒性检测与自激活检测 酵母
Y187 (pGADT7-SPT)和 Y187 (pGADT7-HEC1)在单
缺培养基 SD/–Leu 上与对照酵母 Y187 (pGADT7),
在画单线培养 3 d 后观察发现各酵母菌间菌落大小
相似, 可知重组质粒对酵母 Y187没有毒性; 而酵母
Y2HGold (pGBKT7-SPT) 和 Y2HGold (pGBKT7-
HEC1)与对照 Y2HGold (pGBKT7)在单缺培养基
SD/–Trp 上单克隆菌落大小相似, 重组质粒 Y2HGold
(pGBKT7-CaM12)对酵母 Y2HGold无毒性。
在 SD/–Leu 和 SD/–Leu/X-α-gal 固体培养基上,
Y187 (pGADT7-SPT)和 Y187 (pGADT7-HEC1)都能
长出白色菌落, 但在 SD/–Leu/X-α-gal/AbA 和 SD/–
Leu/–Trp培养基上不能生长。在 SD/–Trp和 SD/–Trp/
X-α-gal培养基上, Y2HGold (pGBKT7-SPT)和Y2HGold
(pGBKT7-HEC1)能长出白色菌落, 但在 SD/–Leu/–
Trp和 SD/–Trp/X-α-gal/AbA培养基上都不能生长。
而阳性对照Y187 (pGADT7-T)×Y2HGold (pGBKT7-53)
在 SD/–Leu/X-α-gal/AbA和 SD/–Trp/X-α-gal/AbA培
养基上菌落呈蓝色。在 SD/–Leu/X-α-gal和 SD/–Trp/
X-α-gal 培养基上阴性对照 Y187 (pGADT7-T) ×
Y2HGold (pGBKT7-Lam)都有白色菌落 , 而阴性对
照在 SD/–Leu/X-α-gal/AbA 和 SD/–Trp/X-α-gal/AbA
培养基上都不能生长(表 2)。说明连接至酵母载体的
基因片段在酵母表达载体和对应的酵母菌株中均不
能自主激活MEL1和AUR1-C报告基因, 无自身转录
激活活性。
2.6.3 SPT HEC1 的酵母相互作用 将 Y2HGold
(pGBKT7-SPT)、Y2HGold (pGBKT7)、Y187 (pGADT7)、
Y187 (pGADT7-HEC1)、Y187 (pGADT7-SPT)和 Y2
HGold (pGBKT7-HEC1)按照表 2的组合依次融合为
二倍体酵母。5~11号二倍体酵母在 SD/–Leu/–Trp, 但
除阳性对照以外仅有 9号与 10号组合在 SD/–Ade/–
His/–Leu/–Trp和 SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-α-gal/ AbA
上能够生长并成蓝色(图 8)。由此可推测, 二倍体酵
母 9号与 10号的报告基因 HIS3、AUR1-C、和 ADE2
均被激活, 说明在酵母二倍体中, SPT能与 HEC1发
生相互作用。

图 8 SPT和 HEC1酵母相互作用检测
Fig. 8 Analysis of interactions between SPT and HEC1in yeast
on the SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-α-gal/AbA plate
5: Y2HGold (pGBKT7) × Y187(pGADT7-SPT); 6: Y2HGold
(pGBKT7) × Y187(pGADT7-HEC1); 7: Y187 (pGADT7) ×
Y2HGold (pGBKT7-SPT); 8: Y187(pGADT7) × Y2Hgold
(pGBKT7-HEC1); 9: Y2HGold (pGBKT7-SPT) × Y187
(pGADT7-HEC1); 10: Y2HGold (pGBKT7-HEC1) × Y187
(pGADT7-SPT); 11: Y2HGold (pGBKT7-Lam) × Y187(pGADT-T);
12: Y2HGold (pGBKT7-T53) × Y187 (pGADT-T).
3 讨论
拟南芥 bHLH 蛋白大都可能从与动植物中
Group BbHLH共同的祖先进化而来, 且 basic域含保
守的谷氨酸[24-25], 它位于 bHLH识别序列与 DNA结
合。SPT含有该关键的谷氨酸(图 1), 而 HEC在该处
以丙氨酸代替[22]。缺少该谷氨酸的动物 Group-C 与
Group-B bHLH蛋白用不同的识别位点结合DNA [26-27]。
第 6期 许俊强等: 结球甘蓝雌蕊发育调控因子 SPT与 HEC1的基因克隆及相互作用 1017


表 2 酵母中 SPT与 HEC1相互作用分析
Table 2 Analysis of interaction between SPT and HEC1
编号
No.
菌株(质粒)
Strain (plasmid)
缺陷培养基
Synthetic dropout
菌斑
Bacterial plaque
颜色
Color
1 Y2HGold (pGBKT7-SPT) SD/–Trp 有 Yes 白 White
SD/–Trp/X-α-gal 有 Yes 白 White
SD/–Leu/–Trp 无 No
2 Y187 (pGADT7-HEC1) SD/–Leu 有 Yes 白 White
SD/–Leu/X-α-gal 有 Yes 白 White
SD/–Leu/–Trp 无 No
3 Y187 (pGADT7-SPT) SD/–Leu 有 Yes 白 White
SD/–Leu/X-α-gal 有 Yes 白 White
SD/–Leu/–Trp 无 No
4 Y2HGold (pGBKT7-HEC1) SD/–Leu 有 Yes 白 White
SD/–Leu/X-α-gal 有 Yes 白 White
SD/–Leu/–Trp 无 No
5 Y2HGold (pGBKT7)× SD/–Leu/–Trp 有 Yes 白 White
Y187 (pGADT7-SPT) SD/–Leu/–Trp/AbA 无 No
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp 无 No
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-α-gal/AbA 无 No
6 Y2HGold (pGBKT7)× SD/–Leu/–Trp 有 Yes 白 White
Y187 (pGADT7-HEC1) SD/–Leu/–Trp/AbA 无 No
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp 无 No
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-α-gal/AbA 无 No
7 Y187 (pGADT7)× SD/–Leu/–Trp 有 Yes 白 White
Y2HGold (pGBKT7-SPT) SD/–Leu/–Trp/AbA 无 No
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp 无 No
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-α-Gal/AbA 无 No
8 Y187 (pGADT7)× SD/–Leu/–Trp 有 Yes 白 White
Y2HGold (pGBKT7-HEC1) SD/–Leu/–Trp/AbA 无 No
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp 无 No
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-α-gal/AbA 无 No
9 Y2HGold (pGBKT7-SPT)× SD/–Leu/–Trp 有 Yes 白 White
Y187 (pGADT7-HEC1) SD/–Leu/–Trp/AbA 有 Yes 白 White
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp 有 Yes 白 White
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-α-gal/AbA 有 Yes 蓝 Blue
10 Y2HGold (pGBKT7-HEC1)× SD/–Leu/–Trp 有 Yes 白 White
Y187 (pGADT7-SPT) SD/–Leu/–Trp/AbA 有 Yes 白 White
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp 有 Yes 白 White
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-α-gal/AbA 有 Yes 白 White
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-α-gal/AbA 有 Yes 蓝 Blue
11 Y2HGold (pGBKT7-Lam)× SD/–Leu/–Trp 有 Yes 白 White
Y187 (pGADT-T) SD/–Leu/–Trp/AbA 无 No
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp 无 No
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-α-Gal/AbA 无 No
12 Y2HGold (pGBKT7-T53)× SD/–Leu/–Trp 有 Yes 白 White
Y187 (pGADT-T) SD/–Leu/–Trp/AbA 有 Yes 白 White
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp 有 Yes 白 White
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-α-gal/AbA 有 Yes 蓝 Blue
1018 作 物 学 报 第 40卷


本研究从结球甘蓝雌蕊中克隆得到SPT基因 , 编码
353个氨基酸, 比AtSPT的373个少20个, 但N端含有
典型保守的bHLH结构域, 在SPT氨基酸序列第181位
含有保守的谷氨酸。同时从甘蓝中克隆得到HEC1基
因, 同样属于bHLH家族, 编码231个氨基酸, 拟南芥
中HEC1、HEC2和HEC3分别编码242、232和225氨基
酸[22], 与AtHEC1氨基酸序列比对, C端高度保守性,
而N端的保守性较差, 在88~93、190~193位氨基酸处
分别缺少6个和3个氨基酸, 由于不包含于bHLH结构
域中, 对基因功能可能没有影响, 这种C端不保守序
列可能形成了物种间的多样性。
SPT基因在植物各组织中广泛表达[8]。SPT在萼
片中没有表达, 但在花瓣和雄蕊中有较弱表达。另
外, SPT也在顶端分生组织、幼叶、托叶、茎、维管
组织及侧根中表达。Gremski等[22]研究表明, HEC1
基因在隔膜、传输束和柱头中表达。本研究中SPT
在各种组织中均表达, 且在雌蕊中表达量很高; SPT
在幼叶中表达量高, 可以控制幼叶的大小 [28], 而本
研究的叶片中表达较低 , 可能是SPT在成熟叶中的
作用没有在幼叶中那样明显 , 同样HEC1在柱头中
也表达, 说明其可能参与雌蕊发育调控过程。
Heisler[9]提出, SPT在雌蕊发育的早期表达且比
HEC早 , 因此SPT可能是HEC表达的上游调控子。
Gremski等 [22]研究指出 , 在 spt-2等位基因植株中
HEC仍能够表达 , 说明不需要SPT的激活作用 , 于
是提出两者可能形成异源二聚体, 且验证了其在拟
南芥中的相互作用, 而HEC之间不能形成同源或异
源二聚体。为研究甘蓝SPT和HEC1的相互作用, 构
建了两基因的原核表达载体, 经过蛋白纯化, 通过
Pull-down试验初步检测了两基因可能存在相互作
用。同时本研究构建了两基因的酵母表达载体, 通
过酵母双杂交试验验证了相互作用的可能性, 运用
酵母双杂交技术对SPT-HEC1之间相互作用的检测
发现 , 同时转化 SPT-HEC1的酵母在加入AbA和
X-α-gal的四缺培养基中能够正常生长, 证明它能够
同时激活下游4种报告基因表达 , 表明SPT与HEC1
之间存在相互作用。该结果进一步支持了Gremski
等[22]提出的拟南芥SPT和HEC之间可能存在相互作
用的观点。
SPT和HEC相互作用调控雌蕊器官的发育 , 它
们都可能是生长素调控的靶基因, HEC和SPT形成异
源二聚体, 很可能是生长素调控的靶蛋白, 从而参
与生长素调控途径或生长素极性运输 [9,12,22]。ETT/
ARF3在子房中可能通过介导生长素水平抑制
SPT/HEC的活性, 控制子房大小[9,29-31]。SPT在发育
过程中的表达比HEC更广泛, 且包含了两者的表达
区域[9], SPT和HEC调控某些特定的发育过程, SPT还
可以与其他bHLH蛋白调控某些发育过程。SPT直接
或间接调节生长素运输, SPT功能及器官特定功能的
起源的确切机制需要进一步研究, 而目前对HEC家
族的报道较少, 对其在生物体内的功能研究还要进
一步深化。本研究克隆了甘蓝HEC1基因, 并初步验
证了HEC1与SPT的互作, SPT与HEC家族其他成员
HEC2、HEC3的在甘蓝中的相互作用, 及其对甘蓝发
育调控的功能验证仍需试验研究。
4 结论
克隆得到甘蓝 SPT 和 HEC1 基因完整开放阅读
框, 两蛋白均属于 bHLH 蛋白家族。SPT 和 HEC1
基因均在雌蕊中表达, 调控雌蕊发育过程; SPT 和
HEC1 蛋白能够相互作用, 可能形成异源二聚体共
同调控雌蕊发育。
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