全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(9): 15721578 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(30771372)资助。
通讯作者(Corresponding author): 才宏伟, E-mail: caihw@cau.edu.cn, Tel: 010-62734224
第一作者联系方式: E-mail: fengxunwei_1986@163.com, Tel: 010-62414433
Received(收稿日期): 2014-03-10; Accepted(接受日期): 2014-06-16; Published online(网络出版日期): 2014-07-09.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140709.1533.013.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01572
结缕草 CBF 基因的同源克隆及其转基因拟南芥的抗寒性验证
冯勋伟 1,2 才宏伟 1,
1中国农业大学农学与生物技术学院, 北京 100193; 2国家知识产权局专利局审查协作北京中心, 北京 100190
摘 要: 结缕草是优良的暖季型草坪草之一, 主要用于亚热带和热带地区的草坪种植。抗冷性是结缕草栽培范围的
限制因子。本研究以日本最北部原产的结缕草品系为材料, 根据其他植物的已知的抗寒基因 CBF 序列, 通过同源克
隆的方法获得结缕草中相对应的同源基因 ZjCBF; 根据和其他已报告的 CBF序列的比对结果, 确定 ZjCBF基因属于
CBF转录因子家族基因中 CBF1型基因。利用半定量 PCR和实时定量 PCR分析该基因在寒冷条件下的表达情况, 发
现 ZjCBF基因受冷胁迫的诱导, 在 4℃处理 6 h时表达量最高。在此基础上, 本研究构建了该基因的过表达载体, 并
将其转化到拟南芥中, 通过低温冷处理实验发现, 不论是否经过冷驯化, 转 ZjCBF 基因植株由于 ZjCBF 的过量表达
均比野生型植株抗寒性强。
关键词: 结缕草; 耐寒性; CBF转录因子; 同源克隆; 转基因拟南芥
Cloning of Zoysiagrass CBF Gene and Validation of Cold Tolerance in Trans-
genic Arabidopsis
FENG Xun-Wei1,2 and CAI Hong-Wei1,
1 College of Agriculture and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 2 Patent Examination Cooperation Center of the
Patent Office, SIPO, Beijing 100190, China
Abstract: Zoysiagrass is recognized as an excellent warm-season turfgrass and mainly used in subtropical and tropical regions.
Cold stress is a major constraint factor for the cultivation of zoysiagrass. In this study, according to the sequences of cold tolerance
gene CBF had been reported in other plant species, we cloned the corresponding homologous of the ZjCBF gene by homology
cloning method in Zoysia japonica using a material originated from the most northern area of Japan. Based on the alignment re-
sults compared with other reported CBF genes, we found the ZjCBF gene belongs to the CBF1 familiy. By semi-quantitative PCR
and real-time quantitative PCR, we analyzed the expression level of the ZjCBF gene in the cold condition and found that ZjCBF
was induced by cold stress, and the ZjCBF expression reached peak at six hours post 4°C treatment. In addition, we also con-
structed ZjCBF over expression vector and generated transgenic Arabidopsis plants, with better cold tolerance than the wild-type,
whether through cold acclimation or not.
Keywords: Zoysiagrass; Cold tolerance; CBF transcription factor; Homologous cloning; Transgenic Arabidopsis
结缕草又名老虎皮、锥子草、崂山草、延地青,
属禾本科, 结缕草属(Zoysia)。该属包括大约11个种,
其中, 日本结缕草(Z. japonica)、沟叶结缕草(Z. ma-
trella)、细叶结缕草(Z. tenuifolia)是公认的优质暖季
型草坪草种, 主要应用于亚热带和温带地区。结缕
草喜温暖湿润气候, 低温是影响结缕草分布、坪用
性状和推广应用的一个重要的限制因素。尤其是沟
叶结缕草和细叶结缕草, 在环境温度低于10℃时结
缕草就进入休眠, 在北方地区每年的绿色期平均只
有6个月左右 , 一些亚热带原产的结缕草在过于低
温的情况下则不能越冬, 以至于发生冻死现象, 严
重限制了其在北方地区的推广应用。
利用转基因技术将抗寒基因导入植物栽培种 ,
已成为提高植物抗寒性的快速有效手段; 但植物抗
寒性是多基因控制的性状, 大多数情况需要一系列
相关基因的共同表达才能提高植物的抗寒性, 这是
第 9期 冯勋伟等: 结缕草 CBF基因的同源克隆及其转基因拟南芥的抗寒性验证 1573
因为植物在遭受冷胁迫时, 从接收低温信号到引起
生理生化反应, 再到调节基因表达, 最后产生抗寒
能力 , 存在一个复杂的信号传导系统 [1], 这其中低
温信号转录因子的作用尤为关键, 它可以诱导下游
多个抗寒基因的表达从而提高植物的抗寒性, 所以
在作物抗寒育种中转入该类基因比转入单个抗寒基
因的应用前景更为广阔, 目前, 低温信号转录因子
中被研究最多的就是CBF转录因子。
1997年, Stocking等[2]首次从拟南芥中分离鉴定
出一种编码转录因子的cDNA, 这种转录因子能与
DRE/CRT顺式作用元件结合 , 因此被命名为CBF1
(C-repeat binding factor 1)。将CBF1基因转入未经冷
驯化的拟南芥中, 大量表达后能诱导冷诱导基因在
常温下表达, 增强了拟南芥的抗寒能力; 后来人们
发现, 拟南芥CBF1基因属于一个包括CBF1、CBF2、
CBF3、CBF4、CBF5和CBF6基因在内的小基因家族;
其中CBF1、CBF2和CBF3基因是受低温诱导表达且
不依赖ABA的信号转导途径, 而CBF4基因是干旱诱
导表达和依赖ABA信号转导途径, CBF5、CBF6基因
则不受低温调控[3-4]。除了模式植物拟南芥之外, 人
们也从玉米、水稻、小麦、大麦、黑麦、油菜等植
物中克隆了许多类CBF基因 , 这些类CBF基因绝大
多数都与植物的逆境胁迫相关[5-9]。
本研究以日本最北部原产的结缕草品系作为材
料 , 根据已知的抗寒基因CBF, 通过同源克隆的方
法得到在结缕草中相对应的同源基因ZjCBF, 分析
该基因在寒冷条件下的表达情况, 并将其构建到超
表达载体上转化拟南芥 , 验证其是否与抗寒相关 ,
为结缕草的抗寒性分子育种奠定技术基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
同源克隆采用结缕草为日本北海道地区的耐寒
生态型室兰(Murorann); 日本九州地区的不耐寒生
俵态型 山北 (Tawarayamakita); 转基因用拟南芥为
Columbia生态型。
1.2 主要试剂
TRIzol RNA 提取试剂盒购自 Invitrogen 公司,
反转录酶购自 Promega公司; RACE试剂盒、限制性
内切酶购自 TaKaRa公司; 农杆菌 GV3101感受态细
胞由清华大学刘玉乐教授实验室提供 ; 庆大霉素
(Gentamycin)、卡那霉素 (Kanamycin)、利福平
(Rifampicin)和潮霉素(Hygromycin)购自生工生物工
程(上海)有限公司; 试验中使用的各种引物由北京
奥科生物技术公司合成; 各种序列由北京华大基因
研究中心测序。
1.3 ZjCBF基因的克隆
首先 , 根据http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上已经
发表的拟南芥、水稻、小麦、大麦、黑麦、玉米等
几种植物CBF转录因子的氨基酸序列中高度保守的
AP2/EREBP结构域设计 1对简并引物 : Midcbf-F:
5-GARACNMGNCAYCCNGTNTA-3; Midcbf-R: 5-
NGCRAARTTNARRCANGC-3, 然后按照Rogers和
Bendich[10]提出的CTAB法 (cetyltriethyl ammonium
bromide)提取DNA, 以结缕草基因组DNA为模板进
行PCR, 扩增得到中间片段, PCR扩增程序为95℃预
变性5 min; 95℃变性30 s, 55℃复性30 s, 72℃延伸1
min, 35次循环; 72℃延伸10 min。用TaKaRa公司的
pMD18-T vector进行目的片段的克隆 , 并测序; 然
后, 用Invitrogen的TRIzol RNA提取液提取室兰的总
RNA, 反转录获得cDNA, 反应体系含2 μg总RNA,
2 μL oligo(DT)18 (0.5 μg μL–1), 用RNase-free水补至
10 μL; 72℃水浴5 min, 立即置冰浴2 min; 加入
5×M-MLV缓冲液4 μL, 10 mmol L–1 dNTPs 2 μL,
M-MLV反转录酶1 μL, RNase-free水3 μL, 42℃水浴
1.5 h, –20℃保存备用; 接着, 利用TaKaRa的3-Full
RACE Core Set Ver.2.0试剂盒和5-Full RACE Kit试
剂盒获得完整的结缕草CBF基因(ZjCBF)的cDNA片
段 , 3-Full RACE的上游外侧特异引物为3rCBF1:
5-GTC TGC GAG GTG AGG GAG CCC AAC AA-3;
上游内侧特异引物为3rCBF2: 5-CCG CAT CTG
GCT GGG GAC CTT CG-3; 5-Full RACE的下游外
侧特异引物为5rCBF1: 5-TCG AAG GTC CCC AGC
CAG ATG C-3; 下游内侧特异引物为 5rCBF2:
5-GCT CCC TCA CCT CGC AGA CCC A-3。
最后, 在 ZjCBF基因的编码区(从起始密码子开
始到终止密码子结束, 包括终止密码子)设计特异引
物 jyCBF-F: 5-ATG GAG AAC AAC ATG GGC GAC
G-3; jyCBF-R: 5-CTA GTA GCT CCA AAG CTT
GAC CTC-3, 分别以室兰的基因组 DNA 和 cDNA
为模板进行 PCR 扩增 , 扩增程序为 95℃预变性
5 min; 95℃变性 30 s, 55℃复性 30 s, 72℃延伸 1 min,
35次循环; 72℃充分延伸 10 min, 用 TaKaRa公司的
pMD18-T vector进行目的片段的克隆, 并测序。
1.4 不同植物中 CBF基因的氨基酸序列比
利用 Clustal X软件比对 ZjCBF基因所对应的氨
基酸序列与拟南芥、水稻、小麦、大麦、黑麦以及
1574 作 物 学 报 第 40卷
玉米的 CBF基因所对应的氨基酸序列。
1.5 半定量 PCR
俵将室兰和 山北在低温培养箱中 4℃处理 0、3、
6、12和 24 h, 提取 RNA, 反转录后进行半定量 PCR,
特异引物序列为 BDCBF-F: 5-CGC ATA GCA CTG
ATC GTC ACC CG-3; BDCBF-R: 5-CCT CAC CGC
CGT CAT CAT CGT C-3, 扩增片段长度为 156 bp;
内参基因选用结缕草的 Actin 基因, Actin 引物序列:
Actin-F: 5-TGT GCT CAG CGG TGG TTC AA-3;
Actin-R: 5-TGC TGG GCC AGA CTC GTC AT-3, 扩
增程序同一般 PCR程序, 只是循环数降至 28次。
1.6 实时荧光定量 Real-time PCR
俵将室兰和 山北在低温培养箱中 4℃处理 0、3、
6、12和 24 h, 提取 RNA, 反转录后进行实时荧光定
量 PCR, 特异引物序列同半定量 PCR, 扩增片段长
度为 156 bp; 内参基因选用结缕草的 18S rRNA基因,
引物序列为: 18S-F: 5-GCT TTG GTG ACT CTA GAT
AAC-3; 18S-R: 5-GTC GGG AGT GGG TAA TTT
GC-3; 采用 Real-time PCR仪进行 PCR, 扩增程序为
95.0 3 min℃ ; 95.0 30 s, 58.0 30 s, 72.0 30 s, 40℃ ℃ ℃
次循环; 95.0 10 s℃ 。65~95℃区间每隔 0.5℃绘制熔
解曲线, 读板。根据各样品特定荧光阈值下的 Ct 值,
采用 2–Ct计算方法分析不同样品间相对表达量。
1.7 构建 ZjCBF基因的超表达载体
设计带有保护碱基和酶切位点的 ZjCBF基因引
物, ZjCBF-F: 5-GGC CCC GGG ATG GAG AAC
AAC ATG GGC GAC GAC A-3 (酶切位点为 Sma I);
ZjCBF-R: 5-GGC GAG CTC TCC ACT AGT GAT
TTC ACT ATA GG-3 (酶切位点为 Sac I), 采用带有
CaMV35S启动子的载体 pCAMBIA 1300构建 ZjCBF
基因的超表达载体, 将该载体转入农杆菌 GV3101,
挑取阳性克隆于含有庆大霉素(Gentamycin, 50 mg
L–1),卡那霉素 (Kanamycin, 50 mg L–1)和利福平
(Rifampicin, 30 mg L–1)的液体 LB培养基中, 28℃振
荡过夜培养。
1.8 农杆菌转化拟南芥及转基因苗的获得
采用蘸花法转化拟南芥 Columbia生态型, 获得
转基因拟南芥种子, 将收获的转基因拟南芥种子经
过 7~8 d 的后熟后 , 用 0.2%的 Triton X-100 浸泡
10 min; 用 10%的次氯酸钠表面消毒 12 min; 灭菌
水洗涤 5次, 每 2 min一次; 用含 0.2%琼脂的蒸馏水
将种子铺在含 20 mg L–1潮霉素(hygromycin)的 MS
固体培养基上, 4℃暗培养 2 d; 22 , 16 h℃ 光照培养。
经潮霉素筛选两周, 挑选并初步认定种子萌芽后生
长良好, 能够顺利长出真叶, 正常伸长根的苗为阳
性苗(T1 代), 并将其移盆种植, 培养至拟南芥的果
荚变黄成熟时, 及时采收种子, 再经过上述方法筛
选得到阳性苗(T2代)进行后续试验。
1.9 转基因拟南芥的冷处理试验
将拟南芥转 ZjCBF基因阳性苗和野生型苗分别
种在同一 MS 固体培养基上的各半边, 不经冷驯化,
22 , 16 h℃ 光照培养 2周, 然后–6℃处理 6 h, 恢复生
长 1周, 观察表型。同样将另一部分拟南芥转 ZjCBF
基因阳性苗和野生型苗分别种在同一 MS 固体培养
基上的各半边, 22 , 16 h℃ 光照培养 1周, 4℃冷驯化
48 h, 然后–10℃处理 6 h, 恢复生长 1周, 观察表型。
2 结果与分析
2.1 结缕草 CBF基因(ZjCBF)中间片段的分离和
测序
以结缕草基因组DNA为模板进行PCR, 利用简
并引物Midcbf-F和Midcbf-R扩增得到一段192 bp的
核苷酸片段Midcbf (5-GAG ACG CGC CAC CCG
GTG TAC CGC GGC GTG CGG CGG CGC GGG
CCC GCC GGC CGC TGG GTC TGC GAG GTG
AGG GAG CCC AAC AAG AAA TCC CGC ATC
TGG CTG GGG ACC TTC GAG ACC GCC GAG
ATG GCG GCG CGC GCG CAC GAC GTC GCC
GCG CTG GCG CTC CGC GGC CTC GGC GCG
TGC CTC AAC TTC GCG-3), 琼脂糖电泳检测结果
见图1。
图 1 结缕草 CBF 基因中间片段 Midcbf 琼脂糖电泳图
Fig. 1 Agarose electrophoresis of Midcbf, a fragment of CBF
gene in Zoysiagrass
2.2 ZjCBF基因的克隆结果
在已知序列Midcbf基础上利用 RACE技术向两
端扩增, 结果如图 2, ZjCBF基因 3RACE 结果得到
一段 807 bp 的 cDNA 片段, 5RACE 结果得到一段
364 bp的 cDNA片段; 从而得到 ZjCBF基因的全长
cDNA序列。ZjCBF基因 cDNA序列为 1184 bp, CDS
第 9期 冯勋伟等: 结缕草 CBF基因的同源克隆及其转基因拟南芥的抗寒性验证 1575
序列长 636 bp; ZjCBF基因编码区(包括终止密码子)
的扩增结果 (图 3)以及测序结果表明 , 以基因组
DNA为模板和以 cDNA为模板获得的序列是完全一
致的 , 这说明 ZjCBF 基因没有内含子 ; ZjCBF 的
cDNA序列已提交到 DDBJ (DNA Data Bank of Japan)
数据库, ZjCBF的登录号为 AB627353。
图 2 ZjCBF 基因 RACE 琼脂糖电泳图
Fig. 2 Agarose electrophoresis image of ZjCBF’s RACE
图 3 ZjCBF 基因编码区(包括终止密码子)的琼脂糖电泳图
Fig. 3 Agarose electrophoresis image of ZjCBF’s coding region
(including termination codon)
1: 以 gDNA为模板; 2: 以 cDNA为模板;
M: 分子量标记 marker III。
1: gDNA template; 2: cDNA template; M: marker III ladder.
2.3 不同植物中CBF基因的氨基酸序列比对结果
根据 ZjCBF基因, 得到 ZjCBF基因所对应的氨
基酸序列, 与拟南芥、水稻、小麦、大麦、黑麦和
玉米的 CBF 基因所对应的氨基酸序列比对发现, 除
了 AP2/EREBP DNA结合结构域的氨基酸序列较为
保守外 , 其余两侧氨基酸序列均没有明显同源性
(图 4)。
2.4 ZjCBF基因在不同冷处理条件下的表达情况
根据半定量 PCR 结果 (图5)和实时荧光定量
PCR结果(图6), 发现 ZjCBF基因的表达量无论是耐
俵寒性好的室兰还是较差的 山北都呈现比较一致的
趋势, 即在4℃处理0 h时几乎没有表达, 6 h时表达
量最高 , 随后迅速降低。而在处理6 h 时 , 室兰
ZjCBF 俵基因的表达量明显高于 山北。
2.5 转基因(ZjCBF)冷处理结果
如图7所示 , 在未经冷驯化的情况下 , 直接用
–6℃处理6 h, 恢复生长一周后, 野生型苗大部分叶
片发白死亡; 而转 ZjCBF 基因的拟南芥苗叶片仍呈
绿色, 正常生长。在冷驯化的情况下(4℃处理48 h),
–10℃处理6 h, 恢复生长1周后, 表型与未经冷驯化
的冷处理结果一致, 野生型苗大部分叶片发白死亡;
而转 ZjCBF 基因的拟南芥苗叶片仍大部分呈绿色,
并未死亡。
3 讨论
3.1 ZjCBF的氨基酸序列分析
AP2/EREBP 家族的转录因子中包括与调控植
物细胞周期、生长发育以及环境胁迫应答反应等有
关的一系列转录因子, 家族成员的转录激活区差异
很大, 但它们都含有由 60个左右氨基酸残基组成的
非常保守的 DNA 结合区(即 AP2/EREBP 结构域),
而且 N末端都有起核定位作用的碱性氨基酸序列。
本研究通过对结缕草 CBF 基因(ZjCBF)编码的氨基
酸序列分析发现 , ZjCBF 蛋白含有高度保守的
AP2/EREBP 结构域, 该结构域中含有 79个氨基酸,
同时, ZjCBF蛋白的 AP2/EREBP结构域以外的氨基
酸序列与其他植物 CBF 蛋白氨基酸序列总体上看没有
明显的同源性, 这与之前所得到的结果相一致[11-12]。
ZjCBF 蛋白具备反式作用因子的典型特征 , 即
AP2/EREBP 结构域的 N 末端有一段核定位信号肽,
序列为 PKRPAGRTKFRETRHP, C 末端有一段酸性
活化区域 , 序列为 DSPR; 而在拟南芥的 140多种
AP2/EREBP 结构域蛋白中 , 只有 CBF1、CBF2、
CBF3 蛋白才具有两段类似的短多肽序列, 因而称
他们为 CBF蛋白的特征序列[13]。由此, 可以推导出
ZjCBF基因可能与 CBF1、CBF2、CBF3基因具有类
似的功能, 在结缕草冷信号转导中起重要作用。
3.2 ZjCBF基因在低温胁迫下的表达分析
在拟南芥中, CBF1、CBF2和 CBF3基因在常温
下几乎不表达 , 冷处理后 , 表达量迅速提高 , 一般
在 3 h左右达到最高, 随后又逐渐降低, 但在低温处
理下各 CBF基因的表达量仍然比常温下高[14]。在本
研究中, ZjCBF 基因的表达模式与拟南芥中 CBF 基
因的表达模式类似, 表达量也是先升高后下降, 但
1576 作 物 学 报 第 40卷
图 4 不同植物种的 CBF 基因的氨基酸序列分析
Fig. 4 Analysis of CBF gene amino acid sequence in different plant species
TaCBF11: 小麦(GI编号: 60593403); CBFIa-11: 黑麦(GI编号: 164507129); DREBP1D: 玉米(GI编号: 195612664);
HvCBF1: 大麦(GI编号: 60547419); ZjCBF: 结缕草; TRCBF1: 水稻(GI编号: 32966057); DREBP1B: 拟南芥(GI编号: 18416562)。
下画线部分为 AP2/EREBP DNA结合结构域。
TaCBF11: Triticum aestivum (GI: 60593403); CBFIa-11: Secale cereale (GI: 164507129); DREBP1D: Zea mays (GI: 195612664);
HvCBF1: Hordeum vulgare (GI: 60547419); TRCBF1: Oryza sativa (GI: 32966057); DREBP1B: Arabidopsis thaliana (GI: 18416562).
DNA binding domain of AP2/EREBP is underlined.
图 5 ZjCBF 基因在 4℃低温处理的半定量结果
Fig. 5 Expression level of ZjCB at 4℃ treatment by
semi-quantitative PCR
M: 室兰; T: 俵山北。M: Murorann; T: Tawarayamakita.
ZjCBF基因的表达量高峰出现在低温处理 6 h后, 较
拟南芥 CBF 基因有一定的滞后。同时, 俵室兰和 山
北 2个耐寒性不同的结缕草品种的 ZjCBF基因的低
温处理下的表达量也存在明显差异, 处理 6 h后, 室
兰的 ZjCBF 基因 俵的表达量明显高于 山北的; 这种
差异, 俵可能就是室兰和 山北耐寒性不同的原因之
一; 俵但对室兰和 山北 ZjCBF 基因测序发现, 两者
图 6 室兰和俵山北 ZjCBF 基因在 4℃低温处理的实时荧光定量
PCR 结果
Fig. 6 Expression level of ZjCBF in Murorann and
Tawarayamakita under 4℃ treatment by Real-time PCR
第 9期 冯勋伟等: 结缕草 CBF基因的同源克隆及其转基因拟南芥的抗寒性验证 1577
图 7 转 ZjCBF 基因拟南芥和野生型(WT)冷处理结果
Fig. 7 Cold treatment results of transgenic (ZjCBF) Arabidopsis and wild type Arabidopsis
之间序列一致(未发表数据), 俵所以造成室兰和 山
北 ZjCBF基因表达差异的原因还有待进一步研究。
3.3 转 ZjCBF基因冷处理结果分析
低温诱导 CBF转录因子家族基因(CBF1、CBF2
和 CBF3)的表达, 这些转录因子在植物冷驯化的过
程中, 结合在下游冷诱导基因启动子 CRT/DRE 区
域, 调控冷诱导基因的表达, 从而调控植物的抗寒
性[15-16]。其中, CBF1和 CBF3基因是正向调控植物
的抗寒性, CBF2 基因通过下调 CBF1 和 CBF3 来反
向调控植物的抗寒性 [16]。本试验中转基因(ZjCBF)
的拟南芥在低温处理下均表现出较强的抗寒性, 结
合 NCBI 上的序列比对结果, 可以认定 ZjCBF 基因
应该属于 CBF转录因子家族基因中 CBF1型基因。
不经冷驯化的拟南芥野生型的半致死低温为–4.8 , ℃
经过冷驯化的拟南芥野生型的半致死低温为–9.4℃ [17],
所以本试验在不经冷驯化的条件下采用了–6℃的处
理温度 ; 在经冷驯化的条件下采用了–10℃的处理
温度。从图 7中可知, 不论是否经过冷驯化, 转基因
(ZjCBF)的植株由于 ZjCBF 的过量表达都要比野生
型植株抗寒, 因此, 可以认为 ZjCBF 基因对增强植
物的抗寒性起重要作用。由于结缕草的组织培养技
术并不成熟, 转基因周期长, 所以本试验将克隆得
到的 ZjCBF 基因转入拟南芥中观察表型, 可能所得
结果与直接转基因结缕草有一定的差异, 后续试验
可以增加一些这方面的工作。
4 结论
利用同源克隆技术, 获得到与结缕草抗寒相关
的 ZjCBF 基因, 通过氨基酸序列比对分析, 该基因
与已经克隆得到的其他植物中的 CBF 基因高度同
源。ZjCBF基因受冷胁迫的诱导, 在 4℃处理 6 h时
表达量最高。不论是否经过冷驯化, 转基因的植株
由于 ZjCBF的过量表达均比野生型植株抗寒。ZjCBF
基因属于 CBF转录因子家族基因中 CBF1型基因。
References
[1] Zhu J H, Dong C H, Zhu J K. Interplay between cold-responsive
gene regulation, metabolism and RNA processing during plant
cold acclimation. Curr Opin Plant Biol, 2007, 10: 290–295
[2] Stocking E J, Gilmour S J, Thomashow M F. Arabidopsis
thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcrip-
tional activator that binds to C-repeat/DRE, a cis-acting DNA
regulatory element that stimulates transcription in response to
low temperature and water deficit. Proc Natl Acad Sci USA, 1997,
94: 1035–1040
[3] Haake V, Cook D, Riechrmnn J L, Pineda O, Thomashow M F,
Zhang J Z. Transcription factor CBF4 is a regulator of drought
adaptation in Arabidopsis. Plant Physiol, 2002, 130: 639–648
[4] Sakuma Y, Liu Q, Dubouzet J G, Abe H, Shinozaki K, Yamagu-
chi-Shinozaki K. DNA-binding specificity of the ERF/AP2 do-
main of Arabidopsis DREBs, transcription factors involved in
dehydration- and cold-inducible gene expression. Biochem Bio-
phys Res Commun, 2002, 290: 998–1009
[5] Jaglo K R, Kleff S, Amundsen K L, Zhang X, Haake V, Zhang J
Z, Deits T, Thmashow M F. Components of the Arabidopsis
C-repeat / dehydration-responsive element binding factor cold-
response pathway are conserved in Brassica napus and other
plant species. Plant Physiol, 2001, 127: 910–917
[6] Hsieh T H, Lee J T, Yang P T, Chiu L H, Chang Y Y, Wang Y C,
Chan M T. Heterology expression of the Arabidopsis C-repeat/
dehydration response element binding factor 1 gene confers ele-
vated tolerance to chilling and oxidative stresses in transgenic
tomato. Plant Physiol, 2002, 129: 1086–1094
[7] Choi D W, Rodriguez E M, Close T J. Barley cbf3 gene identifi-
cation, expression pattern, and map location. Plant Physiol, 2002,
129: 1781–1787
[8] Burren M L, Salvi S, Morgante M, Serhani B, Tubelma R. Com-
1578 作 物 学 报 第 40卷
parative genomic mapping between a 745 kb region flanking
DREBlA in Arabidopsis thaliana and maize. Plant Mol Biol, 2002,
48: 741–750
[9] Dubouzet J G, Sakuma Y, Ito Y, Kasuga M, Dubonzet E G, Miura
S, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. OsDREB genes
in rice, Oryza sativa L. encode transcription activators that func-
tion in drought-, high-salt and cold-responsive gene expression.
Plant J, 2003, 33: 751–763
[10] Rogers O S, Bendich A J. Extraction of DNA from plant tissue.
Plant Mol Biol Manual, 1998, A6: 1–10
[11] Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. A novel cis-acting element
in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought,
low-temperature, or high-salt stress. Plant Cell, 1994, 6: 251–264
[12] Gilmour S J, Zarka D G, Stockinger E J, Salazar M P, Houghton J
M, Thomashow M F. Low temperature regulation of the Arabi-
dopsis CBF family of AP2 transcriptional activation as an early
step cold-induced COR gene expression. Plant J, 1998, 16:
433–442
[13] Medina J, Bargues M, Terol J, Perez M, Salinas J. The Arabidop-
sis CBF gene family is composed of three genes encoding AP2
domain-containing proteins whose expression is regulated by low
temperature but not by abscisic acid or dehydration. Plant
Physiol, 1999, 19: 463–470
[14] Agarwal M, Hao Y, Kapoor A, Dong C H, Hiroaki F, Zheng X,
Zhu J K. A R2R3 type MYB transcription factor is involved in
the cold regulation of CBF genes and in acquired freezing tole-
rance. J Biol Chem, 2006, 281: 37636–37645
[15] Liu Q, Kuasga M, Skauma Y, Abe H, Miura S, Yamaguchi-
Shinozaki K, Shinozaki K. Two transcription fctors, DREB1 and
DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two
cellular signal transduction pathways in drought and low-
temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabi-
dopsis. Plant Cell, 1998, 10: 1391–1406
[16] Jaglo-Ottoseu K R, Gilmour S J, Zarka D G. Arabidopsis CBF1
overexpression induces COR genes and enhances freezing tole-
rance. Science, 1998, 280: 104–106
[17] Novillo F, Alonso J M, Ecker J R, Salinas J. CBF2/DREBlC is a
negative regulator of CBFl/DREBlB and CBF3/DREBIA expres-
sion and plays accentual role in stress tolerance in Arabidopsis.
Plant Biol, 2004, 11: 3885–3900
欢迎订阅 2015 年《植物遗传资源学报》
《植物遗传资源学报》是中国农业科学院作物科学研究所和中国农学会主办的学术期刊, 为中国科技论文
统计源期刊、中国科学引文数据库来源期刊(核心期刊)、中国核心期刊(遴选)数据库收录期刊、中国学术期刊综
合评价数据库统计源期刊, 又被《中国生物学文摘》和中国生物学文献数据库、中文科技期刊数据库收录。据
2013年发布《中国科技期刊引证报告》(扩刊版)统计《植物遗传资源学报》影响因子为 1.146; 另据 2013年 CNKI
发布的《中国学术期刊影响因子年报》统计《植物遗传资源学报》的综合影响因子为 1.396, 在全国农艺和园艺
类期刊中排名第 5位。
报道内容为大田、园艺作物, 观赏、药用植物, 林用植物、草类植物及其一切经济植物的有关植物遗传资源
基础理论研究、应用研究方面的研究成果、创新性学术论文和高水平综述或评论。诸如, 种质资源的考察、收
集、保存、评价、利用、创新, 信息学、管理学等；起源、演化、分类等系统学；基因发掘、鉴定、克隆、基
因文库建立、遗传多样性研究。
《植物遗传资源学报》为双月刊, 大 16开本, 196页/期。定价 20元, 全年 120元。
国内刊号 CN 11-4996/S, 国际统一刊号 ISSN 1672-1810。全国各地邮局发行, 邮发代号: 82-643。
本刊编辑部常年办理订阅手续, 如需邮挂每期另加 3元。
地址: 北京市中关村南大街 12号 中国农业科学院《植物遗传资源学报》编辑部(邮编: 100081)
电话: 010-82105794; 010-82105796 (兼传真)
网址: http://www.zwyczy.cn/ E-mail: zwyczyxb2003@163.com; zwyczyxb2003@sina.com