全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(6): 838844 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由中央高校基本科研业务费(XDJK2015C117)和国家自然科学基金项目(31171178)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 桑贤春, E-mail: sangxianchun@163.com; 何光华, E-mail: hegh@swu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: xwwang78@126.com
Received(收稿日期): 2014-11-24; Accepted(接受日期): 2015-03-19; Published online(网络出版日期): 2015-04-17.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150417.0930.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00838
水稻白穗突变体 wp4的鉴定与基因精细定位
王晓雯 蒋钰东 廖红香 杨 波 邹帅宇 朱小燕 何光华* 桑贤春*
西南大学水稻研究所 / 转基因植物与安全控制重庆市重点实验室 / 南方山地农业教育部工程研究中心, 重庆 400716
摘 要: 水稻开花灌浆期, 内外颖呈绿色, 含光合色素, 为阐释非叶片组织叶绿体发育的分子机制, 本文对 EMS 诱
变获得的新型白穗突变体 wp4进行了研究。抽穗灌浆期, wp4的穗轴呈绿色, 内外颖呈乳白色; 内外颖叶绿体发育不
健全, 无类囊体结构, 叶绿素 a、叶绿素 b和类胡萝卜素含量极显著降低。此外, wp4全生育期叶片呈淡黄色, 叶绿体
内基质片层较少且排列松散; 与野生型相比, wp4的叶绿素 a含量显著降低, 叶绿素 b和类胡萝卜素含量虽略低, 但
差异未达到显著水平。农艺性状分析发现, 与野生型相比, wp4 的有效穗和结实率略有增加, 其他性状则略有降低,
但变化均未达到显著差异水平。遗传分析表明 wp4受一对隐性核基因调控, 利用 1200株西农 1A/wp4的 F2隐性群体,
最终将 WP4精细定位在第 8染色体约 79 kb的物理范围内, 根据水稻基因组注释计划, 该区间包含 14个基因, 这为
WP4的功能和作用机制研究奠定了基础, 也为水稻标记性状育种提供了新的资源。
关键词: 水稻(Oryza sativa); 白穗; 黄绿叶; 基因定位; 叶色标记
Identification and Gene Fine Mapping of White Panicle Mutant wp4 in Oryza
sativa
WANG Xiao-Wen, JIANG Yu-Dong, LIAO Hong-Xiang, YANG Bo, ZOU Shuai-Yu, ZHU Xiao-Yan, HE
Guang-Hua*, and SANG Xian-Chun*
Rice Research Institute, Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops, Southwest University,
Chongqing 400716, China
Abstract: At the flowering and filling stages, rice hull appears green color and possesses photosynthetic pigment. To clear the
mechanism of chloroplast development in the panicle, we identified a novel white panicle mutant from the progeny of indica re-
storer line Jinhui 10 with seeds treated by EMS and termed it as wp4. The wp4 displayed green spike-stalks and milk-white hulls
after the heading stage. The structures of chloroplast and thylakoid were severely destroyed and the contents of photosynthetic
pigment decreased extremely significantly in the mutational hulls. Compared with the wild type, the wp4 displayed yellow green
leaves and contained looser stromal lamellae. And the contents of chlorophyll a, b, and carotenoid were all declined while only the
changing of chlorophyll a led to the significantly different level in statistics. Except for effective panicles number and seed setting
rate, other detected agronomic characteristics decreased slightly but the changing did not come up to the statistically significant
difference. Genetic analysis indicated that the white panicle of wp4 was controlled by a recessive nuclear gene and which was
finally mapped on chromosome 8 with 79 kb physical distances according to 1200 mutational plants derived from the F2 genera-
tion of Xinong1A/wp4. The restricted region contained 14 annotated genes based on Rice Genome Annotation Project. These re-
sults provided a foundation for gene cloning and function analysis of the WP4. Meanwhile, the traits of wp4 could be available in
rice breeding as a morphological marker.
Keywords: Rice (Oryza sativa); White panicle; Yellow green leaf; Gene mapping; Leaf color marker
叶片是水稻进行光合作用的主要场所, 抽穗灌
浆期, 光合产物从叶输送到籽粒并储存下来, 最终
形成稻谷产量。稻穗抽出剑叶叶鞘后, 颜色由白转
为绿色 , 授粉后 , 随着籽粒的灌浆成熟 , 又由绿渐
变为金黄色。与叶片相比, 穗部叶绿体色素含量较
少、光合效率较低, 穗部光合产物仅占水稻植株总
第 6期 王晓雯等: 水稻白穗突变体 wp4的鉴定与基因精细定位 839
光合产物的 5.4%左右 [1]。穗距离籽粒近 , 根据
“库”“源”关系, 穗光合作用对水稻产量可能也具有
一定的影响。如, 抽穗灌浆期套不透明袋, 水稻千粒
重和结实率明显下降, 套透明袋则下降不明显[2]。但
穗部光合作用对水稻产量的影响大小及穗叶绿体发
育的分子机制还很不清晰。
在植物中, 叶绿体主要存在于叶片中, 叶绿体
发育异常通常会导致叶色变化。叶色变异是一个复
杂的生理过程, 受温度、光照、营养等外界环境的
影响, 也受内部基因的调控。目前, 在水稻中已鉴定
到 160 多个叶色突变体, 邓晓娟等[3]根据表型将其
归为白化、黄化、温敏变色、亮绿、常绿、条斑条
纹、转绿和紫色 8 类。目前, 已利用这些突变体克
隆了 30多个调控基因, 从而为叶片组织叶绿体发育
和叶绿素合成的分子机制阐释奠定了基础[3-5]。然而,
对于非叶片组织, 由于相关突变体的匮乏, 叶绿体
发育分子机制还很不清晰。在水稻中仅鉴定到 6 个
穗部失绿突变体, 根据穗部表型分为两类, 一类仅
内外稃白化失绿 , 如 wp1[6]、wlp1 (white leaf and
panicles 1)[7]和 wslwp (white striped leaf and white
panicle)[8]; 一类除内外稃白化外, 穗轴和枝梗也呈
白色, 如 wp2[6]、wp(t)[9]和 st-fon (streaked leaf and
floral organ number)[10]。
为研究穗部光合作用对水稻产量的影响以及穗
部叶绿体的发育机制, 我们从籼型水稻恢复系缙恢
10 号的 EMS 诱变库中筛选鉴定到 1 个新型白穗突
变体。该突变体全生育期叶色淡黄, 抽穗灌浆期内
外颖白色, 穗轴和枝梗不失绿, 暂命名为 wp4 (white
panicle 4)。本文对其进行了表型鉴定和基因精细定
位等研究。
1 材料与方法
1.1 突变体材料
白穗突变体 wp4来源于晚籼水稻恢复系缙恢 10
号的 EMS诱变, 多代自交后突变表型已稳定遗传。
配制西农 1A/wp4 杂交组合, 利用其 F1和 F2群体进
行遗传分析, 并利用 F2分离群体中的隐性单株进行
基因定位。西农 1A是西南大学水稻研究所选育的一
个早籼不育系, 穗和叶片颜色正常。
1.2 测定项目与方法
1.2.1 形态鉴定 田间种植 wp4 和野生型, 株行
距 20 cm × 25 cm, 常规管理。根据叶龄全生育期观
察叶色变化, 抽穗期之后每隔 1 d 记载穗部颜色一
次, 完全成熟后选取小区试验的中间 10 株, 调查株
高、有效穗、穗长、穗粒数、结实率和千粒重等主
要农艺性状, 并进行统计分析。
1.2.2 光合色素含量测定 开花期, 早晨 8:30 左
右 , 采集 wp4 及野生型的倒一叶和颖壳 , 参照
Wellburn[11]描述的方法测定光合色素含量。
1.2.3 透射电镜观察 参照 Fang等[12]方法取开
花期的叶片和颖壳 , 经戊二醛和锇酸双重固定后 ,
利用不同梯度的乙醇逐级脱水, 再置换和包埋, 制
超薄切片后, 以醋酸双氧铀和柠檬酸铅液双重染色,
H600型透射电镜观察并照相。
1.3 DNA的提取
利用改良的 CTAB 法提取亲本、基因池和隐性
定位群体的 DNA。把 0.2 g 左右的叶片剪碎放入预
装 3粒钢珠的 2 mL离心管, 液氮速冻, 研碎后加入
0.7 mL的 CTAB溶液, 65℃水浴 15 min, 每 5 min颠
倒 1次, 再加入 0.7 mL的氯仿萃取 1 min, 12 000转
min–1离心 3 min。取 0.5 mL上清液到 1.5 mL离心管
内, 加 1 mL预冷的无水乙醇, 上下颠倒后 12 000转
min–1 离心 1 min, 倾去上清液 , 无乙醇气味后加
200 μL的 ddH2O溶解沉淀, 即得 DNA。
1.4 PCR扩增
RM 系列 SSR 引物的序列来源于 http://www.
gramene.org/microsat。PCR 总体积 12.5 μL, 包括
1.25 μL的 10×PCR buffer, 0.75 μL的 25 mmol L–1
MgCl2, 0.5 μL 的 2.5 mmol L–1 dNTPs, 8.0 μL 的
ddH2O, 1.0 μL的 10 μmol L−1引物, 1.0 μL的模板
DNA和 0.1 μL的 5 U μL–1 Taq DNA聚合酶。PCR
程序为 94℃预变性 3 min后, 94℃ 20 s、56℃ 20 s、
72℃ 40 s, 35个循环, 再 72℃充分延伸 7 min。PCR
产物经 10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 0.2%的
AgNO3染色 10 min, 去离子水漂洗 2次, 每次 30 s,
然后再用 0.1%的甲醛和 2%的 NaOH 混合液染色至
条带清晰可辨, 去离子水冲洗 2次后观察照相。
1.5 精细定位分子标记的开发
前期研究中, 已利用高通量测序技术完成了西
农1A 和缙恢10号的 DNA 测序。根据二者之间的多
态性, 选择6~12个碱基的差异位点, 利用 NTI vector
11.0软件开发 Indel标记。
1.6 遗传作图
定位群体中, 具有西农 1A带型的单株记为 A, 具
有wp4带型的单株记为B, 具有西农 1A/wp4带型的单
株记为 H, 用 Mapmaker3.0 进行数据分析和作图, 用
840 作 物 学 报 第 41卷
Kosambi函数将重组率转化为遗传距离(用 cM表示)。
2 结果与分析
2.1 白穗突变体 wp4的形态鉴定
田间种植条件下, 野生型的叶片全生育期均为
绿色, 穗抽出剑叶叶鞘后呈翠绿色, 成熟期则为金
黄色。wp4的叶片分蘖前期为黄绿色(图 1-A, B), 抽
穗灌浆期则为浅黄色(图 1-C, D); 稻穗抽出剑叶叶
鞘后, 内外颖呈乳白色(图 1-E, F, G)。与突变亲本缙
恢 10 号相比, wp4 的株高、穗长、穗粒数和千粒重
略有下降, 有效穗和结实率则略有升高, 但差异均
未达到显著水平(表 1)。
图 1 野生型缙恢 10号和突变体 wp4的表型鉴定
Fig. 1 Plant morphology of the wild type Jinhui 10 and the mutant wp4
A: 分蘖前期缙恢 10号(WT)和 wp4植株; B: 分蘖前期WT和 wp4叶片; C: 灌浆期WT和 wp4叶片; D: 灌浆期WT和 wp4植株; E: WT
和 wp4的穗; F: WT和 wp4的籽粒; G: WT和 wp4的一次枝梗。
A: phenotype of the wild type (WT) and the wp4 at the early tillering stage; B: leaf blades of the WT and the wp4 at the early tillering stage; C:
leaf blades of the WT and the wp4 at the filling stage; D: phenotype of the WT and the wp4 at the filling stage; E: panicles of the WT and the
wp4 at the flowering stage; F: mature seeds of the WT and the wp4; G: primary rachis branches of the WT and the wp4 at the flowering stage.
表 1 野生型(WT)和 wp4农艺性状分析
Table 1 Agronomic trait of the wild type (WT) and the wp4
材料
Material
株高
Plant height
(cm)
有效穗数
Number of
effective panicles
穗长
Panicle length
(cm)
穗粒数
Grain number
per panicle
穗实粒数
Filled grain number
per panicle
结实率
Seed setting
rate (%)
千粒重
1000-grain
weight (g)
wp4 109.56±1.75 14.00±0.78 27.06±2.48 193±4.78 137.00±4.13 70.61±1.68 25.2±0.34
WT 110.66±2.75 13.00±0.46 28.50±1.23 247±3.26 157.80±3.42 63.42±1.34 26.5±0.45
与野生型相比, 叶片中, wp4的叶绿素 a含量显
著降低, 叶绿素 b和类胡萝卜素含量无变化(图 2-A),
内外颖中, 叶绿素 a、叶绿素 b和类胡萝卜素含量均
极显著降低(图 2-B)。叶片中, 野生型和突变体的 Chl
a/Chl b 值无明显差异; 颖壳中, 由于野生型的 Chl
a/Chl b值降低, 导致 wp4的 Chl a/Chl b值显著大于
野生型。透射电镜观察发现, 与野生型相比, wp4叶
肉细胞内的细胞器结构较为完整、清晰, 叶绿体中
含有基粒、基质和基质类囊体, 但基质片层略少且
排列较为松散(图 3-A, B, C, D)。野生型颖壳中的叶
绿体数量少于叶片部位, 内含基粒较薄, 但类囊体
发育基本完整, 基质片层排列规则; 突变体 wp4 中,
颖壳部位的细胞形状不规则且细胞器结构异常, 质
体没能发育成含有明显类囊体结构的叶绿体(图 3-E,
F, G, H)。
2.2 遗传分析
西农 1A/wp4 杂交组合中, F1植株的叶片和稻穗
颜色均发育正常; F2群体中, 根据株型颜色可分为两
类, 一类与野生型类似, 叶片和稻穗的颜色均正常发
育, 一类与 wp4的表型相似, 全生育期叶色略淡、抽
穗后稻穗呈乳白色或乳黄色。4558株 F2群体中, 3438
株表型正常, 1120 株为突变表型, χ2测验显示正常与
突变单株符合 3∶1的分离比[χ2=1.56＜χ2(0.05)=3.84],
表明 wp4的突变型受 1对隐性核基因控制。
第 6期 王晓雯等: 水稻白穗突变体 wp4的鉴定与基因精细定位 841
图 2 开花期野生型(WT)和 wp4的光合色素含量
Fig. 2 Photosynthetic pigment contents of the wild type (WT) and the mutant wp4
A: 叶片光合色素含量; B: 内外颖壳的光合色素含量; C: 叶片和颖壳中的叶绿素 a和 b的比值。
A: photosynthetic pigment contents of the leaf blades in the WT and the wp4; B: photosynthetic pigment contents of the hulls in the WT and
the wp4; C: the values of Chl a/Chl b in the leaf and hull.
图 3 野生型缙恢 10号和突变体 wp4的细胞超微结构观察
Fig. 3 Cell structure of the wild type and mutational leaf blades observed by Transmission Electron Microscope
A: 野生型叶片内的细胞; B: 野生型叶片细胞中的叶绿体; C: wp4叶片内的细胞; D: wp4叶片细胞内的叶绿体; E: 野生型外稃内的细
胞; F: 野生型外稃细胞中的叶绿体; G: wp4外稃内的细胞; H: wp4外稃细胞中的质体。
A: cell structure of the leaf blade in the wild type; B: chloroplast in the leaf blade of the wild type; C: cell structure of the wp4 leaf blade;
D: chloroplast of the wp4 leaf blade; E: cell structure in the lemma of the wild type; F: chloroplast in the lemma of the wild type;
G: cell structure of the wp4 lemma; H: plasmid of the wp4 lemma.
2.3 精细定位
均匀分布在水稻 12条染色体上的 480对 RM系
列 SSR引物, 112对在西农 1A和 wp4间呈现多态性,
其中, 位于第 8 染色体上的 RM22392、RM1376 和
RM310在正常基因池和突变基因池之间也呈现多态
性, 紧邻标记同时存在多态性暗示其可能与目的基
因连锁。70 个典型 F2隐性单株检验表明 WP4 位于
RM1376 和 RM310 之间, 遗传距离分别为 6.43 cM
和 14.29 cM (图 4-A)。
在初步定位区间内, 设计开发 Indel 标记, 利用
亲本间呈现多态性的标记进行精细定位, 多态性标
记的引物序列见表 2。结果发现, 1120 株 F2隐性单
株中, Ind08-1、Ind08-2、Ind08-3和 Ind08-4的交换
株数分别为 16、4、1和 14个, 且前 2个标记与后 2
个标记的交换株不同, 从而最终将 WP4定位在 Ind08-
2和 Ind08-3之间约 79 kb的物理距离内(图 4-B, C)。
842 作 物 学 报 第 41卷
图 4 WP4在水稻第 8染色体上的分子定位
Fig. 4 Molecular mapping of WP4 on rice chromosome 8
表 2 WP4精细定位的 InDel引物序列
Table 2 Newly designed InDel markers used for mapping the WP4 locus
标记
Marker
正向引物
Forward primer (5–3)
反向引物
Reverse primer (5–3)
Ind08-1 GCAATCAGGACAAATAACCCC CATCGCCCTCTCCTGCTAA
Ind08-2 TAGTGGCAGCGAGATCCCT TAGTGGCAGCGAGATCCCT
Ind08-3 TCCAACACTTGTGTTGTTTAATTCT GATCCAGATTCCAGATTACACAGT
Ind08-4 TTGGAGGTGAGCTTGAACG TCACCGTGTTCGAGTGGTT
2.4 候选基因分析
根据Gramene和RGAP (水稻基因组注释数据库:
Rice Genome Annotation Project)提供的水稻基因组
注释序列, 在WP4精细定位的 79 kb物理范围内, 含
有 14个注释基因(表 3)。其中, MYB家族转录因子、
小檗碱结构域蛋白、表达蛋白和转座子编码基因各
有 2 个, 其余 6 个分别编码 B3 DNA 结合结构域蛋
白、无顶端分生组织蛋白(NAM)、牛心果碱氧化酶
前体、stomatin-like 蛋白、转移酶和核仁 GTP 结合
蛋白。其中, 转移酶编码基因含有一个叶绿体信号
肽, 我们对其进行了测序, 但野生型和突变体之间
没有发现碱基差异。
表 3 定位区间 RGAP注释基因
Table 3 RGAP annotated genes in the restricted region of WP4 locus
RGAP编号
RGAP number
基因描述
Description
LOC_Os08g06110 MYB family transcription factor
LOC_Os08g06120 B3 DNA binding domain containing protein
LOC_Os08g06130 expressed protein
LOC_Os08g06140 no apical meristem protein
LOC_Os08g06150 retrotransposon protein
LOC_Os08g06160 retrotransposon protein
LOC_Os08g06170 berberine and berberine like domain containing protein
LOC_Os08g06180 reticuline oxidase precursor
LOC_Os08g06190 berberine and berberine like domain containing protein
LOC_Os08g06200 stomatin-like protein 2
LOC_Os08g06210 expressed protein
LOC_Os08g06220 transferase
LOC_Os08g06230 nucleolar GTP-binding protein 1
LOC_Os08g06240 MYB family transcription factor
第 6期 王晓雯等: 水稻白穗突变体 wp4的鉴定与基因精细定位 843
3 讨论
目前, 在水稻中已报道了 6个白穗突变体, 分别
为 wp1、wp2、wp(t)、wslwp、st-fon 和 wlp1。wp1
和 wp2 是较早报道的白穗突变体, 主要特征是成熟
期穗部白色, 叶片出现不同程度的白色条纹, 基因
分别位于第 7 和第 1 染色体上[6]。wslwp 与 wp1 的
表型类似, wp(t)则与 wp2 的表型一致, 二者的调控
基因也被分别定位在第 7 和第 1 染色体上, 其可能
互为等位突变体[8-9]。st-fon 除穗部白化和叶片出现
白色条纹外, 还表现内外颖的异常发育, 对基因尚
没有进行染色体定位[10]。wlp1除抽穗期穗部白化外,
四叶期之前叶片白化, 其后转绿[7]。与已报道的白穗
突变体相比, wp4的表型明显不同, 穗抽出后呈乳白
色 , 一直持续到灌浆后期 , 全生育期内叶片淡绿 ,
没有出现白化或白色条纹, 因此, wp4是一个新型白
穗突变体。
本研究中将 WP4 精细定位在水稻第 8 染色体
79 kb的物理范围内, 包含 14个注释基因, 其中, 仅
LOC_Os08g06220 编码蛋白具有叶绿体信号肽。在
水稻中, 约 4500个核基因编码蛋白具有叶绿体信号
肽, 这类蛋白多与叶绿体的发育相关[13]。如水稻花
叶白穗突变体 wlp1, 调控基因即编码一个靶向于叶
绿体的 50S 核糖体 L13 蛋白 [7]。因此 , 我们对
LOC_Os08g06220 进行了测序, 但野生型和突变体
之间没有发现碱基差异, 表明其不是目的基因。核
仁 GTP 结合蛋白存在于细胞核内, 具有高度的保守
性 , 在真核和原核生物中广泛存在 [14]。在酵母中 ,
NOG (nucleolar GTP-binding protein)与 TOR (target
of rapamycin)互作, 通过营养供应调节 60S 核糖体
前体的成熟[15]。通过线虫、酵母等真核生物的研究,
基本明确了 NOG 蛋白在真核生物核糖体形成中的
关键作用 [16-17]。 NbDER (Nicotiana benthamiana
Double Era-like GTPase)含有 2个重复的 GTP结构域,
参与叶绿体 rRNA 的剪切和核糖体的生物合成 ,
RNAi 导致烟草叶片黄化, 暗示 DER 在植物生长发
育中具有重要的功能[18]。LOC_Os08g06230 编码一
个核仁 GTP结合蛋白 NOG1, 但其是否是WP4的目
的基因, 以及植物中的NOG是否也具有类似真核生
物的功能, 尚需进一步的研究。
目前报道的基因 , 多具有一因多效性。如
hw-1(t), 三叶期之前白化 , 随后转绿 , 同时又表现
为矮化多蘖, 受单隐性基因调控[19]。突变体 wp4 除
穗部白化外, 另一个典型的特征是叶色黄绿。黄绿
叶是水稻一种常见的叶色变异, 目前已经鉴定了 10
多个相关突变体, 并克隆了 YGL1、YGL2、YGL138(t)
等调控基因, 这些基因在叶绿素合成和叶绿体发育
过程中起重要作用[20-22]。相对于叶片白化、花叶等
性状, 黄绿叶突变体的农艺性状尽管也受到了一定
的影响, 但影响较小, 是叶色标记利用的理想材料[23-25]。
本研究发现, wp4叶片尽管呈黄绿色, 但叶绿体结构
较为完整, 光合色素中仅叶绿素 a 的含量下降达显
著水平 , 农艺性状中 , 有效穗和结实率略有增加 ,
株高、穗长、穗粒数和千粒重则略有下降, 但均未
达到统计学上的差异水平。这表明 wp4 可作为标记
性状用于水稻的良种繁殖, 同时也暗示穗部光合作
用即使对水稻的产量性状具有一定的影响, 效应值
也较小。
4 结论
白穗突变体 wp4全生育期叶色黄绿, 抽穗灌浆
期内外颖呈乳白色, 穗轴颜色不变。叶片部位, wp4
的光合色素含量明显下降, 但仅叶绿素 a 与野生型
相比在统计学上达显著差异水平, 叶肉细胞的叶绿
体除基质片层略少且排列松散外, 结构基本完整。
颖壳中, wp4的叶绿素 a、叶绿素 b 和类胡萝卜素的
含量均极显著下降, 细胞内无明显的叶绿体结构。
突变体的农艺性状与野生型相比, 差异不显著。该
突变体受1对隐性核基因控制 , 利用1200株西农
1A/wp4的 F2隐性群体, 最终将 WP4精细定位在第8
染色体约79 kb的物理范围内, 包含14个注释基因。
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