全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(5): 862−867 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31071072)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 桑贤春, E-mail: sangxianchun@163.com
第一作者联系方式: E-mail: mrlswx126@126.com
Received(收稿日期): 2012-10-12; Accepted(接受日期): 2012-12-15; Published online(网络出版日期): 2013-02-19.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130219.1021.016.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00862
水稻早衰突变体 esl3的鉴定与基因定位
苗润隆 蒋钰东 廖红香 徐芳芳 何光华 杨正林 赵芳明 桑贤春*
西南大学水稻研究所 / 转基因植物与安全控制重庆市市级重点实验室 / 南方山地农业教育部工程研究中心, 重庆 400716
摘 要: 叶片早衰直接降低作物的光合作用、产量和品质。因此, 鉴定早衰突变体和研究其基因功能对于作物的遗
传改良具有重要的作用。esl3来源于水稻籼型恢复系缙恢 10号的 EMS诱变库, 苗期叶片中上部呈现褐化枯萎, 该特
征一直持续到植株成熟。与野生型相比, 突变体衰老部位叶绿素和光合速率极显著下降, 绿色部位光合色素和光合速
率则略有升高。农艺性状分析发现, 结实率无显著变化, 有效穗、穗长、穗粒数、千粒重、株高和干物质重则显著或
极显著下降。遗传分析表明, esl3叶片早衰枯死性状受 1对隐性核基因控制。利用 391株日本晴/esl3的 F2突变型单
株, 最终把 ESL3基因定位在第 5染色体 SSR标记 RM19085和 InDel标记 Ind05-2之间, 物理距离 91 kb, 包含 14个
注释基因, 为下一步调控基因的克隆和功能研究奠定了基础。
关键词: 水稻(Oryza sativa); 早衰; 基因定位; 光合速率
Identification and Gene Mapping of Rice Early Senescent Leaf (esl3) Mutant
MIAO Run-Long, JIANG Yu-Dong, LIAO Hong-Xiang, XU Fang-Fang, HE Guang-Hua, YANG Zheng-Lin,
ZHAO Fang-Ming, and SANG Xian-Chun*
Rice Research Institute of Southwest University / Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops /
Engineering Research Center of South Upland Agriculture, Ministry of Education, Chongqing 400716, China
Abstract: Leaf early senescence can directly decrease crop photosynthesis, yield and quality. Therefore, the identifications of
mutants with early senescence and its gene function play key roles in crop genetic improvement. A mutant with early senescent
leaf blades, named as esl3, was identified from an EMS-induced progeny in the restorer line Jinhui 10. The middle-upper leaf in
mutation displayed a brown and withered phenotype from seedling stage to maturity. Correspondingly, the chlorophyll content and
net photosynthetic rate declined in the abnormal leaves while enhanced in the normal green part of leaves compared with the wild
type. Agronomic traits, such as panicle number, panicle length, grains per panicle, 1000-grain weight, plant height and weight of
dry matter, were reduced significantly or very significantly except for seed setting rate as compared with those of wild type. Ge-
netic analysis showed the senescence was controlled by a recessive nuclear gene. Using 391 mutation individuals in a F2 genera-
tion of Nipponbare/esl3, ESL3 was mapped between SSR marker RM19085 and InDel marker Ind05-2 on the chromosome 5 with
physical distance 91 kb including 14 annotated genes. These results provide a foundation for the further gene cloning and func-
tional analysis of ESL3 gene.
Keywords: Rice (Oryza sativa); Early senescence; Gene mapping; Photosynthetic rate
叶片是光合作用的主要器官, 其衰老是植物叶
片发育的最后阶段, 自然状态下, 受遗传和外界因
子(如光照、干旱、病害和高温等)的共同调控[1]。叶
片自然衰老是一个细胞程序性死亡的过程, 是植物
进化过程中形成的适应性, 是植物生长发育过程中
必然要经历的生命现象[2]。在作物中, 叶片一旦早衰
将直接影响产量和品质, 因此, 是否早衰是作物育
种中一个重要的选择指标[3]。尽管目前已经进行了
大量的衰老生理研究 , 但其分子遗传机制还不清
晰。
植物叶片衰老是一个复杂的生物学过程, 涉及
叶绿体发育、叶绿素合成与代谢、细胞程序性死亡、
第 5期 苗润隆等: 水稻早衰突变体 esl3的鉴定与基因定位 863


激素等多种调控途径, 其中, 叶绿素降解途径与叶
片衰老之间的研究较为清晰[4]。叶片衰老涉及基因
类型多、参与细胞代谢途径也多, 而且, 在不同诱导
因素下, 调控基因及数量也会改变, 遗传机制极为
复杂[5]。Guo等[6]在拟南芥叶片自然衰老过程中, 检
测到 2491个基因在转录水平发生了改变。Graaff等[7]
研究发现, 自然衰老与暗处理和离体叶片衰老相比,
尽管大部分调控基因相同, 但是自然衰老基因是暗
处理和离体叶片衰老调控基因的 2 倍。在双子叶模
式植物拟南芥中, 目前已经克隆了多个衰老调控基
因, 如加速衰老基因 HYS1[8]、ATPG[9]、ATAPG9[10]
和 OLD1[11]等 , 延迟叶片衰老基因 ORE9[12]、
ORE1[13]、OIN3[14]和 ORE4[15]等, 根据基因功能可将
其分为生物大分子、转录因子(TFs)、激素和 RNAi
等。
水稻是我国乃至世界上最重要的粮食作物之一,
约一半以上的人口以其为主食, 同时也是单子叶模
式植物。研究水稻叶片早衰的分子机制, 不仅对水
稻的遗传改良具有重要的意义, 对其他禾本科作物
的生产也具有一定的指导意义。Liu 等[16]在水稻剑
叶自然早衰过程中检测到 815个上调 ESTs, 其中 533
个被基因芯片和测序的进一步证实, 表明水稻叶片
衰老也涉及多种代谢途径。NOE1 编码一个水稻过
氧化氢酶 OsCATC, 突变致使叶片中过氧化氢含量
增高, 激活了硝酸还原酶并促发 NO 的产生, 从而
诱导水稻叶片早衰[17]。突变体是基因定位和功能研
究的最直接有效的材料, 除已克隆的 NOE1[17]基因
外, 目前还鉴定了 psl1、psl2、psl3、pse(t)、esl2和
lad 等早衰突变体, 其调控基因分别定位在第 2、第
8、第 3、第 7、第 4和第 11染色体上[18-23]。
我们从籼型水稻恢复系缙恢 10 号的 EMS 诱变
库中, 鉴定了一个新型叶片早衰突变体 esl3。苗期开
始, 全展叶的叶片中上部即开始表现褐化死亡, 但
叶基部保持绿色, 该现象一直持续到成熟。调控基
因被定位在第 5染色体 91 kb的物理范围内, 与目前
已报道的衰老基因均不等位, 这为下一步基因的克
隆和功能研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
利用 EMS 诱变籼型水稻恢复系缙恢 10 号, 从
其后代中鉴定出一个叶片早衰突变体 esl3。三叶期
之前 , 表现不明显 , 三叶期之后 , 叶上部呈现褐化
衰老。连续种植 5 代, 表型均稳定遗传。配制日本
晴和 esl3杂交组合, 利用 F1和 F2群体进行遗传分析
和基因定位。F2群体的株行距为 20 cm×30 cm, 从苗
期开始定株调查叶色性状 , 调查时期分别为分蘖
期、抽穗期和灌浆期, 取灌浆期叶片进行基因分子
定位。
1.2 叶绿素含量测定
孕穗期, 在早晨 8:30—9:00, 取突变体衰老部
位和绿色部位, 同时取野生型的相应部位作对照。
采用 95%乙醇提取叶绿素, 分光光度计测其 470、
646和 663 nm的光吸收值。参照 Wellburn[24]的方法
换算出叶绿体各色素含量。
1.3 光合速率测定
孕穗期, 晴天上午 9:30—10:30, 取长势相对一
致的单株各 10 株, 利用 LI-6400 型便携式光合作用
测定仪分别测定 esl3 衰老和绿色部位的光合速率,
同时测量相应部位的野生型。测量时使用红、蓝光
源, 光强恒定为 1200 μmol m−2 s−1, 温度为 30 , CO℃ 2
浓度为空气中的浓度, 湿度为大气中的湿度[25]。
1.4 农艺性状调查
成熟后, 分别取 10 株突变株和野生株, 测定株
高、有效穗、穗长、穗粒数、结实率、千粒重、干
物质重等农艺性状; 同时测量倒一、倒二、倒三、
倒四等节间的长度。
1.5 DNA的提取
采用 BSA法筛选连锁标记, 从日本晴和 esl3的
F2群体中分别取 10株正常和突变单株, 剪取等量叶
片构建正常池和突变池。亲本和基因池的 DNA采用
CTAB 法提取[26], 采用碱煮法提取连锁分析 F2突变
型单株的 DNA[27]。
1.6 SSR分子标记分析
RM系列 SSR引物序列参照 http://www.gramene.
org/microsat。利用 victer9.0比对 9311和日本晴序列,
根据碱基差异设计 InDel标记。PCR体系 12.6 μL, 包
括 1.25 μL的 10×PCR buffer, 0.75 μL的 25 mmol L−1
MgC12, 0.5 μL 的 2.5 mmol L−1 dNTPs, 8.0 μL 的
ddH2O, 1.0 μL的 10 μmol L−1引物, 1.0 μL的模板
DNA和 0.1 μL的 5 U μL−1 Taq DNA聚合酶。PCR
程序为 94℃预变性 3 min; 94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃
1 min; 35个循环后, 再 72℃充分延伸 10 min。PCR
产物经 10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后, 快速
银染法并观察[28]。
864 作 物 学 报 第 39卷

1.7 遗传图谱的构建
作图群体中, 将具有日本晴带型的单株记为 A,
具有 esl3 带型的记为 B, 具有 F1带型的记为 H, 用
Mapmaker3.0 进行数据分析和作图[29], 用 Kosambi
函数[30]将重组率转化为遗传距离。
2 结果与分析
2.1 esl3的形态鉴定
esl3 突变体来源于籼型水稻恢复系缙恢 10 号的
EMS 诱变。田间种植情况下, 一叶期至三叶期, 与野
生型相比, 表型不很明显, 四叶期开始, esl3突变体的
叶片发育完全后(倒一全展叶), 叶尖即表现褐化死亡,
发育至倒二全展叶时, 叶中上部出现不同程度的枯萎
死亡, 尤其是叶尖和叶边缘, 而叶基部保持绿色, 该
性状一直持续到成熟。分蘖后期突变体和野生型植株
和叶片的衰老枯死如图 1所示。
esl3 的结实率无明显变化, 有效穗和穗长显著
降低, 穗粒数、千粒重、株高和干物质重则极显著
下降, 分别为野生型的 57.5%、90.1%和 76.1% (表
1)。与野生型相比, 突变体的穗长和穗颈节间下降幅
度达显著水平, 其余节间的下降幅度达极显著水平
(表 2), 但叶片长度无明显变化。

图 1 野生型(WT)和突变体 esl3分蘖期的植株形态
Fig. 1 Plant phenotype of the wild type (WT) and esl3 mutant
at the tillering stage
A: 野生型(WT)和突变体 esl3的植株; B和 C: 野生型(WT)和突
变体 esl3倒一全展叶的中上部和基部。
A: Plants of the wild type (WT) and esl3 mutant; B and C: The
middle-upper and basal parts of first fully expanded leaf blade in
the wild type and esl3 mutant.

表 1 野生型(WT)和 esl3的农艺性状分析
Table 1 Agronomic traits of the wild type (WT) and esl3 mutant
材料
Material
株高
Plant height
(cm)
有效穗
Panicles per
plant
穗长
Panicle length
(cm)
穗粒数
Grain number
per panicle
结实率
Seed setting
rate (%)
千粒重
1000-grain
weight
干物质重
Weight of dry
matter (g)
WT 109.7±2.17 8.2±0.45 26.2±1.10 172.5±4.23 89.1±1.35 26.3±0.48 63.96±1.68
esl3 83.5±2.70** 6.4±1.34* 23.2±1.89* 99.2±5.89** 85.9±3.41 23.7±0.54** 25.34±2.81**


图 2 突变体 esl3和野生型(WT)缙恢 10号各节间长
Fig. 2 Internode length of esl3 and wild type Jinhui 10
PL: 穗长; NL: 穗颈长; FL: 第 1节间长; SL: 第 2节间长; TL: 第 3
节间长; *在 0.05水平上差异显著; **在 0.01水平上显著差异。
PL: panicle length; NL: neck length of spike; FL: first internode length;
SL: second internode length; TL: third internode length. * Significantly
different at P<0.05; ** Significantly different at P<0.01.
2.2 esl3的叶绿素和光合速率变化
与始亲本缙恢 10号相比, esl3衰老部位的叶绿
素 a、叶绿素 b 和类胡萝卜素的含量分别下降了
81.5%、 90.7%和 76.0%; 绿色部位分别升高了
15.3%、6.2%和 10.3% (图 3)。突变体衰老部位的光
合速率极显著低于野生型, 绿色部位则极显著高于
野生型(图 4)。
2.3 esl3的遗传分析
田间种植情况下, 日本晴/esl3的 F1单株叶片均
正常, F2群体出现正常和叶片早衰枯死两种类型。分
蘖期、抽穗期和灌浆期植株叶片一直呈现早衰特征
的判定为突变型, 叶色无变化的判定为正常型。在
1672 株 F2群体中, 正常株 1281 株, 突变株 391 株,
二者比例符合 3︰1的孟德尔独立分配定律(χ2=2.32,
2
0.05,1χ = 3.84, 表明 esl3叶片早衰受 1对隐性核基因
调控。
2.4 ESL3基因的分子定位
选用 480 对均匀分布在水稻 12 条染色体上的
第 5期 苗润隆等: 水稻早衰突变体 esl3的鉴定与基因定位 865



图 3 孕穗期野生型(WT)和突变体 esl3衰老部位的光合色素含
量比较
Fig. 3 Photosynthetic pigment contents of the wild type and
esl3 mutant at booting stage
Chla: 叶绿素 a; Chlb: 叶绿素 b; Total Chl: 总叶绿素; Car: 类胡
萝卜素; WT: 野生型; esl3-d: 突变体叶片基部绿色部分; esl3-u:
突变体叶片上部衰老部分; 误差线: 色素含量的标准差。
Chla: chlorophyll a; Chlb: chlorophyll b; Total Chl: total chloro-
phyll; Car: carotenoids; WT: wild type Jinhui10; esl3-d: green part
of basal leaf blade in esl3; esl3-u: senescent part of upper leaf blade
in esl3; Error bars: standard deviation of the pigment contents.

图 4 孕穗期野生型(WT)和突变体 esl3的光合速率
Fig. 4 Photosynthetic rate of the wild type and esl3 mutant at
booting stages
WT: 野生型; esl3-d: 突变体叶片基部绿色部分; esl3-u: 突变体
叶片上部衰老部分; 误差线: 光合速率的标准差。
WT: wild type Jinhui10; esl3-d: green part of basal leaf blade in
esl3; esl3-u: senescent part of upper leaf blade in esl3; Error bars:
standard deviation of photosynthetic rate.

SSR 标记对日本晴和 esl3 进行多态性分析, 然后再
利用 120 对多态性引物分析正常基因池和突变基因
池。结果发现位于第 5染色体上的 SSR标记 RM3321
和 RM1054 在亲本之间和基因池之间均存在差异。
利用这 391株 F2突变型单株进行验证。初步将 ESL3
定位在 RM3321 和 RM1054 标记之间, 遗传距离分
别为 7.80 cM 和 6.25 cM。进一步在 RM3321 和
RM1054之间设计 SSR和 InDel标记, 其中 3对引物
在亲本之间呈现多态性。RM480 和 Ind05-2 (F:
5-TCTCTAGCTTCAAAGTTCTATCC-3; R: 3-GTC
AGATTTTAAAATTTAGGATT-5)分别有 12 个和 7
个交换株, 而 RM19085有 2 个交换株, 两侧的交换
株不同。因此, 最终把 ESL3基因定位在第 5染色体
Indel标记 Ind05-2和 SSR标记 RM19085之间, 物理
距离 91 kb (图 5)。根据日本晴序列, 在该区间内有
14个注释基因, 3个编码转座子蛋白, 3个编码未知
表达蛋白 , 其他分别编码磷脂酰丝氨酸合成酶、
L7/L12 核糖体蛋白、MATE efflux 蛋白、反抑制蛋
白、SNARE domain蛋白、MYB转录因子、ATP合
酶和微管蛋白。

图 5 ESL3基因在第 5染色体上的分子定位
Fig. 5 Molecular mapping of ESL3 on chromosome 5

3 讨论
衰老是植物生长发育过程中的必然阶段, 一般
发生在植物生长发育的最后时期, 受外界环境因素
和基因调控的影响。对植物衰老相关基因的研究表
明衰老过程具有复杂的调控网络[31], 其中一个非常
重要的途径是糖、蛋白质、叶绿素等大分子物质的
代谢调控。如在拟南芥中, SGR编码一个含有叶绿体
转运肽的蛋白, 通过调节叶绿素蛋白复合体的形成
和降解参与叶片衰老过程[32]; NYC1 和 NOL 编码叶
绿素 b 还原酶的 2 个亚基, 直接参与叶绿素 b 还原
酶复合体的形成[33-34]; PPH 调节脱镁叶绿(甲酯-)酸
的合成, 该基因的缺陷导致叶绿素降解困难, 从而
抑制叶片衰老[35]。
本研究发现的 esl3 突变体从苗期开始, 新叶完
全展开后, 叶尖就开始表现衰老, 至倒二全展叶状
态, 叶尖和叶缘部位已枯萎死亡, 该现象一直持续
866 作 物 学 报 第 39卷

到成熟。其表型与已报道的早衰突变体 psl1、psl2、
psl3、pse(t)、esl2和 lad均有明显的差别。psl1形态
特点是自苗期开始抽出心叶后, 抽出的叶片就开始
变黄衰老; psl2在抽穗前倒四叶开始衰老, 抽穗时倒
三叶开始衰老, 穗完全抽出后, 倒二叶开始变黄衰
老, 到灌浆期结束时剑叶完全衰老死亡; psl3是从第
6 叶开始表现衰老, 叶片由基部到上部衰老程度逐
渐加重; pse(t)的特点是在抽穗期首先在老叶上出现
褐色斑点, 接着整片叶黄化衰老, 到灌浆期叶鞘与
上层叶片也迅速黄化衰老; esl2表现为苗期正常, 孕
穗期开始才从叶尖和叶缘部逐渐黄化衰老, 而中下
部保持绿色不衰老[18-22]。lad 是我们先前从缙恢 10
号鉴定的一个早衰突变体, 除新抽叶保持正常绿色
外, 其余叶片的叶尖都逐渐变黄, 随后扩展到叶片
的 2/3, 最后叶片尖端约 1/4枯死[23]。
遗传分析和基因定位发现, esl3 受单隐性核基
因控制, 位于第 5 染色体 InDel 标记 Ind05-2 和
RM19085 之间, 物理距离约 91 kb, 包含 14 个注释
基因。3个编码转座子蛋白, 3个编码未知表达蛋白,
其他分别编码磷脂酰丝氨酸合成酶、L7/L12核糖体
蛋白、MATE efflux 蛋白、反抑制蛋白、SNARE
domain 蛋白、MYB 转录因子、ATP 合酶和微管蛋
白。其中, 对磷脂酰丝氨酸合成酶编码基因 LOC_
Os05g48060.1/SUI2 进行了初步的功能鉴定, Tos17
插入突变体表现为节间缩短、植株矮化, 基因过量
表达则促进节间伸长[36]。对另外 13个基因没有进一
步研究, 这表明 esl3 受一个功能未知的基因调控,
这为下一步基因的克隆和功能研究奠定了基础。
4 结论
突变体 esl3 是一个新型早衰突变体, 衰老部位
的叶绿素含量和光合速率极显著下降, 绿色部位的
叶绿素含量和光合速率相对野生型有所升高。其基
因被定位于第 5染色体, 物理距离约 91 kb, 共包含
14个注释基因。这为基因的进一步精细定位、基因
克隆和水稻早衰机制的研究奠定了基础。
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