全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(3): 390−396 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30871558)和江苏省农业科技自主创新资金项目[cx(13)3059]资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 郭旺珍, E-mail: moelab@njau.edu.cn
Received(收稿日期): 2013-07-03; Accepted(接受日期): 2013-10-29; Published online(网络出版日期): 2014-01-16.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140116.1700.012.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00390
一个棉花液泡转化酶基因的克隆与功能分析
徐文亭 王 诚 徐晓洋 牛二利 蔡彩平 郭旺珍*
南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 / 教育部杂交棉创制工程研究中心, 江苏南京 210095
摘 要: 棉纤维正常发育需要大量的蔗糖供应。转化酶是生物体内蔗糖代谢途径中的关键酶之一, 对转化酶基因的
结构和功能研究将有助于揭示复杂的棉纤维发育分子机制, 并为纤维品质改良提供优良的基因资源。本研究以棉纤
维突变体 im 和遗传标准系 TM-1 纤维发育中显著差异表达的 EST 序列(GenBank 登录号为 EY196825)为探针, 通过
电子克隆方法, 结合 cDNA 及基因组全长基因 PCR 扩增、测序验证, 克隆到一个棉花液泡转化酶基因 GhVacInv2a
(GenBank 登录号为 KF305322)。该基因 ORF 全长 1857 bp, 编码 618 个氨基酸, 与已登录的陆地棉 GhVacInv2 基因
(GenBank登录号为 FJ864677)序列一致性为 99% (E=0)。基因组序列分析表明, GhVacInv2a在二倍体棉种非洲棉和雷
蒙德氏棉中含 1 个拷贝, 在四倍体陆地棉和海岛棉中存在 2 个拷贝, 其中 GhVacInv2a 和 GhVacInv2 分属于 A、D 亚
组同源基因。该同源基因含 7个外显子, 6个内含子。Q-PCR分析表明, 该基因在花药中表达量最高, 在快速伸长的
纤维组织中优势表达。在 13~19 DPA的纤维中, 其在 TM-1中的表达水平极显著地高于 im突变体。开发 SNP标记, 将
GhVacInv2a基因定位在异源四倍体棉花第 3染色体上。标记与性状的关联分析显示, GhVacInv2a与纤维强度存在显
著相关(P=0.0087), 表明 GhVacInv2a在棉花纤维品质形成中可能发挥重要功能。
关键词: 棉花; 纤维发育; 液泡转化酶 2; 克隆; 功能分析
Cloning and Functional Analysis of GhVacInc2a Encoding Vacuolar Invertase
in Cotton
XU Wen-Ting, WANG Cheng, XU Xiao-Yang, NIU Er-Li, CAI Cai-Ping, and GUO Wang-Zhen*
State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement / Hybrid Cotton R&D Engineering Research Center, Ministry of Education,
Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: Cotton fiber development depends on a large supply of sugar. Invertase plays a central role in sucrose metabolism.
Structural and functional analysis of gene encoding invertase will conductively reveal the complex molecular mechanism of fiber
development, and also provide elite gene resources for improvement of cotton fiber quality. In the study, a novel gene encoding
vacuolar invertase was obtained by sillico cloning, based on a differentially expressed EST (GenBank accession number
EY196825) between G. hirsutum acc. TM-1 and im mutant, combined with reconfirmation of ORF information in transcriptional
and genomic level. BlastN showed that the gene shared 99% identity of GhVacInv2 reported previously (GenBank accession
number FJ864677), and designated as GhVacInv2a (GenBank accession number KF305322). GhVacInv2a contained an open
reading frame of 1857 bp that encoded a polypeptide of 618 amino acids, with seven exons and six introns at genome sequence.
GhVacInv2a comprised one copy in diploid cotton species G. herbaceum and G. raimondii, and two copies in tetraploid cotton
species G. hirsutum acc. TM-1 and G. barbadense cv. Hai 7124, with GhVacInv2a in A-subgenome and GhVacInv2 in
D-subgenome, respectively. Q-PCR expression analysis showed that the set of homoelogous genes performed the highest expres-
sive abundance in anther in comparison with other tissues. In developing fibers, it was predominantly expressed from fiber rapid
elongation stage, and there existed significant difference between TM-1 and im mutant during 13 to 19 days post anthesis (DPA)
in fiber tissues. Further, GhVacInv2a was located on chromosome 3 by developing subgenome-specific SNP marker, and the asso-
ciation analysis showed that there was a significant correction (P=0.0087) between GhVacInv2a and fiber strength, suggesting that
GhVacInv2a probably plays a key role in fiber qualities formation.
Keywords: Cotton; Fiber development; Vacuolar invertase 2; Cloning; Functional analysis
第 3期 徐文亭等: 一个棉花液泡转化酶基因的克隆与功能分析 391


在大多数植物中, 光合作用固定的碳源常以蔗
糖形式转运, 利用蔗糖从源叶中输送能量和碳到植
物发育的各个组织中。转化酶在植物碳源利用上起
着关键调节作用 , 它将蔗糖分解为葡萄糖和果糖 ,
随后这 2 种己糖参与多个生物代谢途径[1]。根据最
适 pH值, 转化酶可被分为 3种类型。中性和碱性转
化酶的最适 pH 为 7.0~7.8, 在多种组织中表达。酸
性转化酶的最适 pH 值在 4.5~5.0 之间, 可进一步细
分为细胞壁型(CIN)和液泡型(VIN)[1-2]。葡萄[3]、马
铃薯[4]、番茄[5]等物种中研究显示, 液泡转化酶(VIN)
在决定细胞碳源分配中起着重要的调节作用。目前
普遍认为转化酶通过调节细胞内的渗透势来参与细
胞发育。因为 VIN水解 1分子蔗糖变成 2分子的己
糖 , 增加了渗透势调节物质 , 胞内膨压加大 , 有利
于驱动细胞扩张[6]。但也有报道认为, 在糖类物质并
非是主要渗透调节物的组织细胞中, VIN 可能是通
过作用于细胞壁的延伸来促进细胞扩张[7]。其他研
究也表明 VIN还参与诸如植物生长素、逆境刺激等
一系列应答反应[6,8-9]。
棉纤维是从胚珠外表皮发育而来的单细胞无分
支结构。纤维的发育可分为起始、伸长、次生壁加
厚及脱水成熟 4 个相互重叠的阶段[10]。因在发育过
程中表现出的优良特性, 棉纤维被视为研究细胞发
育的理想模式系统 [11]。目前 , 棉花上一共报道了
GhVIN1[12]、GhVacInv1和 GhVacInv2 [13] 3个 VIN基
因。其中, GhVIN1是与棉纤维伸长相关的 VIN基因,
它的表达水平与纤维伸长速率相吻合。抑制和过表
达 GhVIN1分别会减缓和促进纤维伸长。将 GhVIN1
转入拟南芥中, 该基因能补偿拟南芥 VIN 插入突变
体的表型 , 并能促进野生型拟南芥根伸长。而
GhVacInv1 和 GhVacInv2 的不同组织器官表达特征
表明, 这 2 个基因均在纤维伸长的细胞中优势表达,
可能参与纤维细胞的扩展、伸长。
本研究基于一个在棉纤维突变体 im和遗传标
准系 TM-1 纤维发育中显著差异表达的 EST 序列
(GenBank 登录号为 EY196825)为探针 , 利用电子
克隆 , 结合 cDNA 及基因组全长基因 PCR 扩增、
测序验证 , 获得一个与棉花纤维发育相关的液泡
转化酶基因 GhVacInv2a。进一步对其结构、功能
及分子进化特征系统研究 , 以期为深入阐明棉纤
维发育的分子机制 , 并用于纤维品质改良提供基
因资源。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2010—2012年于南京农业大学江浦试验站种植
陆地棉遗传标准系 TM-1 (G. hirsutum acc. TM-1)和
im纤维不成熟突变体 (G. hirsutum acc. im, 次生壁
发育缺陷的纤维突变体) 材料。在植株生长盛花期,
分别采集 2个材料开花后 10、13、16、19、22、25
DPA (days post anthesis)的纤维, 于液氮中速冻, −70℃
冰箱保存。根、茎和叶样品取自有五、六片真叶的
棉花幼苗。其他二倍体A染色体组的阿非利加棉 (G.
herbaceum var. africanum)、D染色体组的雷蒙德氏
棉 (G. raimondii)和异源四倍体栽培棉种海岛棉海
7124 (G. barbadense cv. Hai7124)均种植于南京农业
大学牌楼实验基地。
1.2 基因克隆及氨基酸序列分析
基于遗传标准系 TM-1和棉纤维突变体 im竞争
杂交芯片结果 , 获得一个在 TM-1 中优势表达的
EST序列(GenBank登录号为 EY196825)。以该 EST
序列为探针 , 通过 BlastN 比对程序 , 搜索陆地棉
EST数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。将获得的
EST 序列用 CAP3 程序 (http://pbil.univ-lyon1.fr/
cap3.php)拼接后形成 Contig, 然后以 Contig为探针,
再次使用 BlastN 比对程序检索陆地棉 EST 数据库,
直至检出的 Contig不能再延伸。对电子拼接获得的
序列进行 ORF预测, 参考 BlastX结果完成其命名。
利用电子拼接的序列信息设计引物, 通过 RT-PCR
和 PCR 方法分别扩增转录组 cDNA 和基因组 DNA,
进行目标基因序列验证及不同棉种同源基因克隆分
析。表 1 为本研究中涉及的所有引物信息。由南京
金斯瑞生物科技有限公司完成所有引物合成和
DNA序列测定。
将获得的 cDNA 全长序列运用 NCBI 的 CD 搜
索 工 具 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/
wrpsb.cgi)进行编码产物保守结构域分析。利用
ExPASy的 Compute pI/Mw tool (http://us.expasy.org/
tools/pi_tool.html)预测编码氨基酸的等电点和分子
量大小, 运用 SignalP 程序对由 GhVacInv2a 基因编
码的氨基酸序列进行 N端信号肽结构的预测。
使用 HMMER3.0程序[14]根据 GhVIN2基因的保
守结构域搜索 DOE Joint Genome Institute释放的棉
花雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)蛋白数据库
(http://www.phytozome.net/cotton.php), 获得雷蒙德
氏棉D基因组中与GhVacInv2a基因功能类似的家族
392 作 物 学 报 第 40卷


表 1 本研究所用引物
Table 1 Primer pairs used in this study
基因
Gene
引物
Primer
引物序列
Sequences information (5′–3′)
用途
Purpose
Y8991F CGGTGGTGTGAAGAAGCCTCAT His3
Y8991R AATTTCACGAACAAGCCTCTGGAA
内标对照
Reference gene as control
W3064F GGAGAACCACCGATTCATTAC
W3064R GGGTGTCCATTTATCCGTTAT
W3065F GATAACGGATAAATGGACACC
W3065R ACATATTTATCCCACCCTCAC
扩增 ORF所用的两套 RT-PCR巢式引物
Two sets of RT-PCR nested primers for ORF amplification
W2587F GAGAACCACCGATTCATTACC
W2587R GATCAGACACGTTGGCAGGAT
W2588F GTCTGTGCAGGTACAAAATCT
W2588R ACATATTTATCCCACCCTCAC
扩增全长基因所用的 2套巢式引物
Two sets of nested primers for amplifying the full length of
the gene
W591 F GCAACTGGAGTAAATGTGAAGG
W591 R ACAGAGGCAACCAAGACA
Q-PCR分析
Q-PCR analysis
W5151F AGATCTTTACGTACTTAGGTTTTTCACCCCCACT
GhVIN2
W5152R TACGGACCATTTGGCCTCCTGGTTA
用于 GhVacInv2a染色体定位的 SNP引物
SNP primers for chromosome location of GhVacInv2a

基因。用 ClustalX 1.8 软件对本研究克隆的
GhVacInv2a 基因与棉花、拟南芥、杨树、葡萄等物
种的转化酶基因编码产物进行多重序列比对 , 用
MEGA5 (http://www.megasoftware.net/)绘制序列的
进化树。
1.3 总 DNA和 RNA的提取
利用改进的热硼酸法提取 13、16、19、22 和
25 DPA 的纤维组织 RNA[15], 采用 CTAB 酸酚法[16]
提取 5~6 片真叶棉花的根、茎和叶总 RNA; 采用
CTAB法[17]从新鲜幼嫩的叶片提取 DNA。
1.4 实时荧光定量 PCR
利用实时荧光定量 PCR 分析 GhVacInv2a 同源
基因在 TM-1 和 im 突变体不同组织器官及 13~25
DPA纤维中的基因表达水平。共设 3次生物学重复。
以棉花 histon 3基因(GenBank登录号为 AF024716)
为内参照对表达数据进行标准化。使用罗氏公司
Light Cycler Fast Start DNA Master SYBR Green I Kit
(Roche), 应用生物公司 AB7500 Real-time PCR检测
系统(Applied Biosystems)进行 PCR扩增并记录荧光
信号值。定量 PCR程序为 95℃ 10 min; 95℃ 15 s,
60℃ 1 min, 40个循环; 以 0.2℃ s–1的速度从 65℃
逐渐升至 95℃来制作溶解曲线。为了确保定量 PCR
结果的可信度, 对 GhVacInv2a 基因与内参照 histon 3
基因均制作标准曲线来确定基因的扩增效率, 确保
标准曲线 R2>0.98, 扩增效率在 90%~105%之间。使
用 Pfaffl 方法分析基因在不同材料和发育时期的相
对表达水平[18]。
target
reference
(control-sample)
target
(control-sample)
reference
(1 )
Ratio=
(1 )
Ct
Ct
E
E
Δ
Δ
+
+
其中, E: 扩增效率; target: 目标基因; reference: 内
参基因; control: 对照; sample: 分析样品。
1.5 基因定位及标记性状关联分析
根据该基因在遗传标准系 TM-1和海岛棉海
7124中基因组序列的差异, 开发 SNP 标记, 利用本
实验构建的包含 138个单株的 [(TM-1×海 7124)×
TM-1] BC1作图群体进行基因初步定位 [19]。根据
[(TM-1×海7124)×TM-1] BC1作图群体GhVacInv2a基
因的定位结果, 利用以 TM-1为背景渐渗海7124染色
体片段的单片段置换系 CSIL028与 im突变体构建的
F2作图群体 [20], 对 GhVacInv2a 基因进一步精细定
位。并结合 F2:3家系纤维品质及产量性状进行基因与
性状的关联分析。
2 结果与分析
2.1 GhVacInv2a 基因 cDNA 全长序列的获得及
其分析
在陆地棉遗传标准系 TM-1 (G. hirsutum acc.
TM-1)和不成熟纤维突变体(im)纤维发育竞争杂交
芯片上, 选取一个 TM-1 材料优势表达的 EST 序列
(GenBank登录号为 EY196825), 以该 EST序列为种
子序列在 NCBI 棉花数据库中进行比对。通过电子
克隆方法拼接获得一个最长为 2113 bp的序列。根据
电子延伸的序列设计 PCR引物(表 1), 以 TM-1开花
第 3期 徐文亭等: 一个棉花液泡转化酶基因的克隆与功能分析 393


后 10 d的纤维组织 cDNA为模板, 扩增出长为2003 bp
的 cDNA 序列, 测序验证和原电子拼接序列一致。
生物信息学分析显示, 该序列与已报道的陆地棉液
泡转化酶 GhVacInv2 基因 (GenBank 登录号为
FJ864677)在核苷酸和蛋白水平上均有 99%的一致
性。进一步序列比对发现该基因与蓖麻 (Ricinus
communis)的转化酶(β-果糖呋喃苷酶)、木薯(Manihot
esculenta)的液泡转化酶分别具有 74%和 73%的较高
同源性。因此, 参照其在棉花中同源基因的命名将该
基因命名为GhVacInv2a (Gossypium hirsutum VacInv2a;
GenBank 登录号为 KF305322)。GhVacInv2a 基因
ORF 长为 1857 bp, 编码 618 个氨基酸。用 Expasy
pI/Mw程序对该基因编码氨基酸一级结构分析发现,
该基因等电点为 5.25, 分子量为 69.2 kD。根据 NCBI
CDS (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)分
析 , 其编码的氨基酸残基含有 GH32_B_ Fructosi-
dase-motif, 在 100~420 氨基酸之间有属于 GH43_
62_32_68superfamily 保守域。运用 SignalP 程序对
该基因的氨基酸序列分析 , 发现 N 端有信号肽序
列 , 预测在 49~50 位氨基酸之间裂解。推测该基因
是一个蛋白前体 , 它在被合成之后将运输到液泡
中。
2.2 GhVacInv2a 同源基因在不同棉种基因组序
列分析
利用表 1中设计 2套巢式 PCR引物, 分别扩增
TM-1、海 7124 以及与其祖先种亲缘关系最近的二
倍体棉种阿非利加棉和雷蒙德氏棉基因组 DNA, 将
获得的 PCR 产物回收、连接、转化, 随机挑选多个
阳性克隆测序并序列比对分析, 获得该基因在二倍
体和四倍体棉种中的基因序列。运用在线软件
GSDS (Gene Structure Display Server, http://gsds.cbi.
pku.edu.cn/chinese.php)对基因结构进行分析 , 该基
因包含 7个外显子, 6个内含子。系统进化分析表明
(图 1), 该基因在四倍体棉种中形成 A亚组和D亚组
两大分支, 可明确追溯到其祖先来源, 说明在四倍
体棉种中来源于 A亚组与 D亚组重复基因是独立进
化的。序列比对发现, 本文克隆的 GhVacInv2a基因
属于 A 亚组 , 前人报道的陆地棉转化酶的
GhVacInv2属于 D亚组。
2.3 GhVacInv2a基因的分子进化分析
为进一步明确GhVacInv2a与已报道的棉花和其
他植物中亲缘关系相近的基因间进化关系 , 使用
HMMER3.0 软件在雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)
基因组(http://www.phytozome.net/cotton.php)中发现

图 1 GhVacInv2a类同源基因在不同棉种中的系统进化
Fig. 1 Phylogenetic analysis for GhVacInv2a orthologs in four
cotton species
A: 阿非利加棉; D: 雷蒙德氏棉; TM-1_At: TM-1的 A亚组;
TM-1_Dt: TM-1的 D亚组; H7124_At: 海 7124的 A亚组;
H7124_Dt: 海 7124的 D亚组。GhVIN2代表 GhVacInv2a。
A: G. herbaceum L. var. africanum; D: G. raimondii; TM-1_At: A
subgenome of G. hirsutum acc.TM-1; TM-1_Dt: D subgenome of G.
hirsutum acc.TM-1; H7124_At: A subgenome of G. barbadense cv.
Hai7124; H7124_Dt: D subgenome of G. barbadense cv. Hai7124.
GhVIN2: abbrevation for GhVacInv2a.

14个与 GhVacInv2a功能类似的转化酶基因。同时从
NCBI网站中搜索了陆地棉(Gossypium hirsutum)、葡
萄 (Vitis vinifera)、蓖麻 (Ricinus communis)、杨树
(Populus trichocarpa)等植物中与GhVacInv2a相似性
较高的基因, 与本研究克隆的 GhVacInv2a进行氨基
酸的多重序列比较和进化树分析。结果表明该进化
树可分为两大类, 第 1 类为细胞壁转化酶和水解酶
家族基因 ; 第 2 类为液泡转化酶 ; 本实验克隆的
GhVacInv2a 属于第 2 类, 与已报道的陆地棉液泡转
化酶 2 (GhVacInv2)同源性最高, 其次与蓖麻的转化
酶(β-果糖呋喃苷酶)、葡萄液泡转化酶 1也有较高同
源性。
2.4 GhVacInv2a的表达分析
分别提取 TM-1 中根、茎、叶、花瓣、花药、
不同发育时期纤维样品的 RNA, 将其反转为 cDNA,
利用实时荧光 PCR (Q-PCR)扩增, 完成该基因在不
同组织器官的表达分析。结果表明, GhVacInv2a在花
药中的表达量最高, 其次为花瓣, 在根和茎中表达
水平非常低。在纤维快速伸长期 10DPA 优势表达,
在纤维伸长与次生壁加厚重叠期表达水平也较高 ,
到纤维发育 19DPA 后表达水平显著降低(图 3)。说
明该基因主要在纤维发育的伸长及次生壁加厚早期
发挥作用。
进一步分析(图 4)显示, GhVacInv2a在 TM-1和
im 突变体中的基因表达模式类似, 但表达丰度有显
著差异。尤其在 13、16、19 DPA, GhVacInv2a在 TM-1
中的表达水平分别比 im突变体中高出 28.8、13.4和
8.5 倍。暗示在纤维发育过程中, GhVacInv2a 在 im
394 作 物 学 报 第 40卷



图 2 来源不同植物 GhVacInv2a同源基因系统进化分析
Fig. 2 Phylogenetic analysis of GhVacInv2a orthologs in different plant species
Vv: Vitis vinifera; Pt: Populus trichocarpa; Rc: Ricinus communis; Gorai: Gossypium raimondii; Gh: Gossypium hirsutum;
GhVIN2: abbrevation for GhVacInv2a.


图 3 GhVacInv2a基因在 TM-1不同组织器官中表达水平
Fig. 3 Relative expression level of GhVacInv2a in different
tissues and organs in TM-1
R、S、L、P、A分别代表 TM-1中根、茎、叶、花瓣、花药组
织, 0代表 0 DPA的胚珠, 10、13、16、19、22、25分别代表 10、
13、16、19、22、25 DPA的纤维组织。
R, S, L, P, A indicate root, stem, leaf, petal and anther tissues in
TM-1, respectively. 0 indicates ovules at 0 DPA, and 10, 13, 16, 19,
22, 25 indicate fibers at 10, 13, 16, 19, 22, 25 DPA, respectively.

图 4 GhVacInv2a在 TM-1和 im不同纤维发育期的表达水平
Fig. 4 Relative expression level of GhVacInv2a in different
fiber developmental stages of TM-1 and im
13、16、19、22、25分别代表 13、16、19、22、25 DPA的
纤维组织。a和 A分别表示 0.05和 0.01
显著水平上的差异。
13, 16, 19, 22, 25 indicate fibers at 13, 16, 19, 22, 25 DPA,
respectively. “a” and “A” indicate singnificant difference at 0.05
and 0.01 levels, respectively.
第 3期 徐文亭等: 一个棉花液泡转化酶基因的克隆与功能分析 395


突变体中的极显著低水平表达, 可能与 im突变体的
次生壁发育缺陷密切相关。
2.5 GhVacInv2a 基因的染色体定位与标记性状
关联分析
根据 GhVacInv2a 基因在 TM-1 和海 7124 棉种
间的 SNP 位点差异, 开发 SNP 引物扩增作图群体
[(TM-1×H7124)×TM-1]BC1, 根据群体多态性[19], 初
步将 GhVacInv2a定位到棉花异源四倍体第 3染色体
上。进一步利用以 TM-1 为背景渐渗海岛棉海 7124
第 3染色体片段的单片段置换系 CSIL028与 im突变
体构建的 F2 群体 , 根据群体多态性精细定位 , 将
GhVacInv2a 定位于标记 GhPEL 与 NAU8256 之间,
分别相距 1.3 cM和 0.3 cM。
为了进一步明确 GhVacInv2a 对纤维品质性状
的影响, 结合 CSIL028 × im F2:3家系纤维长度(FL)、
纤维强度(FS)、马克隆值(Mic)、伸长率(FE)、整齐
度(FU)、短纤维指数(SFI)、成熟度(Mat)和衣分(LP)
7 个纤维品质性状和 1 个产量性状进行标记与性状
关联分析[20]。由于 CSIL028 × im F2群体纤维品质性
状和衣分表型显著受 im突变基因影响, 先将分离群
体按纤维表型分为正常与突变两类, 然后再分别进
行单标记关联分析。在群体表型为正常类型的 243
个单株中, 海岛棉纯合/杂合纤维强度基因型均值为
32.54 cN tex–1, 而陆地棉纯合基因型均值为
31.30 cN tex–1, 该基因与纤维强度存在极显著相关
(P=0.0087), 说明 GhVacInv2a 在棉花纤维强度的形
成中可能发挥重要功能。
3 讨论
液泡转化酶(VIN)将液泡中的蔗糖水解为葡萄
糖和果糖来调节细胞内蔗糖的浓度。许多研究报道
VIN基因在快速扩张的组织细胞, 如马铃薯块茎[21]、
胡萝卜根 [22]及发育中的玉米籽粒 [23]中有较高的表
达丰度或酶活性。VIN 参与调控果实及贮藏器官细
胞内糖组分比例[4,24-26]。通过调节渗透势 VIN参与调
控细胞伸长与组织扩增[12,22,27]。研究显示 VIN 还响
应逆境和激素信号[21,28-32]。
本研究从棉纤维中克隆了一个编码液泡转化酶
的 cDNA全长基因 GhVacInv2a, 它与 Taliercio等[13]
报道的陆地棉液泡转化酶基因 GhVacInv2 有很高的
相似性。基因表达分析显示 GhVacInv2a 除了在花
药、花瓣中有很高的表达量外, 在快速伸长的纤维
中具有较高的表达丰度, 在纤维伸长与次生壁加厚
重叠期表达水平也较高, 而在起始和次生壁加厚期
的纤维中则维持极低的表达水平。和对照 TM-1 相
比, im突变体 13~25 DPA的纤维中 GhVacInv2a始终
维持一个低的表达水平。特别是在 13~19 DPA的纤
维中, im突变体中 GhVacInv2a的表达量比 TM-1中
的低 8.5~28.8 倍, 暗示 2 个材料在纤维伸长阶段可
能存在不同的蔗糖利用水平。有研究报道 VIN 也会
受到胞内糖浓度的反馈调控[31,33]。我们推测在 im突
变体纤维中存在糖组分比例失衡, 细胞中没有多余
的蔗糖可被转运至液泡中临时存储, 受液泡内糖浓
度的反馈调控, im 突变体纤维细胞中仅需维持一个
低的 VIN活性水平就可满足液泡中蔗糖代谢。
异源四倍体中 GhVacInv2a定位于第 3染色体上,
与果胶裂解酶基因 GhPEL相距 1.3 cM, 与 im基因相
距约 10 cM。利用基于群体的 QTL分析, Wang等[20]
在该区间内检测到几个纤维品质显著相关 QTL。因
此, GhVacInv2a, GhPEL与 im基因之间是否存在某
种调控作用有必要进一步的研究。
GhVacInv2a 与棉纤维强度存在极显著相关, 暗
示 GhVacInv2a可能参与棉纤维强度的形成。纤维强
度是棉花重要的纤维品质性状, 属于数量性状, 其
形成机理较复杂。目前, 在棉花上尚未有鉴定分离
控制纤维强度基因的报道。GhVacInv2a可能参与纤
维次生壁发育过程中的蔗糖转化, 与纤维强度及纤
维品质密切相关。然而, GhVacInv2a 在纤维发育中
的确切作用, 特别是在次生壁发育缺陷的 im突变体
中 GhVacInv2a在纤维发育过程中扮演的角色, 以及
该基因与 im 基因在纤维发育通路中的关系值得进
一步深入研究。
4 结论
从遗传标准系 TM-1 中克隆了一个编码液泡转
化酶的 GhVacInv2a。该基因包含 7个外显子和 6个
内含子, ORF全长 1857 bp, 编码 618个氨基酸。在
二倍体棉种阿非利加棉和雷蒙德氏棉基因组中各含
1个拷贝, 在四倍体陆地棉、海岛棉基因组中存在 2
个拷贝 , 本文克隆的 GhVacInv2a 和前人报道的
GhVacInv2 分属于 A、D 亚组同源基因。利用 SNP
标记将 GhVacInv2a 定位于第 3 染色体上。
GhVacInv2a 在花药中表达量最高, 在快速伸长阶段
的纤维细胞和纤维伸长与次生壁加厚重叠期优势表
达。13~19 DPA的纤维中, GhVacInv2a在 TM-1中表
达水平极显著高于 im 不成熟纤维突变体。
396 作 物 学 报 第 40卷


GhVacInv2a与纤维强度存在极显著相关。推测该基
因功能与纤维次生壁发育过程中的蔗糖转化有关。
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