全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(6): 844849 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31271628)资助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31271628).
* 通讯作者(Corresponding author): 李召虎, E-mail: lizhaohu@cau.edu.cn, Tel: 010-62733049
第一作者联系方式: E-mail: muc320@163.com
Received(收稿日期): 2016-01-02; Accepted(接受日期): 2016-03-14; Published online(网络出版日期): 2016-03-21.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160321.1056.012.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00844
水培条件下病毒诱导棉花基因沉默体系的建立及优化
穆 春 周 琳 李茂营 杜明伟 张明才 田晓莉 李召虎*
植物生长调节剂教育部工程研究中心 / 中国农业大学农学院, 北京 100193
摘 要: 以国欣棉 3号为材料, 以棉花 GhCLA1为指示基因, 探讨了生长温度、重悬液浓度、注射时间、品种等对水
培棉花 pTRV介导的 VIGS沉默效率的影响。在 24℃条件下, 出苗后 3~5 d内注射能得到较高沉默效率, 重悬液浓度
对沉默效率没有影响; 同时以注射 pTRV-GFP 作为空白对照可以消除插入片段对植株生长的影响, 减小对照误差;
水培与土培方式相比能更快更早出现沉默表型, 缩短试验周期, 并能诱导不同品种棉花材料 GhCLA1 基因沉默; 利
用水培棉花TRV-VIGS体系, 成功抑制了棉花GhCTR1基因的表达, 与对照株相比, 抑制后的棉花植株出现矮化表型,
说明水培棉花 TRV-VIGS体系建立在棉花研究中的广谱利用性。
关键词: 棉花; VIGS; GhCLA1; 水培
Establishment and Optimisation of Virus-Induced Gene Silencing in System
Hydroponic Cotton
MU Chun, ZHOU Lin, LI Mao-Ying, DU Ming-Wei, ZHANG Ming-Cai, TIAN Xiao-Li, and LI Zhao-Hu*
Engineering Research Center of Plant Growth Regulator, Ministry of Education / College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural Uni-
versity, Beijing 100193, China
Abstract: Using GhCLA1 as a marker gene and cotton variety Guoxinmian 3 plants as material, we aimed to explore effects of
temperature, syringe-infiltrated concentrations and time, cultivation patterns, and cotton varieties on efficiency of tobacco rattle
virus (TRV)-induced gene silencing (VIGS) under hydroponic condition. The results showed that higher silencing efficiency was
induced by syringe-infiltrated time at 3 to 5 days after emergence and optimum growth temperature at 24℃ under hydroponic
condition, but syringe-infiltrated concentrations could not affect VIGS silence efficiency. Moreover, pTRV-GFP as null fragment
could alleviate the adverse effect of inserted fragment for plant growth. Silencing phenotype could be visible earlier in hydropon-
ics culture than in soil culture, and the experimental period was significantly shortened under hydroponic condition. In addition,
GhCLA1 could be silenced in all tested varieties (lines) under hydroponic condition. Cotton plants with silenced GhCTR1 were
severely dwarfed, which indicated TRV-VIGS system can be applied widely in hydroponic cotton.
Keywords: Cotton; VIGS; GhCLA1; Hydroponic
病毒诱导的基因沉默 (virus-induced gene si-
lencing, VIGS)作为一种快速的基因沉默技术已广泛
用于拟南芥[1]、烟草[2]、大豆[3]等植物基因功能的研
究。携带部分病毒基因组和目的基因片段的 T-DNA
通过农杆菌侵染被释放到植物宿主体内后, 能够特
异性地攻击宿主体内的同源 mRNA, 使植物体内特
异同源目的基因受到不同抑制, 最终导致植株局部或
整体表现出该基因功能丧失或降低的相应表型[4-5]。目
前, VIGS技术在研究棉花基因功能上已开始广泛应
用, Gao等[6]利用VIGS技术对棉花抗黄萎病相关基因
进行了深入研究; 王丽等[7]通过沉默棉花 GhCPS 基
因, 探究了 GhCPS 对植物激素和植株幼苗光合能力
的影响; 王心宇等[8]利用 TRV-VIGS 体系成功抑制
了棉花 GhMAPKKK基因的表达, 验证了 GhMAPKKK
基因在抗黄萎病过程中的作用。随着棉花四倍体数
据库的释放, 大量未知基因有待发掘和鉴定, 若能
第 6期 穆 春等: 水培条件下病毒诱导棉花基因沉默体系的建立及优化 845


利用棉花 cDNA基因文库并使其与 VIGS技术结合,
便可通过敲除基因功能筛选参与特定生理生化反
应或抗逆反应的功能基因, 加速棉花基因组功能的
研究。
尽管 VIGS 技术在棉花上已得到成功应用, 但
上述研究都是在土培方式下进行 , 试验周期较长 ,
后期利用 VIGS 技术进行文库筛选需要耗费大量时
间。若能在水培棉花上进行 VIGS 基因功能的研究
及文库的筛选, 可大大缩短试验周期, 缩短棉花基
因组功能研究的时间成本。由于 VIGS基因沉默效率
依赖于病毒入侵植物体的能力和较高的复制水平[9]。
因此, 与病毒积累相关的因素如注射植株的生长时
期、植株的生长环境、农杆菌的浓度、载体等都有
可能影响病毒诱导的基因沉默效率。本试验以
GhCLA1 为指示基因 , 利用已构建好的 pTRV-
GhCLA1 沉默载体, 以棉花为材料, 对水培条件下
棉花 VIGS 基因沉默体系进行了探索和优化, 并成
功抑制了乙烯负调控因子 GhCTR1 的表达, 验证了
该体系的可行性, 为后期快速筛选目标基因、研究
基因功能奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料培养
陆地棉(Gossypium hirsutum L.)品种国欣棉 3号
由河北省河间市国欣农村技术服务总会提供。
1.1.1 水培 将种子种于发芽盒, 出苗次日移植
至Hoagland营养液中。培养室光照 /黑暗时长为14
h/10 h, 相对湿度为60%, 每7 d换一次营养液。
1.1.2 土培 将种子播在装有营养土∶蛭石(w/w)
= 1 1∶ 的花盆中, 保持土壤湿润, 温度为24℃, 光照
保持不变。
1.2 农杆菌介导的 VIGS基因沉默
TRV为双粒RNA病毒, 因此需要二元病毒载体
共侵染棉花 , 质粒 pTRV-GhCLA1、 pTRV-GFP、
pTRV-RNA2和 pTRV-RNA1由美国德州农工大学
(Texas A&M University)单立波教授惠赠。分别将
pTRV-GhCLA1、pTRV-GFP、pTRV-RNA2和pTRV-
RNA1质粒转化农杆菌GV3101, 挑取单克隆至 5
mLYEP (含25 mg L–1庆大霉素和50 mg L–1卡那霉素)
液体培养基中, 在200转 min–1摇床上28℃培养过夜,
然后取上述菌液按1︰50比例分别加至含终浓度为
10 mmol L–1的MES和20 μmol L–1的乙酰丁香酮50
mL的YEP (含25 mg L–1庆大霉素和50 mg L–1卡那霉
素) 培养基中, 28℃摇床上200转 min–1摇菌过夜。次
日离心收集菌体沉淀 (6000转 min–1, 10 min), 用重
悬液 (10 mmol L–1的MES、200 μmol L–1的乙酰丁香
酮及10 mmol L–1的MgCl2)重悬, 室温放置3~4 h后,
将含pTRV-GhCLA1和pTRV-RNA1的两种重悬菌液等
体积混合, 用注射器按压棉花叶子的背面以侵染。
1.3 试验设计
1.3.1 棉花培养温度及菌体重悬浓度 在水培条
件下, 按1.2菌体培养及注射方法, 将注射后的棉花
幼苗分别放置昼夜温 20 /18℃ ℃、 24 /20℃ ℃、
28 /20℃ ℃条件下培养, 每组温度条件下分别设置菌
体浓度OD600值为0.8和1.5, 光照和湿度保持不变。
1.3.2 棉花幼苗注射时间 在水培条件下, 按1.2
菌体培养及注射方法, 设置在出苗后的3、5、7、9 d
进行注射 , 注射菌体OD600值为 1.5, 并在昼夜温
24 /20℃ ℃条件下培养, 光照和湿度保持不变。
1.3.3 试验对照设置 按1.2菌体培养及注射方
法 , 将 pTRV-RNA1重悬液分别与 pTRV-RNA2、
pTRV-GFP重悬液混合, 在出苗后的第3天注射棉花
子 叶 , 注 射 菌 体 OD600 值 为 1.5, 并 在 昼 夜 温
24 /20℃ ℃条件下培养, 光照和湿度保持不变。
1.3.4 栽培方式 按1.1所述栽培方法分别对棉
苗水培和土培, 并按1.2菌体培养及注射方法, 在棉
花出苗后的第3天注射, 注射菌体OD600值为1.5, 培
养在昼夜温24 /20℃ ℃条件下, 光照和湿度保持不变。
1.3.5 品种 采用水培方式种植邯7860、国欣棉8
号、国欣棉3号、国欣棉9号、GK99-1、鲁棉研28和
鲁棉研21棉花品种。按1.2菌体培养及注射方法, 在棉
花出苗后的第3天注射菌体, 其OD600值为1.5, 并在
昼夜温24 /20℃ ℃条件下培养, 光照和湿度保持不变。
1.4 GhCLA1沉默效率的检测
注射病毒后15 d, 观察pTRV-GhCLA1棉花幼苗
叶片在不同温度下的白化情况并照相。分别取24℃
条 件 下 对 照 组 (pTRV-GFP) 和 GhCLA1 沉 默 组
(pTRV-GhCLA1) 棉花幼苗的第2片真叶(自茎基部
向上), 提取总RNA, 逆转录合成cDNA。根据棉花内
参基因GhUBQ7 (GenBank登录号为DQ116441) 和
GhCLA1设计引物, 引物序列分别为GhUBQ7-F: 5-A
AGAAGAAGACCTACACCAAGCC-3, GhUBQ7-R:
5-GCCCACACTTACCGCAATA-3, GhCLA1-F: 5-G
GAATTCCACAACATCGATGATTTAG-3, GhCLA1-R:
5-GGGGTACCATGATGAGTAGATTGCAC-3。以半
定量PCR检测GhCLA1沉默效率。
1.5 叶绿素含量的测定
注射病毒后15 d, 分别取pTRV-GFP对照组和
846 作 物 学 报 第 42卷


pTRV-GhCLA1沉默组棉花幼苗的第l叶和第2叶, 测
定总叶绿素含量, 以叶绿素含量下降比例为基因沉
默效率检测指标 [10], 具体方法参照Lichtenthaler和
Wellbum[11]的描述。
1.6 GhCTR1载体构建及基因沉默
用植物 RNA 提取试剂盒(艾德莱, 北京)提取棉
花叶片的总 RNA, 用逆转录酶 (M-MLV Reverse
Transcriptase, Promega)合成 cDNA。根据 GhCTR1
(GenBank 登录号为 GU207868.1)部分序列设计特异
性引物(上游引物5-CGGAATTCCATATGCCTGGAC
TGTGTGC-3, 下画线为 EcoR Ι 酶切位点; 下游引
物 5-GGGGTACCACAATATTTGCAGCCCTTCG-3,
下画线为 Kpn I 酶切位点), 以 cDNA 为模板, 用
KOD-Plus 高保真酶(TOYOBO, Japan)进行 RT-PCR
扩增并测序, 然后用 EcoR I/Kpn I 双酶切扩增产物
和 pTRV-RNA2 载体, 分别回收酶切产物, 连接、转
化和筛选阳性克隆。
采用水培方式, 按1.2菌体培养及注射方法, 在
棉花出苗后的第3天注射, 注射菌体OD为1.5, 在昼
夜温24 /20℃ ℃条件下培养, 光照和湿度保持不变。
1.7 数据统计
独立重复3次每个单因素的VIGS沉默效率试验,
各次结果趋势一致, 取用其中具有代表性的数值。
用SPASS 16.0 (SPSS Inc. Chicago, USA)的t检验比较
平均值(P < 0.05)。
2 结果与分析
2.1 棉花培养温度及重悬菌体浓度对 VIGS 沉默
效率的影响
侵染棉花 15 d 后, VIGS-GhCLA1 沉默植株在
20℃条件下第 1、第 2 真叶出现了明显的白化表型,
刚刚展开的叶片与正常温度 28℃下的植株相比生长
受到了显著抑制; 在 24℃条件下, 植物同样出现了
显著的白化表型, 并且其叶片只略小于正常温度下
植株叶片; 而在正常生长温度条件下的沉默植株只
显示出了部分花斑状的白化表型(图 1-A)。24℃条件
下的沉默植株半定量 PCR 检测结果显示, GhCLA1
基因的表达量与对照相比受到了显著的抑制 (图
1-B)。因此, 所有后续试验选择在 24℃条件下进行,
这样植株可维持较高的沉默效率和较快的生长速
度。
在同一温度下, 以 OD600值为 0.8 和 1.5 的重悬
液侵染, 发现棉花在后期并没有出现沉默效率上的
差异(图 1-A), 说明菌体浓度并不是影响基因沉默效
率的决定因素。
2.2 不同注射时间对 VIGS沉默效率的影响
分别在出苗后的第 3天、5天、7天和 9天注射
侵染棉花子叶, 其中出苗后 3 d侵染的植株, 叶绿素
含量能够 95%以上。出苗后 5 d 注射可使植株叶绿
素含量下降 90%以上。但在出苗 7 d 后侵染只能引
起不到 20%的叶绿素含量下降(图 2)。
2.3 VIGS对照载体的比较
pTRV-GFP 质粒是含一段外源 GFP 基因片段的
pTRV-RNA2 质粒, 将 pTRV-RNA1 重悬液与 pTRV-
RNA2、pTRV-GFP重悬液分别混合后注射进棉花子

图 1 培养温度及重悬浓度对棉花 VIGS沉默效率的影响
Fig. 1 Effect of temperature and concentration of cell suspen-
sions on pTRV-GhCLA1 mediated VIGS in cotton
A: 不同温度、注射不同 OD600重悬液条件下叶片 GhCLA1基因
沉默表型; B: 24℃沉默条件下 GhCLA1基因沉默效率检测。
1: 注射 pTRV1和 pTRV-GFP混合重悬液; 2: 注射 pTRV1和
pTRV-GhCLA1混合重悬液。
A: Phenotype of GhCLA1 silenced cotton leaves with different
temperatures and syringe-infiltrated concentrations of cell suspen-
sions. B: GhCLA1 expression in silenced and non-silenced cotton
plants detected by semi quantitative RT-PCR. 1: Syringe-infiltrated
suspension of pTRV1 and pTRV-GFP; 2: Syringe-infiltrated sus-
pension of pTRV1 and pTRV-GhCLA1.

图 2 不同注射时间对棉花 VIGS沉默效率的影响
Fig. 2 Effect of syringe-infiltrated time on silencing efficiency
induced by VIGS in cotton
数据为平均值±SE; 标以不同字母的柱值在 0.01水平上差异
显著。
Data are means±SE; Bars superscripted by different letters are
significantly different (P<0.01).
第 6期 穆 春等: 水培条件下病毒诱导棉花基因沉默体系的建立及优化 847


叶, 注射 14 d后, 用含 pTRV-RNA2混合重悬液处理
的植株幼苗在株高上低于 pTRV-GFP 重悬液处理的
植株(图 3), 并有一般显著性差异(P < 0.05), 插入片
段的大小可以影响病毒在宿主细胞内的传播和扩散,
因此, 后期用 pTRV-GFP 作为空白对照可以减弱插
入片段对植株生长的影响, 减小对照误差。

图 3 不同插入片段对棉花株高的影响
Fig. 3 Effect of cDNA insert length on the plant height
数据为平均值±SE; 标以不同字母的柱值在 0.05水平上差异
显著。
Data are means±SE; Bars superscripted by different letters are
significantly different (P < 0.05).

2.4 VIGS-GhCLA1在棉花土培与水培方式上的
比较
水培棉花在注射 5 d 后, 处理组和对照组的一
叶均展开, 开始出现 2叶, 且GhCLA1沉默植株与对
照相比开始出现花斑, 叶色变浅, 注射 10 d 后, 水
培棉花 2 叶已完全展开且整株叶片出现白化状态;
而土培棉花在注射 10 d后出现了白化, 整体长势上
晚于水培棉花(图 4)。因此, 用水培方式进行 VIGS
技术研究棉花基因功能, 可以更快、更有效地沉默

图 4 VIGS在水培与土培上的应用比较
Fig. 4 Comparison of VIGS in hydroponics culture and soil
culture
1:注射 pTRV1和 pTRV-GFP混合重悬液; 2: 注射 pTRV1和
pTRV-GhCLA1混合重悬液。
1: Syringe-infiltrated suspension of pTRV1 and pTRV-GFP; 2:
Syringe-infiltrated suspension of pTRV1 and pTRV-GhCLA1.
目的基因, 缩短试验时间。
2.5 VIGS-GhCLA1在棉花不同品种上的沉默表型
如图 5 所示, 在农杆菌侵染棉花 15 d 后, 几个
棉花常用品种邯 7860、国欣棉 8号、国欣棉 3号、
国欣棉 9号、GK99-1、鲁棉研 28和鲁棉研 21均出
现了显著的白化现象, 品种间白化程度差异不大(图
5), 表明VIGS技术能够成功地普遍应用于棉花不同
品种, 同时也验证了同一基因序列在不同株系中功
能上的高度保守性, 为后期鉴定基因功能提供了理
论支持。

图 5 VIGS在不同棉花品种上的应用
Fig. 5 Agrobacterium-mediated VIGS used in different
cotton cultivars

2.6 利用 GhCTR1验证水培棉花 VIGS沉默体系
用 pTRV-RNA1和 pTRV-GhCTR1混合重悬液侵
染棉花子叶, 20 d后与对照相比, 植株出现了明显的
矮化表型(图 6-A)。提取 pTRV-GhCTR1和 pTRV-GFP
处理植株叶片的总 RNA, 半定量 RT-PCR检测表明,
与对照植株相比 , 侵染 pTRV-GhCTR1 的植株
GhCTR1基因表达水平显著降低(图 6-B)。结果表明
水培棉花 VIGS 技术体系能够成功应用到基因研究
工作中。
3 讨论
VIGS技术已广泛应用在拟南芥、烟草等多种植
物[1-2], 而在棉花中应用时间尚短, 尤其是在水培条
件下生长的棉花, 如何对在水培条件下生长的棉花
进行 VIGS 操作来获得高效、稳定、快速的基因沉
默效率是实际应用中应该考虑的问题。
温度是影响病毒诱导的基因沉默效率的重要因
素[12-13], 病毒感染症状严重程度和感染的分子过程
848 作 物 学 报 第 42卷



图 6 GhCTR1沉默棉花表型及 GhCTR1基因沉默效率检测
Fig. 6 Phenotype of GhCTR1-silenced cotton seedlings and
expression of GhCTR1 after being silenced
1: 注射 pTRV1和 pTRV-GFP混合重悬液; 2: 注射 pTRV1和
pTRV-GhCTR1混合重悬液。
1: Syringe-infiltrated suspension of pTRV1 and pTRV-GFP;
2: Syringe-infiltrated suspension of pTRV1 and pTRV-GhCTR1.

受到温度的影响, 较低温度能使植物更早开启VIGS
机制, 产生更强烈的基因沉默表型 [14-15], 但温度过
低会抑制植株生长, 而温度较高则会在某些情况下
使病毒消灭。因此, 每个病毒–宿主植物基因沉默体
系都有各自的最优温度[16]。例如, 在番茄中, 病毒诱
导的基因沉默最佳温度为 21℃ [17], 而在烟草中则
为 25℃ [2]。植物生长温度能够影响病毒 DNA 的转
录、病毒在植物体内的传播、沉默信号的产生及病
毒和宿主因子的相关作用[17]。VIGS技术在土培棉花
上的应用一般采用 23℃ [6,8], 本研究结果显示, 对水
培条件下棉花 VIGS 来说, 植株培养温度 24℃、出
苗后 5 d内进行农杆菌侵染能够保持 VIGS-pTRV病
毒载体在棉花体内较快的传播, 使植株获得较高沉
默效率。
植株生长阶段也是影响基因沉默效率的因素之
一 [15,18], 而且幼嫩的植物比成熟期植物更容易出现
沉默表型[19]。本研究结果与上述研究类似, 在棉花
出苗后的3~5 d内用农杆菌注射子叶, 更容易出现较
高程度的基因沉默表型。 同时, 试验中对照植株的
选择对实验结果起着非常重要的作用。在很多TRV
烟草脆裂病毒介导的VIGS试验中, pTRV-RNA2作为
不含目的基因片段的原始载体, 通常与pTRV-RNA1
混合作为对照[16]。插入片段的大小能够通过影响病
毒在植物体内的复制效率和扩散程度从而影响对植
株的胁迫程度 , 因此pTRV-GFP载体能够减轻病毒
引起的叶片卷曲等症状[10], 减弱病毒浸染对植株的
抑制作用。由于插入片段大小的不同而引起的植株
间的差异容易混淆实验结果, 因此, 对于沉默不同
基因的VIGS试验 , 需要选择对应的较优化的载体
对照。
对许多作物来说, 稳定转基因株系的产生总是
受到遗传背景的限制。VIGS技术在水培棉花不同品
种株系上的稳定应用是利用该技术对棉花基因功能
及基因组学进行研究的必要条件。我们发现在优化
的沉默体系条件下, VIGS技术能够成功地应用于水
培条件下多种棉花品种, VIGS诱导基因沉默受棉花
宿主遗传背景影响较小, 可广泛用于来源不同的棉
花材料, 为后期确定基因功能提供了可信性。
CTR1编码一个 Raf家族的蛋白激酶, 作用于乙
烯受体下游, 负调控乙烯响应途径。CTR1功能缺失
突变体能够使植株产生矮化表型[20]。本文利用优化
的水培棉花 VIGS 沉默体系成功抑制了 GhCTR1 基
因表达, 沉默植株与 pTRV-GFP 对照株相比出现了
明显的矮化表型, 说明该体系能够成功应用到棉花
基因功能的研究中。此外, 与土培技术相比, 水培具
有出苗整齐, 方便管理等优势, 在水培条件下对棉
花进行 VIGS-cDNA 文库的筛选, 可以在同一水培
盒中同时沉默多个基因, 后期在同样的外源处理条
件下, 能够比较沉默不同基因植株之间的差异, 较
快筛选理想表型, 缩短实验周期, 加速棉花 cDNA
文库的筛选进程。
4 结论
成功建立了水培条件下棉花 VIGS 基因沉默体
系。在 24℃条件下, 用 OD值为 0.8或 1.5的混合菌
体重悬液, 在出苗后 3~5 d 内用注射的方法侵染棉
花, 同时以含 pTRV-GFP 质粒的农杆菌为对照, 能
够更快、更准确地发现目的表型, 鉴定基因功能。
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