全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(2): 313−319 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30970222, 31170233)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 李新征, E-mail: lxz@sdau.edu.cn; 亓宝秀, E-mail: qbx126@sdau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: mahaizhen2008@126.com, Tel: 15065806180
Received(收稿日期): 2013-04-11; Accepted(接受日期): 2013-08-16; Published online(网络出版日期): 2013-12-03.
http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20131203.1549.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00313
玉米幼苗不同部位的再生能力和某些影响因子
马海珍 朱伟伟 王启柏 王国良 李新征* 亓宝秀*
山东农业大学作物生物学国家重点实验室, 山东泰安 271018
摘 要: 为建立以玉米幼苗为外植体的高效再生体系, 克服幼胚取材的限制, 本研究选取萌发 3 d的玉米幼苗作为供
体材料, 研究其不同部位的再生能力。分别研究了种子萌发时的光照条件, N6培养基中 Ca2+浓度, 及 6个不同基因型
对芽尖和根尖愈伤组织诱导率和分化率的影响。结果显示, 黑暗条件下萌发的幼苗, 其芽尖和根尖更适合作为外植体,
诱导培养基中添加终浓度为 5 mmol L–1的 CaCl2 时的愈伤组织诱导率最高, 不同基因型的玉米愈伤组织的诱导率和
分化率存在差异, 但影响趋势相同, 且同一基因型的不同外植体形成的愈伤组织形态相似, 分化率也相似。最后结论
是黑暗条件下萌发 3 d的齐 319和鲁原 92的幼苗, 可以代替玉米幼胚作为外植体用于组织培养研究。
关键词: 玉米幼苗; 芽尖; 根尖; 愈伤组织诱导; 分化
Regeneration Capacity and Some Affecting Factors of Different Parts of Young
Seedlings of Maize (Zea mays L.)
MA Hai-Zhen, ZHU Wei-Wei, WANG Qi-Bai, WANG Guo-Liang, LI Xin-Zheng*, and QI Bao-Xiu*
State Key Laboratory of Crop Biology, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China
Abstract: Currently, immature embryo is the most widely used explant for maize regeneration and transformation. However, this
material source is restricted by geographical condition, developmental stages and the growing season. Here, we isolated different
parts the of three-day-old seedlings to study their regeneration capacity, aiming to establish an alternative efficient regeneration
system for maize. Using the shoot tips and primary root of three-day-old seedlings of maize germinated in dark and light as ex-
plants, the effects of illumination, genotype, and different concentration of Ca2+ in the induction medium on the primary callus
induction rate and seedling differentiation rate were analysed. The result showed that shoot tips and the root tips derived from
seedlings germinated in the dark were better source materials. Root materials isolated from the mature zone of the primary root
could not be weed to induce primary callus. The primary callus induction rate was the highest when 5 mmol L–1 of Ca2+ was added
in the induction medium. The callus induction and differentiation rates of both explants from the six different genotypes were very
different. However, the effect of the genotype on primary callus induction and differentiation rates from the two explants was con-
sistent. The differentiation rate and the morphology of the callus from the two explants of the same genotype were also similar.
From above, we propose that the 3-day-old seedlings of Qi 319 and Luyuan 92 germinated in the dark have the potential to re-
place the immature embryos for maize tissue culture in the future.
Keywords: Maize (Zea mays L.) seedling; Shoot tips; Root tips; Callus induction; Differentiation
玉米(Zea mays L.)是重要的粮食和饲用作物 ,
也是重要的工业原料[1]。近年来, 基因工程技术已在
玉米遗传育种及品种改良中成功应用, 并取得巨大
成就[2]。而高效的玉米组培和再生体系是玉米遗传
转化工作的基础。幼胚凭借其高效成熟的再生体系
和转化体系成为目前应用最广泛的外植体 , 然而 ,
幼胚的取材受到地理条件、生长季节和发育阶段的
限制。因此, 寻求取材方便、不受地理条件和生长
季节限制、再生率较高的外植体代替玉米幼胚对玉
米遗传转化改良工作具有重要意义[3]。自 Green 和
Phillips[4]首次利用玉米幼胚培养获得再生植株后 ,
至今已经从许多玉米外植体中诱导出胚性愈伤组织,
314 作 物 学 报 第 40卷


例如幼嫩花序[5]、花药[6]、雌雄幼穗[7-8]、丛生芽[9-10]、
腋芽[11]、胚芽鞘节[12]等。但这些外植体存在再生率
不高 , 受季节限制 , 取材量极少 , 实用性较差等缺
点。相比之下, 成熟种子易于大量保存, 可以随时取
用, 不受季节和用量等限制, 因此成熟种子或其萌
发后的幼苗是替代玉米幼胚的理想外植体来源。以
玉米幼苗的幼叶作为外植体进行组织培养 , 早在
1987 年就有报道 [13], 但效率极低。直到 2007 年,
Ahmadabadi等[14]以萌发到 5~10 cm (大约 7 d)的玉
米幼苗的幼嫩叶段作为外植体 , 建立起了再生体
系。但是该体系仅适用于特定的基因型, 并未在玉
米遗传转化方面得到广泛应用。因此, 改善幼苗的
再生体系及转化体系, 提高其再生率, 具有重要意
义。我们选用萌发 3 d的玉米幼苗(刚刚发芽)为供体
材料, 将其分为芽、根尖、根的非根尖区三部分, 分
别进行再生能力的研究, 从而建立以幼苗为外植体
供体的高效再生体系, 为替代幼胚作为遗传转化受
体奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
选用本实验室保存的齐 319、昌 7-2、鲁原 92、
Mo17、478和 178 等 6 个育种上常用的玉米自交系
为试验材料。
1.2 培养基
培养基成分及含量如表 1所示。

表 1 试验中用到的培养基及其成分
Table 1 Compositions of the media used in this study
培养基
Medium
成分
Composition
发芽培养基
Germination medium
0.5MS无机盐[15], 20 g L–1蔗糖, 8 g L–1琼脂, pH 5.8
0.5MS inorganic salts [15], 20 g L–1 sucrose, 8 g L–1 agar, pH 5.8
诱导培养基
Callus induction medium
N6无机盐[16], 2 mg L–1 2,4-D, 1.38 g L–1 L-脯氨酸, 0.1 g L–1水解酪蛋白, 30 g L–1蔗糖, 8 g L–1琼脂, pH 5.8
N6 inorganic salts [16], 2 mg L–1 2,4-D, 1.38 g L–1 L-proline, 0.1 g L–1 casein hydrolysate, 30 g L–1 sucrose, 8 g L–1 agar, pH 5.8
继代培养基
Subcuture medium
N6无机盐, 2 mg L–1 2,4-D, 0.69 g L–1 L-脯氨酸, 0.1 g L–1水解酪蛋白, 20 g L–1蔗糖, 8 g L–1 琼脂, pH 5.8
N6 inorganic salts,, 2 mg L–1 2,4-D, 0.69 g L–1 L-proline, 0.1 g L–1 casein hydrolysate, 20 g L–1 sucrose, 8 g L–1 agar, pH 5.8
分化培养基
Regeneration medium
MS无机盐, 1 mg L–1 6-BA, 0.5 g L–1 MES, 20 g L–1蔗糖, 8 g L–1琼脂, pH 5.8
MS inorganic salts, 1 mg L–1 6-BA , 0.5 g L–1 MES , 20 g L–1 sucrose, 8 g L–1 agar, pH 5.8
生根培养基
Rooting medium
MS无机盐, 1 mg L–1 6-BA, 1 mg L–1 MET, 0.5 g L–1 MES, 20 g L–1蔗糖, 8 g L–1琼脂, pH 5.8
MS inorganic salts, 1 mg L–1 6-BA , 1 mg L–1 MET, 0.5 g L–1 MES, 20 g L–1 sucrose, 8 g L–1 agar, pH 5.8
MES均为过滤除菌, 倒板前加入。MES were filter-sterilized and added just before pouring the media into petri dishes.

1.3 取材及组织培养方法
选取饱满的玉米种子, 用 70%酒精和 0.1%的
HgCl2分别消毒 10 min和 15 min, 再用无菌水冲洗
3~4 遍, 接种于发芽培养基, 置光照培养箱(16 h 光
照, 光强 80 μmol m–2 s–1; 8 h黑暗)和黑暗培养箱(24 h
黑暗) 28℃培养。
待芽长至 1~2 cm (约 3 d)时, 取幼苗的芽尖、根
尖和根的其他区段, 分别切成大约 1 mm × 2 mm的
碎片, 接种于诱导培养基, 置于 28℃黑暗条件下培
养, 4周后观察愈伤组织生长状况, 统计愈伤组织诱
导率。将诱导出的初级愈伤组织转入继代培养基中
培养, 每 2 周继代 1 次。继代 2 次后观察愈伤组织
形态。然后转入分化培养基于光照培养箱(28 , 16 h℃
光照; 26 , 8 h℃ 黑暗)中培养, 3 周后分别统计分化
率。分化苗长至 5~10 cm 时, 转入生根培养基促进
生根, 待再生苗长出根后, 移栽至小盆中。
1.4 试验参数处理
采用 Microsoft Excel 2003进行数据计算及作图,
用 DPS 5.12统计软件进行方差分析。
初级愈伤诱导率(%) = (初级愈伤组织总数/接种
外植体总数)×100
分化率(%) = (分化出芽的愈伤组织总数/接种外
植体总数)×100
再生率(%) = (再生出的植株总数/接种外植体总
数)×100
每个试验均重复 3次, 结果取平均值。
2 结果与分析
2.1 光照条件对玉米种子萌发幼苗不同部位愈
伤组织诱导率的影响
黑暗和光照条件下萌发的幼苗, 其根尖和芽尖
均能诱导出愈伤组织, 而根的其他部位不能诱导出
第 2期 马海珍等: 玉米幼苗不同部位的再生能力和某些影响因子 315


愈伤组织(图 1-D, H, I)。其中, 光照条件下根尖和芽
尖的初级愈伤组织诱导率分别为 66.88%和 35.74%,
而黑暗条件下分别为 92.98%和 54.59%。说明黑暗条
件下初级愈伤组织诱导率远远高于光照条件下, 因
此, 我们选取黑暗条件下萌发 3 d 的玉米幼苗芽尖
和根尖作为外植体进行进一步研究。

图 1 黑暗和光照条件下玉米齐 319芽尖和根尖形成的初级愈伤
组织形态及诱导率的比较
Fig. 1 Comparison of primary callus morphology and
induction rate from shoot tips and root tips of maize (Qi 319)
germinated under dark and light
A, E: 分别为光照和黑暗条件下萌发的玉米种子; B, F: 分别为
光照下和黑暗下萌发的幼苗的根尖形成的初级愈伤; C, G: 分别
为光照和黑暗下萌发的幼苗的芽尖形成的初级愈伤; D, H: 分别
为光照下和黑暗下萌发的幼苗的根的非根尖区形成的愈伤组织
形成情况; I: 光照和黑暗条件下萌发的幼苗的芽尖、根尖和根毛
区形成的初级愈伤组织诱导率的比较。
A, E: maize germinated in the light and in the dark, respectively; B,
F: primary callus formed from root tips of maize germinated in light
and dark, respectively; C, G: primary callus formed from shoot tips
of maize germinated in light and dark, respectively; D, H: primary
callus formed from the mature root zone of the maize germinated in
light and dark, respectively; I: Comparison of primary callus induc-
tion rate of shoot tips, root tips and the mature zone of maize ger-
minated in dark and light.

2.2 Ca2+浓度对芽尖、根尖初级愈伤组织诱导率
的影响
付凤玲等[17]实验表明诱导培养基中添加适当浓
度的 CaCl2有利于玉米幼胚的愈伤组织诱导, 当 N6
培养基中CaCl2浓度达到 5 mmol L–1时, 幼胚的愈伤
组织诱导率最高。因此, 为了分析研究 Ca2+浓度对
芽尖、根尖愈伤组织诱导率是否具有相似的影响 ,
本研究在 N6 诱导培养基中添加不同浓度的 CaCl2,
其终浓度分别为 3、4、5和 6 mmol L–1, 并以原 N6
培养基(Ca2+浓度为 1.13 mmol L–1)为对照, 分别选
取玉米自交系齐 319 的芽尖和根尖接种到以上 5 种
诱导培养基上, 4周后统计愈伤组织诱导率。结果表
明, Ca2+对芽尖和根尖 2种外植体愈伤组织诱导率的
影响趋势相同, 两种外植体在 Ca2+浓度为 5 mmol
L–1 的诱导培养基上初级愈伤组织诱导率都达到最
高, 分别为 56.67% (芽尖)和 98.65% (根尖), 比对照
显著提高; 当 Ca2+浓度提高到 6 mmol L–1时, 愈伤
组织诱导率开始下降(图 2)。因此, 认为诱导培养基
的最佳 Ca2+浓度为 5 mmol L–1, 在此浓度下产生的
愈伤组织颗粒疏散, 色泽鲜黄(图 3-A, E), 比对照培
养基上产生的愈伤组织更符合 Armstrong 等[18]介绍
的胚性愈伤组织鉴别标准。

图 2 诱导培养基中不同 Ca2+浓度对初级愈伤组织诱导率的影响
Fig. 2 Effect of different Ca2+concentrations in the induction
medium on primary callus induction rate
试验重复 3次, *表示在 P ＝ 0.05水平上差异显著。
The experiment was repeated three times. * indicates significantly
different at P = 0.05.

2.3 玉米齐 319芽尖和根尖的再生过程
以玉米自交系齐 319 为材料, 分别选取其芽尖
和根尖来源的胚性愈伤组织(图 3-A, E)接种于分化
培养基上培养并观察其愈伤组织分化情况。结果显
示, 26.17%的芽尖和 25.78%的根尖均能分化出芽(表
2, 图 3-C, G), 并可以成功实现再生(图 3-D, H), 芽尖
和根尖的植株再生率分别达到 35.00%和 38.48% (表
2)(部分分化的愈伤组织一个可以再生出多棵植株)。
2.4 不同玉米基因型芽尖和根尖的再生性比较
为了研究不同基因型对芽尖和根尖这 2 种外植
体的愈伤组织诱导率、愈伤组织形态及愈伤组织分
化率的影响, 除齐 319外, 我们又选择了 5个基因型
的玉米幼苗, 对其芽尖和根尖的再生性进行比较。
结果显示, 6个自交系的芽尖和根尖均能产生愈伤组
316 作 物 学 报 第 40卷


表 2 不同玉米外植体来源的愈伤组织诱导率及分化率比较
Table 2 Induction rate and differentiation rates of the callus from the different maize explants
外植体
Explant
接种数目
Total No. of
inoculation
初级愈伤组织诱导率
Primary callus
induction rate (%)
胚性愈伤组织诱导率
Embryogenic
callus induction rate (%)
分化率
Differentiation
rate (%)
植株的再生率
Plant regeneration
rate (%)
芽尖 Shoot tips 480 55.67 30.21 26.17 35.00
根尖 Root tips 330 98.65 38.79 25.78 38.48

图 3 来源于玉米自交系齐 319的芽尖和根尖的再生过程
Fig. 3 Regeneration process from shoot tips and root tips of maize seedlings of maize inbred line Qi 319
A, E: 分别为芽尖和根尖形成的愈伤组织; B, F: 分别为芽尖和根尖形成的愈伤形态; C, G: 分别为分化出芽的芽尖和根尖来源的愈伤
组织; D, H: 分别为根尖和芽尖诱导再生的小苗。
A, E: Primary callus from shoot tips and root tips respectively; B, F: Callus morphology from shoot tips and root tips respectively;
C, G: Cluster buds differentiated from callus formed from shoot tips and root tips respectively; D, H: Regenerated plantlet from
shoot tips and root tips respectively.

织, 不同基因型的两种外植体产生的初级愈伤组织
频率趋势基本相同, 根尖诱导愈伤组织比芽尖的高,
其中齐 319、鲁原 92的 2种外植体初级愈伤组织诱
导率, 分别为 97.62% (齐 319根尖)和 54.59% (齐 319
芽尖), 91.32% (鲁原 92根尖)和 51.04% (鲁原 92芽
尖)(图 4-A), 相对较高。
尽管 6 个玉米自交系的根尖的初级愈伤组织诱
导率比芽尖的高, 但是其胚性愈伤组织诱导率和芽
尖相比差异并不像初级愈伤组织诱导率那么显著
(图 4-B), 不同基因型的两种外植体产生的胚性愈伤
组织的趋势也基本相同, 同种基因型的根尖的胚性
愈伤组织诱导率和芽尖相似或比芽尖的稍高一些。
其中齐 319 的两种外植体的胚性愈伤组织相对于其
他 6个自交系都比较高, 分别达到 38.79% (根尖)和
30.21% (芽尖)(图 4-B)。
为评价愈伤组织的继代能力和形成愈伤组织的
质量, 将 6个基因型的芽尖和根尖形成的初级愈伤组
织分别接种到继代培养基上, 2周继代一次, 继代 2次
后观察芽尖和根尖形成的愈伤组织形态。6个自交系
形成的愈伤组织主要分为 3种类型, 其中齐 319和鲁
原 92 形成的愈伤组织多数为淡黄色, 生长旺盛, 颗
粒疏散, 更符合 Bajaj [19]对 II 型愈伤组织的鉴别标
准。Mo17 多数形成 I 型愈伤组织, 大部分不能长期
继代; 昌 7-2、178 和 478 形成的愈伤组织结构松软,
且水渍化严重, 继代中容易褐化死亡(表 3)。最后分
别选取 6个基因型来源的芽尖、根尖形成的胚性愈伤
组织, 接种到分化培养基上, 2周后统计分化率, 结果
显示, 同基因型的芽尖、根尖形成的胚性愈伤组织分
化率差异不显著, 不同基因型的这两种外植体来源
的胚性愈伤组织分化率趋势也基本相同(图 4-C)。
3 讨论
本研究表明, 黑暗条件下萌发的玉米幼苗的芽
尖和根尖的愈伤组织诱导率明显比光照条件下高。
这可能是因为黑暗条件下萌发玉米幼苗的光调控基
因表达受阻, 光形态建成受到抑制 [20], 分化程度比
光照条件下低。因此黑暗条件下萌发的玉米幼苗的
芽尖、根尖更适合作为外植体供体。
张东向等[21]发现玉米叶片的愈伤组织诱导率与
内源 ABA 活性正相关 , 而 Ca2+结合钙调蛋白在
第 2期 马海珍等: 玉米幼苗不同部位的再生能力和某些影响因子 317



图 4 不同基因型对芽尖和根尖愈伤组织诱导率和胚性愈伤组
织分化率的影响
Fig. 4 Callusing and differentiation rates of shoot tips and
root tips from six genotypes of maize inbred lines
A: 6种不同基因型玉米自交系的两种外植体的初级愈伤组织诱
导率的比较; B: 6种不同基因型玉米自交系的 2种外植体的胚性
愈伤组织诱导率的比较; C: 6种不同基因型玉米自交系的 2种外
植体的分化率的比较。
A: Comparison of the primary callus rate of two explants from six
genotypes of maize inbred lines; B: Comparison of the embryogenic
callus induction rate of two explants from six genotypes of maize
inbred lines; C: Comparison of the differentiation rate of two
explants from six genotypes of maize inbred lines.
ABA的基因诱导表达过程中起重要的作用[22]。本实
验发现 N6培养基中的 Ca2+浓度由 1.13 mmol L–1提
高到 5.00 mmol L–1, 不仅芽尖和根尖的愈伤组织诱
导率达到最高, 而且愈伤组织形态也得到了改善。
这些结果表明, Ca2+对这 3种不同外植体形成愈伤组
织的影响模式可能相同。
Huang等[23]以在含有 4 mg L–1的 2,4-D的无菌
水中浸泡 3 d 的玉米自交系的成熟胚为材料, 进行
组织培养, 其中玉米自交系齐 319 获得了 21.10%的
芽分化率, 而本实验选择黑暗条件下在发芽培养基
上萌发 3 d 的玉米幼苗作为芽尖供体, 玉米自交系
获得了 25.78%的芽分化率, 而且有时, 一个愈伤组织
上分化的芽可以再生多棵植株, 因此植株再生率高达
35%。本实验所用的芽尖作为外植体较 Huang等[23]实
验中选用的成熟胚芽分化率虽然提高并不明显, 但
是, 本实验所用的方法简单方便, 直接将萌发的玉
米幼嫩芽尖切碎即可作为外植体诱导愈伤组织, 取
材方便, 且取材量多, 而 Huang 等[23]实验所用的浸
泡 3 d的玉米成熟胚芽剥取较复杂, 且取材量少; 此
外 Huang 等[23]将种子萌发所得的幼根直接弃掉, 而
我们却对萌发 3 d 的幼苗的不同部位进行了再生研
究, 把我们经常忽略的幼根分为根尖和非根尖部位
分别进行了再生, 发现根尖基本都可以诱导出初级
愈伤组织, 而且芽尖和根尖来源的胚性愈伤组织形
态相似, 分化率差异也不显著。玉米是否能够成功得
到再生苗取决于其良好的愈伤组织形态[24], 同一个
基因型的玉米幼苗的芽尖和根尖来源的胚性愈伤组
织形态相似, 因此其分化率也差异不显著, 故本实验
所用的萌发 3 d的幼苗来源的芽尖和根尖这两种外植
体形成的愈伤组织可以一起进行分化。这样与 Huang
等[23]实验中所用的成熟胚相比, 愈伤组织的取材总
量加多, 故幼苗再生效率提高了。

表 3 6个不同基因型来源的芽尖和根尖形成诱导的愈伤组织形态
Table 3 Comparison of growth rate of shoot tips and root tips-derived callus of six maize genotypes
芽尖 Shoot tips 根尖 Root tips 基因型
Genotype 愈伤形态
Morphology of callus
继代情况
Subculture condition
愈伤形态
Morphology of callus
继代情况
Subculture condition
齐 319, 鲁原 92
Qi 319, Luyuan 92
淡黄色, 颗粒疏散,
生长迅速
Bright yellow, graininess,
friable, rapid-growing
可长期继代,
色泽形态不变
Colour immutability after
long-term transgeneration
淡黄色, 结构稍微致密,
颗粒状, 生长迅速
Bright yellow, graininess, a little
compact, friable, rapid-growing
可长期继代,
色泽形态不变
Colour immutability after
long-term transgeneration
Mo17 黄色, 结构致密, 生长缓慢
Yellow, compact, slow-growing
不能长期继代
Hard transgeneration
黄色, 结构致密, 生长缓慢
Yellow, compact, slow-growing
不能长期继代
Hard transgeneration
昌 7-2, 178, 478
Chang 7-2, 178, 478
白色, 结构松软, 水渍状
White, soft, water stains
褐化
Browning
白色, 结构松软水, 渍化严重
White, soft, serious-water stains
褐化
Browning
318 作 物 学 报 第 40卷


在相同的条件下 , 供试的6个基因型的玉米芽
尖和根尖均能诱导产生初级愈伤组织, 同一基因型
的芽尖与根尖形成的愈伤组织形态基本一致, 且与
陈靖等 [25-26]所描述的相同基因型的幼胚形成的愈
伤组织形态也基本一致, 这表明基因型仍然是限制
愈伤组织诱导的重要因素, 通过选择不同的外植体
并不能从根本上突破基因型的限制, 这与前人报道
的玉米组织培养中对基因型的依赖是一致的[27]。研
究表明玉米成功得到再生苗取决于其良好的愈伤
组织形态, 本实验选用的6个基因型中, 齐319和鲁
原92的芽尖和根尖形成的愈伤组织最优质, 具有较
高的分化率, 可以代替玉米幼胚用于玉米遗传转化
研究。
4 结论
黑暗条件下萌发 3 d 的玉米自交系齐 319 和鲁
原 92的幼苗, 可以代替玉米幼胚作为外植体用于组
织培养研究, 为后期遗传转化研究奠定了基础。
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