全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(12): 2070−2080 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.02070
水稻早衰叶突变体 PLS2的遗传分析与基因定位
张 涛 1,2,** 孙玉莹 3,** 郑建敏 4,** 程治军 3 蒋开锋 1,2 杨 莉 1,2
曹应江 1,2 游书梅 1,2 万建民 3 郑家奎 1,2,5,*
1四川省农业科学院水稻高粱研究所 / 农业部西南水稻生物学与遗传育种重点实验室, 四川德阳 618000; 2国家水稻改良中心四川泸
州分中心, 四川泸州 646100; 3中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081; 4四川省农业科学院作物研究所, 四川成都 610066; 5重
庆大学生物工程学院, 重庆 400044
摘 要: 叶片早衰引起叶绿素和其他大分子被降解, 叶片光合能力降低。这个过程常伴随着活性氧(ROS)的积累, 以
及细胞中抗氧化酶(SOD、CAT 和 APX)活性的降低, 衰老相关基因(SAG)表达量上调, 最终导致整个植株过早成熟,
产量降低。因此, 研究水稻早衰遗传机制和基因功能对于水稻的遗传改良具有重要的作用和意义。PLS2是通过航天
育种工程经空间辐射诱变得来的突变体, 在孕穗期表现早衰。与野生型相比, PLS2的光合能力降低, 株高变矮, 节间
和穗长缩短, 分蘖数和有效分蘖数减少, 穗粒数和结实率明显下降, 千粒重降低, 穗发育不良, 灌浆不充分; 叶片的
CAT 活性显著降低、H2O2积累、死亡细胞增加, 叶绿体结构变差, 叶绿体中淀粉和嗜锇颗粒增多。黑暗处理加速突
变体叶片衰老, 叶绿体超微结构球状化。利用 PLS2/蜀恢 527和 PLS2/02428 的隐性定位群体, 将 pls2 定位在第 3染
色体标记 RM14704 (8 674 283 bp)与 SL-I-5 (8 758 394 bp)之间, 物理距离 84.11 kb, 区间内包括 14个基因, 测序发现
在 LOC_Os03g15840 第 9个外显子第 41 位的 C被替换为 T, 导致精氨酸(R)替换为半胱氨酸(C), LOC_Os3g15840编
码水稻中的一个糖基转移酶(glycosyltransferases, GTs), 可能是 pls2的候选基因。为下一步调控基因的克隆和功能研
究奠定了基础。
关键词: 叶片衰老; 叶绿体; 图位克隆; 糖基转移酶
Genetic Analysis and Fine Mapping of a Premature Leaf Senescence Mutant in
Rice (Orzya sativa L.)
ZHANG Tao1,2,**, SUN Yu-Ying3,**, ZHENG Jian-Min4,**, CHENG Zhi-Jun3, JIANG Kai-Feng1,2, YANG
Li1,2, CAO Ying-Jiang1,2, YOU Shu-Mei1,2, WAN Jian-Min3, and ZHENG Jia-Kui1,2,5,*
1 Rice and Sorghum Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Southwest Rice Biology and Genetic Breed-
ing, Ministry of Agriculture, Deyang 618000, China; 2 Luzhou Branch of National Rice Improvement Center, Luzhou 646100, China; 3 Institute of
Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 4 Crop Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sci-
ences, Chengdu 610066, China; 5 Bioengineering College, Chongqing University, Chongqing 400044, China
Abstract: Leaf senescence induces degradation of chlorophyll and other macromolecules, reducing leaf photosynthetic capacity.
This process is accompanied by the accumulation of reactive oxygen species (ROS), the decreasing of cell antioxidant enzyme
(SOD, CAT, and APX) activity, and the increasing of aging related gene (SAG) expression, leading in early maturity and yield
reduction. Therefore, studies on the genetic mechanism and gene function of premature senescence in rice, has the important ef-
fect and significance in genetic improvement of rice. PLS2 from space radiation mutation breeding project showed leaf senility, at
booting stage. Compared with the wild type, in PLS2 the photosynthetic capacity decreased, the plant height, internode and pani-
cle length shortened, tiller and effective tiller number reduced, number of grains per ear and seed setting rate were significantly
lower, 1000-grain weight decreased, main panicle was stunted and grain-filling was not full. CAT activity decreased significantly
in leaves, H2O2 accumulated, and the number of dead cell increased, chloroplast structures in leaves were worse, with more

本研究由四川省应用基础计划项目(2012JY0063), 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AAl0A101)和四川省财政基因工程青
年基金项目(2011QNJJ-022)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 郑家奎, E-mail: zhen6102@126.com **同等贡献(Contributed equally to this work)
第一作者联系方式: 张涛, E-mail: yszht@163.com; 孙玉莹, E-mail: 105683744@qq.com; 郑建敏, E-mail: jianminxingzheng@yeah.net
Received(收稿日期): 2013-12-03; Accepted(接受日期): 2014-09-16; Published online(网络出版日期): 2014-10-16.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20141016.1534.004.html
第 12期 张 涛等: 水稻早衰叶突变体 PLS2的遗传分析与基因定位 2071

starches grains and osmiophilic granules. Dark treatment accelerated mutant leaf senescence, chloroplast ultrastructure was sphe-
roidized. Using implicit localization population derived from PLS2/Shuhui 527 and PLS2/02428 the pls2 was located between
markers RM14704 (8 674 283 bp) and SL-I-5 (8 758 394 bp) on chromosome 3, with physical distance of 84.11 kb, including 14
genes in the interval. Sequencing result showed that C was replaced with T in the position of 41 base pair of the ninth extron of
LOC_Os03g15840 leading to an exchange of Arg (R) is replaced by Cys(C). LOC_Os03g15840 coding a glycosyl transferase (GTs)
may be the candidate gene of pls2. These results provide a foundation for the further gene cloning and functional analysis of pls2.
Keywords: Leaf senescence; Chloroplast; Map-based cloning; Glycosyltransferase1
水稻的生物产量和经济产量的形成主要依赖于
光合作用, 叶片是光合作用的主要器官, 叶片的生
长、发育与产量形成密切相关, 其衰老是植物叶片
发育的最后阶段。叶片的早衰受遗传和环境因素(生
物或非生物胁迫)影响 , 可导致植物光合能力降低 ,
引起作物籽粒灌浆不足、结实率下降、千粒重变小
等 , 致使作物产量严重下降 , 这是世界范围内粮食
产量损失的重要原因之一 [1]。叶片的衰老是植物在
长期进化过程中形成的适应性, 是植物发育过程中
的必然需要经历的生命现象 [2], 是一个复杂的生物
学过程, 涉及叶绿体发育、叶绿素合成与代谢、细
胞程序性死亡、激素合成与代谢等多种途径的基因
调控[3]。在拟南芥等双子叶模式植物上的研究表明,
在叶片衰老过程中, 叶片气孔缩小, 叶绿素和其他
大分子(蛋白质、脂类和核酸等)被降解, 叶片光合活
性降低、叶色逐渐变黄, 光合合成相关基因在衰老
叶片中表达量下调, 大分子分解和运输的基因表达
量上调[4-5]。
目前, 在水稻中已经鉴定了一些衰老相关基因
(senescence-associated genes, SAGs), 主要有Sgr(t)[6]、
Osh69[7]、Os12[8]、OsDos[9]、SGR[10]、Sgr[11]、NYC1[12]、
YGL1[13]和SPL28[14]。与水稻衰老相关基因定位的研
究报道有Pse(t)[15]、Pls1[16]、Sms1[17]、Pls3[18]、Es-t[19]、
Lad[20]、esl2[21]、esl3[22]、psf[23]和lms[24]等。但克隆
的衰老基因中直接调控基因较少, 中国科学院遗传
与发育生物学研究所克隆了NOE1[25]基因 , 该水稻
突变体noe1的过氧化氢酶(CAT)活性降低 , 叶片中
过高的 H2O2诱发了 NO和 S-亚硝基硫醇 (S-nitro-
sothiol)的产生, 导致叶片早衰。
四川省农业科学院水稻高粱研究所利用三系杂
交水稻恢复系泸恢H103经空间辐射诱变获得了1个
隐性早衰突变体PLS2 (premature leaf senescence 2)。
该突变体在拔节、孕穗期叶片开始黄化衰老, 黑暗
处理会加快其衰老。前期对PLS2进行了系统的表型
鉴定、遗传分析和基因初步定位研究, 将该基因定
位于水稻第3染色体上 , 与目前报道的衰老基因不
等位, 是一个新的早衰突变体[26]。
1 材料与方法
1.1 突变体材料
水稻早衰突变体PLS2材料是由四川省农业科学
院水稻高粱研究所选育的三系杂交水稻恢复系亲本
泸恢H103, 于2006年参加农业部实践8号卫星航天育
种工程, 经空间辐射诱变而来。经连续在四川、海南
和北京多代种植, 该突变体在孕穗期衰老表型表现
明显[26], 突变性状稳定、受环境影响小, 遗传稳定。
1.2 表型分析
将水稻突变体PLS2和野生型泸恢H103分别种植
在四川德阳四川省农业科学院水稻高粱研究所试验
基地、北京中国农业科学院作物科学研究所温室、昌
平试验基地、光照培养箱以及海南试验基地, F2群体
种植在四川德阳四川省农业科学院水稻高粱研究所
试验基地。分蘖拔节期, 观察野生型与突变体倒三叶
叶片表型, 考察分蘖数、有效分蘖数、结实率、株高、
穗长、千粒重、穗粒数、单株产量等农艺性状。在孕
穗期(抽穗前)观察F2单株倒三、倒四叶表型, 此时期,
倒三叶大部分变黄且倒四叶有变黄迹象则记为突变
体表型单株, 表现绿色(正常色)为野生型表型单株(图
1)。在人工气候室种植用于暗培养的野生型与突变体
幼苗, 30℃恒温, 90%恒湿, 14 h光照/ 10 h黑暗周期。
1.3 遗传作图群体构建及取样
2008年在四川德阳, 以PLS2做母本分别与泸恢
H103、蜀恢527、泸恢602、日本晴和02428杂交, 获
得杂种F1。同年冬季在海南试验基地种植加代并收
获F2种子 , 2009—2010年夏在四川省农业科学院水
稻高粱研究所德阳试验基地种植F2群体, 单苗栽插。
孕穗期调查F2分离情况, 同时取各亲本、部分F2正常
单株和全部F2衰老单株作为定位群体。
1.4 透射电镜观察
取人工气候室生长4周的野生型和突变体叶片,
在中国农业科学院食品加工研究所透射电镜室观察
衰老及正常叶片样品情况。
1.5 基因组 DNA提取与基因定位
采用改进的CTAB (cetyltrimethyl ammonium bro-

2072 作 物 学 报 第 40卷

mide)法提取亲本及定位群体的基因组DNA[27], 参照
Rogers等的方法[28]利用SSR标记和InDel标记采用混合
分离群体分析法(bulked segregant analysis, BSA)进行
连锁分析。找到连锁标记后随机选取120株杂交F2群体
中的衰老极端单株, 对初定位区间进行验证。最后用
全部杂交F2代群体中的隐性极端单株, 进行基因精细
定位和绘制包含目的基因所在区域的物理图谱。
参照林启冰等 [29]的方法分析及开发设计InDel
分子标记。
1.6 目标基因预测与序列测定
参考NCBI和Gramene网站上的注释和预测精细
定位区间内的基因。用Primer Premier 3.0软件对区间
内预测的基因设计测序引物, 用PCR方法分别扩增
野生型泸恢H103和突变体PLS2的基因序列。琼脂糖
凝胶电泳后, 用PCR产物纯化回收试剂盒(北京天根
公司)回收目的片段, 并委托北京博迈德公司和中国
农业科学院重大工程楼公共实验室测序。用
DNAMAN软件对测序结果比对分析, 寻找区间内存
在的核酸序列突变位点。
2 结果与分析
2.1 水稻早衰突变体表型鉴定
在温室条件下, PLS2在播种后6~8周, 第四叶片
开始变黄衰老(图1-A, B), 之后的叶片也随着生长的
进程, 提前衰老。六叶期早衰表型相当明显, 叶绿素
严重降解, 叶片黄化、干枯。随着植株的生长, 突变
体叶片不断衰老并最终死亡。
在四川德阳(寡照、昼夜温差小)大田种植条件下,
插秧30 d左右后(秧龄35 d左右), 在抽穗期前, 倒三
叶心叶抽出时, 先前抽出的倒四叶片就开始变黄衰
老 , 每个分蘖叶片的表现均类似 ; 始穗时先前抽出
的倒三叶片就开始变黄衰老 ; 齐穗后倒二叶衰老 ;
灌浆完成时剑叶表现衰老, 完全成熟时剑叶完全衰
老死亡。野生型品种泸恢H103在相同条件下可以保
持25~30 d的绿色, 成熟时叶片颜色变化正常, 符合
水稻自然衰老的规律。

图 1 野生型泸恢 H103与突变体 PLS2的表型
Fig. 1 Phenotypes of wild type Luhui H103 and mutant PLS2 plants
A, B: 温室生长的六叶期野生型泸恢 H103与突变体 PLS2的表型; C: 野生型泸恢 H103与突变体 PLS2 在抽穗期的表型;
D: 野生型泸恢 H103与突变体 PLS2 主穗的表型。
A, B: Phenotypes of Luhui H103 and PLS2 plants at the 6th leaf stage; C: Phenotypes of WT and PLS2 plants at heading stage;
D: Main panicle of wild type and PLS2 plants.
第 12期 张 涛等: 水稻早衰叶突变体 PLS2的遗传分析与基因定位 2073

在北京(强光、昼夜温差大)的大田种植条件下,
突变体在抽穗期衰老表型明显, 除少数叶片保持绿
色外, 大部分叶片变黄、凋亡(图1-C); 进入灌浆期,
突变体剑叶开始衰老、凋亡。而在相同环境下, 野
生型泸恢H103的大部分叶片绿色维持到灌浆期结
束。可以看出, 在各个生长阶段, 突变体PLS2叶片
都比野生型的叶片表现出显著的早衰。最终导致突
变体的穗发育不良, 籽粒灌浆不饱满、千粒重变小
(图1-D)。
两地大田种植结果比较: 在北京突变体抽穗期
衰老表型明显, 在四川突变体孕穗期衰老表型明显,
在四川德阳(寡照、昼夜温差小)条件下比在北京(强
光、昼夜温差大)条件下衰老时间提前 10 d左右。这
可能与光照强度及温度有关。
2.2 农艺性状
由于突变体叶片早衰发生的时期比较早, 其光
合能力降低影响到整个植株的生长发育, 其株高变
矮 , 节间和穗长缩短 , 分蘖数和有效分蘖数减少 ;
在穗发育时营养供应不足 , 每穗粒数明显减少, 灌
浆不充分; 后期叶片枯死, 导致千粒重明显变小。从
表 1、表 2和图 2可以看出, 北京、四川德阳两点突
变体株高均降低 20%以上, 每穗粒数减少 30%以上,
变异达显著水平; 千粒重下降 20%以上, 变异达显
著水平 ; 结实率在北京点变化不显著, 在德阳点下
降 48%, 变异达极显著水平; 植株产量也因为叶片
的过早衰老而降低 67%, 差异极显著。由此可见衰
老对于作物产量的影响最为重要的性状是每穗粒
数、结实率和千粒重。

表 1 野生型与突变体株高、穗长和节间的长度比较
Table 1 Comparison of plant height, ear length, and internodes between wild type and mutant (cm)
性状
Trait
地点
Site
泸恢 H103 Luhui H103
(mean±SD)
PLS2
(mean±SD)
t值
t-value
株高 Plant height 北京 Beijing 97.6±5.7 70.2±5.0 2.6*
四川德阳 Deyang, Sichuan 117.4±4.4 93.4±3.9 2.9**
穗长 Ear length 北京 Beijing 25.0±1.3 20.5±2.2 0.3
四川德阳 Deyang, Sichuan 26.4±1.2 24.9±3.1 1.2
倒一节 Last internodes 北京 Beijing 30.0±4.9 18.5±2.7 1.5
倒二节 Penultimate internodes 北京 Beijing 13.4±2.7 8.6±1.7 1.0
倒三节 Last third internodes 北京 Beijing 10.6±1.1 8.4±0.9 1.1
倒四节 Last fourth internodes 北京 Beijing 8.8±1.1 6.1±1.3 1.1
倒五节 Last fifth internodes 北京 Beijing 6.0±1.2 4.4±0.7 0.9
* t(α=0.05,8)=1.8595, ** t(α=0.01,8)=2.8965.

表 2 野生型与突变体的单株产量、分蘖数、有效穗数、每穗粒数、结实率和千粒重比较
Table 2 Comparison of tiller number, effective tiller number, grain number per panicle, and seed-setting rate between wild type and
mutant
性状
Trait
地点
Site
泸恢 H103 Luhui H103
(mean±SD)
PLS2
(mean±SD)
t值
t-value
单株产量 Yield per plant (g) 四川德阳 Deyang, Sichuan 112.6±4.6 37.1±4.1 8.7**
分蘖数 Tiller number 北京 Beijing 9.6±2.9 8.8±2.2 0.2
有效穗 Effective tillering 北京 Beijing 8.8±2.5 7.2±1.8 0.4
四川德阳 Deyang, Sichuan 8.4±2.6 8.2±2.2 0
每穗粒数 Grain number per panicle 北京 Beijing 185.0±8.9 7.6±12.9 4.9**
四川德阳 Deyang, Sichuan 147.2±10.0 101.2±9.6 2.3*
结实率 Seed-setting rate (%) 北京 Beijing 89.7±6.0 79.4±9.0 0.7
四川德阳 Deyang, Sichuan 90.0±4.6 41.9±3.0 6.2**
千粒重 1000-grain weight (g) 北京 Beijing 37.5±0.2 28.4±3.0 2.2*
四川德阳 Deyang, Sichuan 35.4±0.4 33.6±0.4 2.3*
* t(α=0.05,8)=1.8595, ** t(α=0.01,8)=2.8965.

2074 作 物 学 报 第 40卷


图 2 野生型沪恢 H103与突变体 PLS2农艺性状比较
Fig. 2 Agronomic trait comparisons between wild type Luhui H103 and mutant PLS2 plants

2.3 持续黑暗加速叶片衰老
取人工气候室生长 4 周的野生型和突变体的幼
苗, 持续黑暗处理, 每隔 1 d取一次样品(第四片叶片)
固定, 在透射电镜下观察叶绿体的降解情况。随着
处理时间的延长 , 野生型也表现出衰老的表型 , 在
黑暗处理 6 d时, 野生型的叶绿体降解, 很少能观察
到完整的叶绿体(图 3-D)。在相同生长条件下, 突变
体各个时期的叶绿体结构都比较蓬松; 突变体在黑
暗处理第 2 天, 其叶绿体色浅且形状不规则, 与野
生型黑暗处理第 4 天的叶绿体形态相近(图 3-C, F),
之后叶绿体的体积反而变大 , 充斥着淀粉粒, 表明
叶绿体也出现降解问题(图 3-G, H)。持续黑暗加速叶
片的衰老, 这与突变体在四川(寡照、低温差)比在北
京(强光照、高温差)提前衰老的结果一致。

图 3 生长 4周的野生型泸恢 H103与突变体 PLS2在持续黑暗下的叶绿体降解情况
Fig. 3 Chloroplast degradation of wide type Luhui H103 and mutant PLS2 leaves in continuous dark treatment
上排为野生型叶绿体在黑暗处理前(A)、第 2天(B)、第 4天(C)和第 6天(D)的降解情况, 下排为突变体叶绿体在黑暗处理前(E)、
第 2天(F)、第 4天(G)和第 6天(H)的降解情况。
A: WT before the treatment; B: WT in the second day of the treatment; C: WT in the fourth day of the treatment; D: WT in the sixth day of the
treatment; E: PLS2 before the treatment; F: PLS2 in the second day of the treatment; G: PLS2 in the fourth day of the treatment; H: PLS2 in
the sixth day of the treatment.
第 12期 张 涛等: 水稻早衰叶突变体 PLS2的遗传分析与基因定位 2075

大田生长阶段, 在抽穗前取突变体中既有绿色
部分也有黄色部分的叶片进行固定, 对应地, 选取
野生型同生育期条件下的相同部位叶片。从图 4 可
以看出, 突变体绿色部位与黄色部位的叶绿体结构
均比野生型的要差, 而且叶绿体中淀粉和嗜锇颗粒
也较多。

图 4 野生型泸恢 H103与突变体 PLS2在抽穗之前的叶绿体结构
Fig. 4 Chloroplast structures of wide type Luhui H103 and mutant PLS2 leaves before heading stage
左侧为野生型叶片的绿色部分(A)和黄色部分(B)叶绿体结构, 右侧为突变体叶片的绿色部分(C)和黄色部分(D)叶绿体结构。
A, B: Chloroplast structures of WT blade (corresponding leaf with C and D); C, D: Chloroplast structures of green and yellow parts in
senescencing leaf of PLS2.

2.4 早衰突变体 PLS2的遗传分析
早衰突变体 PLS2分别与泸恢 H103、蜀恢 527、
日本晴(粳稻)和 02428 (粳稻)杂交, 无论在海南或四
川种植, F1 叶色与野生型相同, 说明该早衰性状为
隐性遗传。F2 在四川德阳试验田种植, 抽穗期前调
查叶片表型及分离情况, 突变体叶与正常叶分离非
常明显, 早衰叶和正常叶的分离都符合 1∶3的分离
比(表 3), 说明叶片早衰性状受一对隐性基因控制。
2.5 水稻早衰突变体 pls2基因的定位
筛选覆盖水稻全基因组的 537对 SSR分子标记,
得到 55对在早衰突变体 PLS2与蜀恢 527间有多态
性的引物, 利用 270 个 F2突变个体单株将目的基因

表 3 早衰叶突变体和不同亲本杂交 F1、F2的表现
Table 3 Performance of presenile leaf mutants and F1, F2 of hybrid with different parents
组合
Cross-combination
P1叶色
Leaf color
of P1
P2叶色
Leaf color
of P2
F1叶色
Leaf color
of F1
F2
总株数
Total No.
正常叶
No. of
normal
衰老叶
No. of presenile
leaves
绿叶/衰老叶
Ratio of
normal/pls
χ2
(3:1)
衰老突变体/泸恢 H103
PLS2/RH103
早衰叶
Presenile leaves
正常叶
Normal
正常叶
Normal
918 700 218 3.21 0.07
衰老突变体/蜀恢 527
PLS2/R527
早衰叶
Presenile leaves
正常叶
Normal
正常叶
Normal
5595 4296 1299 3.30 0.10
泸恢 602/衰老突变体
PLS2/pls2
正常叶
Normal
早衰叶
Presenile leaves
正常叶
Normal
1121 856 265 3.23 0.07
衰老突变体/日本晴
PLS2/Nipponbare
早衰叶
Presenile leaves
正常叶
Normal
正常叶
Normal
3916 2982 934 3.19 0.06
衰老突变体/02428
PLS2/02428
早衰叶
Presenile leaves
正常叶
Normal
正常叶
Normal
2654 2016 638 3.16 0.05

2076 作 物 学 报 第 40卷

pls2 定位在标记 RM14704 (8.67 Mb)与 RM14710
(8.92 Mb)之间, 物理距离约 370 kb。为进一步精细
定位, 以 PLS2/日本晴和 PLS2/02428的籼粳交 F2群
体作为定位群体, 在标记 RM14704与 RM14710之
间设计 InDel 标记(表 4), 对 PLS2×日本晴 F2群体
中 934 个隐性极端单株进行连锁分析, 将目的基因
pls2 定位在第 3 染色体短臂上 SL-I-1 (8.53 Mb)与
RM14728 (9.27 Mb)之间(图 5)。随后利用 638 个
“PLS2×02428” F2 群体中的隐性极端单株进行连锁
分析, 将目的基因 pls2定位在标记 SL-I-2 (8.55 Mb)
与 SL-I-5 (8.76 Mb)之间(图 5和表 4), 整合 2次定位
的连锁图谱 , 目的基因 pls2 最终被定位在标记
RM14704 (8 674 283 bp)与 SL-I-5 (8 758 394 bp)之间,
物理距离 84.11 kb。
2.6 pls2定位区间的基因预测
参考网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_
search_locus.shtml)对定位区间内的基因功能进行预
测(表 5), 该区间包含 14个基因(表 5)。

表 4 基因定位所用的引物
Table 4 Primers used in fine mapping
标记
Marker
正向引物
Forward primer (5−3)
反向引物
Reverse primer (5−3)
InDel3-12 CCAGGGATCTTCTCATCCAA CCTGGCTAGCATACCACACA
InDel3-14 TATAGCGGACTGGCCAAACT CCACCCATGTCATCTTCCAT
RM14704 GCTCAGCCAGCACACTTACG TTCCTTCAGCATTCCAGTCTGC
RM14728 CTCAGCGGACTAGAATGCAAGC AAACGGATACATCTTCGCAGAACG
HD56 GCCAGTCAAGTGACCAAACA CACATCACGTGTACAGGTTCG
SL-I-1 TGACCAACAGTTCCCCAAAT TCCCAATCTCCAATCAGAGC
SL-I-2 CGTCTTGCAGGCATTTCAGT CTGATGATCCGGACCAATTT
SL-I-4 TCGTCCTTCAGATCCATTCG CGGTTGATAGTGATGCCAAG
SL-I-5 AGGGGCCCTTAGTGAATCCT GCTGCTCATGCTGTGTGTTT
SL-I-9 ATAACTTTGTCTGTAGCATGTA ATGTCGCTGCCACAGTATCC
SL-I-10 AGATCCCATGAAAACCCCACTAAAA AAGCCACACAACCTAACATGACAAC

表 5 定位区间内基因的功能预测
Table 5 Predicted functions of genes in the mapping interval
基因名称
Locus name
基因注释
Gene annotation
LOC_Os03g15740 Uncharacterized TPR repeat-containing protein, putative, expressed
LOC_Os03g15750 ASC1, putative, expressed
LOC_Os03g15760 Expressed protein
LOC_Os03g15770 Tyrosine protein kinase domain containing protein, putative, expressed
LOC_Os03g15780 Anthranilate synthase component I-1, chloroplast precursor, putative, expressed
LOC_Os03g15790 ZOS3-08-C2H2 zinc finger protein, expressed
LOC_Os03g15800 B4-BTB2-Bric-a-Brac, Tramtrack, Broad Complex BTB domain with B4 subfamily conserved sequence, expressed
LOC_Os03g15810 AAA-type ATPase family protein, putative, expressed
LOC_Os03g15820 Expressed protein
LOC_Os03g15830 Transposon protein, putative, unclassified, expressed
LOC_Os03g15840 Glycosyl transferase, group 1 domain containing protein, expressed
LOC_Os03g15850 Josephin, putative, expressed
LOC_Os03g15860 Mitochondrial carrier protein, putative, expressed
LOC_Os03g15870 Ribosomal protein L4, putative, expressed
第 12期 张 涛等: 水稻早衰叶突变体 PLS2的遗传分析与基因定位 2077


图 5 pls2基因的图位克隆
Fig. 5 Map-based cloning of pls2 gene
A, B: pls2基因的精细定位; C: 定位区间基因 LOC_Os03g15840的编码区存在碱基改变。
A, B: fine mapping of pls2 gene; C: sequence variations of genes in the mapping interval between WT and pls2.

2.7 定位区间基因序列分析
对区间内的 14个基因测序, 包括基因上游 3 kb
启动子区域和下游 1 kb 的终止子区域, 发现基因
LOC_Os03g15840 的编码区存在碱基改变。基因
LOC_Os03g15840全长 3268 bp, 包含 11个外显子和
10 个内含子, CDS 为 1248 bp, 编码 416 个氨基酸,
pls2 基因在 LOC_Os03g15840 的第 9 个外显子中的
第 41位的碱基 C被替换为 T, 导致精氨酸被半胱氨
酸所替换(图 5-C)。通过在 NCBI上的比对分析发现,
它是一个进化上非常保守的位点。对对照和 5 个水
稻品种 IRAT129、日本晴、南京 11、泸恢 H103 (野
生型)、宜香 1B和一个矮秆突变体的测序结果表明,
该位点不存在序列上的差异(图 6-A)。进一步比较 3
个水稻的同源基因以及高粱、玉米、拟南芥、蓖麻、
短柄草、黄瓜、绿藻等 21条氨基酸序列发现, 该位
点非常保守(图 6-B), 该基因进化上与大麦、二穗短
柄草亲缘关系最近, 与高粱、玉米和水稻中另一个
同源基因亲缘关系较近(图 6-C)。推测这个编码含有
糖基转移酶结构域蛋白的基因可能是候选基因。
3 讨论
衰老是植物体生长发育的最后阶段。在衰老过
程中 , 植株体内的营养物质再分配, 由衰老器官转
移到生殖器官等代谢旺盛的部位。植株的衰老对其

2078 作 物 学 报 第 40卷



图 6 突变体基因 pls2在 LOC_Os03g15840的突变位点以及该基因的进化分析
Fig. 6 Mutation position in pls2 of LOC_Os03g15840 compared with the homologous genes, and the phylogenetic tree of pls2
A: 基因 LOC_Os03g15840在不同水稻品种间的 DNA序列比对分析; B: LOC_Os03g15840在不同物种间的氨基酸序列比对分析;
C: pls2基因的进化分析。
A: Sequence BLAST of the LOC_Os03g15840 of pls2 between different rice varieties; B: Sequence BLAST
of the LOC_Os03g15840 of pls2 between different plant species; C: Phylogenetic tree of pls2.

第 12期 张 涛等: 水稻早衰叶突变体 PLS2的遗传分析与基因定位 2079

营养生长和生殖生长都具有重要的影响[30]。过早衰
老会导致产量大幅度降低 , 延迟衰老会增加产量 ,
研究表明 , 水稻叶片每推迟1 d衰老 , 产量可增加
2%[31]。可见研究衰老并寻找切实可行的延缓衰老的
措施对于提高水稻产量具有重要的意义。
突变体PLS2在播种后6~8周出现衰老表型 (温
室), 第4片叶片开始抽出, 老的叶片出现早衰, 叶绿
素严重降解, 叶片黄化、干枯, 六叶期就能被清楚地
区别开突变体和野生型。随着植株的生长, 植株下
部叶片也逐渐提前衰老, 突变体在抽穗期衰老表型
最为明显, 除少数叶片保持绿色外, 大部分叶片变
黄、死亡; 进入灌浆期, 突变体剑叶开始衰老、死亡。
而野生型在相同环境下, 大部分叶片绿色维持到灌
浆期结束。由于突变体叶片从苗期开始早衰, 光合
能力降低, 从而影响到整个植株的生长发育, 其株
高变矮、节间和穗长缩短, 分蘖数和有效分蘖数减
少, 每穗粒数明显减少, 千粒重明显降低。持续黑暗
能够诱导衰老的发生 , 对生长4周的野生型和突变
体的幼苗进行遮光黑暗处理, 突变体叶绿体降解速
率与野生型相比更为快速。突变体各个时期的叶绿
体结构都比较蓬松 , 黑暗处理第2天的突变体其叶
绿体形状不规则, 之后充斥着淀粉粒。
随后将突变体基因pls2定位在水稻第3染色体
标记RM14704 (8 674 283 bp)与SL-I-5 (8 758 394 bp)
间, 物理距离84.11 kb, 包含14个基因。目前该区域
未见存在衰老基因报道 , pls2是一个新的水稻叶片
早衰基因。测序分析仅发现pls2在LOC_Os03g15840
第9个外显子第41位的C被替换为T, 导致精氨酸被
半胱氨酸所替换。通过在NCBI上的比对分析发现 ,
该位点是一个进化上非常保守的位点, 在高等植物
和藻类中没有改变。pls2的候选基因LOC_Os3g15840
编码水稻中的一个糖基转移酶(glycosyltransferases,
GTs)。它是植物次生代谢产物, 参与生物合成、保
持内稳态 , 并调控信号分子和防御化合物的活性 ,
依赖UDP的糖基转移酶 (UDP-dependent glycosyl-
transferases, UGTs)催化糖从活性糖供体转移到小
分子受体上, 形成糖苷键。已有的研究表明, 糖基
转移酶与植株抗性以及植株衰老等过程有一定的
关系。在拟南芥中, 过表达PsUGT1的拟南芥叶片衰
老加速 [32], 干扰AtUGT85A7的拟南芥叶片衰老延
迟、植株生长速率降低、生命周期延长。因此, 本
研究中突变基因LOC_Os3g15840可能是造成叶片
早衰的原因。
4 结论
水稻衰老突变体 PLS2 是一个新的衰老突变体,
由于突变体叶片早衰 , 光合能力较野生型降低 , 导
致株高变矮、节间和穗长缩短, 分蘖数和有效分蘖
数减少, 每穗粒数和结实率下降明显, 千粒重降低,
主穗发育不良, 籽粒灌浆不饱满。黑暗处理能加速
衰老, 在抽穗期前, 突变体叶尖或叶片基部的叶绿
体结构均比野生型的要差, 而且叶绿体中淀粉和嗜
锇颗粒增多。pls2 基因被定位在水稻第 3 染色体上
标记 RM14704 (8 674 283 bp)与 SL-I-5 (8 758 394 bp)
之间 84.11 kb 范围内 , 预测编码含有糖基转移酶
(glycosyltransferases, GTs)结构域蛋白的 LOC_Os3g
15840 是候选基因。这为进一步基因克隆和水稻早
衰机制的研究奠定了基础。
References
[1] Navabpour S, Morris K, Allen R, Harrison E, A-H-Mackerness S,
Buchanan-Wollaston V. Expression of senescence-enhanced
genes in response to oxidative stress. J Exp Bot, 2003, 54:
2285–2292
[2] 袁政, 张大兵. 植物叶片衰老的分子机制. 植物生理学通讯,
2002, 38: 417–422
Yuan Z, Zhang D B. The molecular mechanism of leaf senes-
cence. Plant Physiol Commun, 2002, 38: 417–422 (in Chinese
with English abstract)
[3] He Y, Tang W, Swain J D, Green A L, Jack T P, Gan S. Network-
ing senescence-regulating pathways by using Arabidopsis en-
hancer trap lines. Plant Physiol, 2001, 126: 707–716
[4] Eckardt N A. A new chlorophyll degradation pathway. Plant Cell,
2009, 21: 700–700
[5] Lim P O, Kim H J, Nam H G. Leaf senescence. Annu Rev Plant
Biol, 2007, 58: 115–136
[6] Cha K W, Lee Y J, Koh H J, Lee B M, Nam Y W, Paek N C. Iso-
lation, characterization, and mapping of stay green mutant in rice.
Theor Appl Genet, 2002, 104: 526–532
[7] Lee R H, Lin M C, Chen S C. A novel alkaline α-galactosidase
gene is involved in rice leaf senescence. Plant Mol Biol, 2004, 55:
281–295
[8] Ansari M I, Lee R H, Chen S C. A novel senescence-associated
gene encoding GABA: pyruvate transaminase is up-regulated
during rice leaf senescence. Physiol Plant, 2005, 123: 1–8
[9] Kong Z S, Li M N, Yang W Q, Xu W Y, Xue Y B. A novel nucle-
ar localized CCCH-type zinc finger protein, OsDOS, is involved
in delaying leaf senescence in rice. Plant Physiol, 2006, 141:
1376–1388
[10] Jiang H W, Li M R, Liang N T, Yan H B, Wei Y B, Xu X L, Liu J,
Xu Z F, Chen F, Wu G J. Molecular cloning and function analysis
of the stay green gene in rice. Plant J, 2007, 52: 197–209
[11] Park S Y, Yu J W, Park J S, Li J J, Yoo S C, Lee N Y, Lee S K,
Jeong S W, Seo H S, Koh H J, Jeon J S, Park Y, Paek N C. The
senescence-induced stay green protein regulates chlorophyll

2080 作 物 学 报 第 40卷

degradation. Plant Cell, 2007, 19: 1649–1664
[12] Kusaba M, Ito H, Morita R, Iida S, Sato Y, Fujimoto M, Kawasa-
ki S, Tanaka R, Hirochika H, Nishimura M, Tanaka A. Rice
NON-YELLOW COLORINGI is involved in light-harvesting
complex II and grana degradation during leaf senescence. Plant
Cell, 2007, 19: 1362–1375
[13] Wu Z M, Zhang X, He B, Diao L P, Sheng S L, Wang J L, Guo X
P, Su N, Wang L F, Jiang L, Wang C M, Zhai H Q, Wan J M. A
chlorophyll-deficient rice mutant with impaired chlorophyllide
esterification in chlorophyll biosynthesis. Plant Physiol, 2007,
145: 29–40
[14] Qiao Y L, Jiang W Z, Lee J H, Park B S, Choi M S, Piao R H,
Woo M O, Roh J H, Han L Z, Paek N C, Seo H S, Koh H J.
SPL28 encodes a clathrin-associated adaptor protein complex 1,
medium subunit 1 (AP1M1) and is responsible for spotted leaf
and early senescence in rice (Oryza sativa). New Phytol, 2009,
185: 258–274
[15] Li F Z, Hu G C, Fu Y P, Si H M, Bai X M, Sun Z X. Genetic
analysis and high-resolution mapping of premature senescence
gene Pse(t) in rice (Oryza sativa L.). Genome, 2005, 48: 738–746
[16] Wang J, Wu S J, Zhou Y, Zhou L H, Xu J F, Hu J, Fang Y X, Gu
M H, Liang G H. Genetic analysis and molecular mapping of a
presenescing leaf gene pls1 in rice (Oryza sativa L.). Chin Sci
Bull, 2006, 51: 2986–2992
[17] Yan W Y, Ye S, Jin Q S, Zeng L J, Peng Y, Yan D W, Yang W B,
Yang D L, He Z H, Dong Y J, Zhang X M. Characterization and
mapping of a novel mutant sms1 (senescence and male sterility 1)
in rice. J Genet Genomics, 2010, 37: 47–55
[18] Fang L K, Li Y F, Gong X P, Sang X C, Ling Y H, Wang X W,
Cong Y F, He G H. Genetic analysis and high-resolution mapping
of pls3 (presenescing leaf 3) in rice. Chin Sci Bull, 2010, 55:
1676–1681
[19] Yang Y L, Rao Y C, Liu H J, Fang Y X, Dong G J, Huang L C,
Leng Y J, Guo L B, Zhang G H, Hu J, Gao Z Y, Qian Q, Zeng D
L. Characterization and fine mapping of an early senescence mu-
tant (es-t) in Oryza sativa L. Chin Sci Bull, 2011, 56: 2437−2443
[20] 杜青, 方立魁, 桑贤春, 凌英华, 李云峰, 杨正林, 何光华, 赵
芳明. 水稻叶尖早衰突变体 lad的形态、生理分析与基因定位.
作物学报, 2012, 38: 168–173
Du Q, Fang L K, Sang X C, Ling Y H, Li Y F, Yang Z L, He G H,
Zhao F M. Analysis of phenotype and physiology of leaf apex
dead mutant (lad) in rice and mapping of mutant gene. Acta
Agron Sin, 2012, 38: 168–173 (in Chinese with English abstract)
[21] 徐芳芳, 桑贤春, 任德勇, 唐彦强, 胡宏伟, 杨正林, 赵芳明,
何光华. 水稻早衰突变体 esl2的遗传分析和基因定位. 作物学
报, 2012, 38: 1347–1353
Xu F F, Sang X C, Ren D Y, Tang Y Q, Hu H W, Yang Z L, Zhao
F M, He G H. Genetic analysis and gene mapping of early senes-
cence leaf mutant esl2 in rice. Acta Agron Sin, 2012, 38:
1347–1353 (in Chinese with English abstract)
[22] 苗润隆, 蒋钰东, 廖红香, 徐芳芳, 何光华, 杨正林, 赵芳明,
桑贤春. 水稻早衰突变体 esl3 的鉴定与基因定位. 作物学报,
2013, 39: 862–867
Miao R L, Jiang Y D, Liao H X, Xu F F, He G h, Yang Z L, Zhao
F M, Sang X C. Identification and gene mapping of rice early
senescent leaf (esl3) mutant. Acta Agron Sin, 2013, 39: 862–867
(in Chinese with English abstract)
[23] 王复标, 黄福灯, 程方民, 李兆伟, 胡东维, 潘刚, 毛愉婵. 水
稻生育后期叶片早衰突变体的光合特性与叶绿体超微结构观
察. 作物学报, 2012, 38: 871–879
Wang F B, Huang F D, Cheng F M, Li Z W, Hu D W, Pan G, Mao
Y C. Photosynthesis and chloroplast ultra-structure characteristics
of flag leaves for a premature senescence rice mutant. Acta Agron
Sin, 2012, 38: 871–879
[24] Undan J R, Tamiru M, Abe A, Yoshida K, Kosugi S, Takagi H,
Yoshida K, Kanzaki H, Saitoh H, Fekih R. Mutation in OsLMS, a
gene encoding a protein with two double-stranded RNA binding
motifs, causes lesion mimic phenotype and early senescence in
rice (Oryza sativa L.). Genes Genet Syst, 2012, 87: 169–179
[25] Lin A H, Wang Y Q, Tang J Y, Xue P, Li C L, Liu L C, Hu B,
Yang F Q, Loake G J, Chu C C. Nitric oxide and protein
S-nitrosylation are integral to hydrogen peroxide induced leaf cell
death in rice. Plant Physiol, 2012, 158: 451−464
[26] 张涛, 郑家奎, 蒋开锋, 郑建敏, 杨乾华, 杨莉, 万先齐, 曹应
江. 水稻航天衰老突变体基因psl2的表型和遗传分析. 分子植
物育种, 2010, 8: 245–251
Zhang T, Zheng J K, Jiang K F, Zheng J M, Yang Q H, Yang L,
Wan X Q, Cao Y J. Phenotypes and genetic analysis of a senes-
cence mutant by aeronautics in rice. Mol Plant Breed, 2010, 8:
245–251(in Chinese with English abstract)
[27] 张涛. 水稻糙米蛋白质含量的 QTL 定位及香稻的资源研究.
四川农业大学博士学位论文, 四川雅安, 2007. p 25
Zhang T. QTL Mapping of Brown Rice Protein Content in a RIL
Population of Rice and Analysis of Genetic Diversity of Aromatic
Rice Varieties. PhD Dissertation of Sichuan Agricultural University,
Sichuan, China, 2007. p 25 (in Chinese with English abstract)
[28] Rogers S O, Bendich A J. Extraction of DNA from milligram
amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant
Mol Biol, 1985, 5: 69–76
[29] Lin Q B, Wang D, Dong H, Gu S H, Cheng Z J, Gong J, Qin R Z,
Jiang L, Li G, Wang J L, Wu F Q, Guo X P, Zhang X, Lei C L,
Wang H Y, Wan J M. Rice APC/CTE controls tillering by medi-
ating the degradation of MONOCULM1. Nat Commun, 2012, 3:
752, DOI: 10.1038/ncomms1716 www.nature.com/naturecommu-
nications
[30] Buchanan-Wollaston V, Page T, Harrison E, Breeze E, Lim P O,
Nam H G, Lin J F, Wu S H, Swidzinski J, Ishizaki K, Leaver C J.
Comparative transcriptome analysis reveals significant differ-
ences in gene expression and signaling pathways between deve-
lopmental and dark/starvation induced senescence in Arabidopsis.
Plant J, 2005, 42: 567–585
[31] 马跃芳, 陆定志. 灌水方式对杂交水稻衰老及生育后期一些
生理活性的影响. 中国水稻科学, 1990, 4: 56–62
Ma Y F, Lu D Z. Effect of irrigation modes on the senescence and
physiological activity in hybrid rice after heeding. Chin J Rice Sci,
1990, 4: 56–62 (in Chinese with English abstract)
[32] Woo H H, Jeong B R, Koo K B, Choi J W, Hirsch A M, Hawes M
C. Modifying expression of closely related UDP-glycosyltrans-
ferases from pea and Arabidopsis results in altered root deve-
lopment and function. Physiol Plant, 2007, 130: 250–260