全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(8): 1391−1399 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2011ZX08005-002)和新疆生产建设兵团博士基金项目(2012BB007)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 黄先忠, E-mail: xianzhongh106@163.com, Tel: 0993-2057262
第一作者联系方式: E-mail: guchaomail@163.com, Tel: 0993-2057262
Received(收稿日期): 2013-01-29; Accepted(接受日期): 2013-04-22; Published online(网络出版日期): 2013-05-20.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130520.1157.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01391
海岛棉 GbMFT1基因的克隆及表达分析
顾 超 1 李 超 1 李晓波 2 肖向文 2 崔百明 1 黄先忠 1,*
1石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室, 新疆石河子 832003; 2中国科学院新疆理化技术研究所 / 干旱区植物资源化学
重点实验室, 新疆乌鲁木齐 830011
摘 要: 通过RT-PCR和RACE技术, 从新疆海岛棉品种新海 14中克隆得到了一个MFT (MOTHER OF FT AND TFL1)
类似基因, 命名为 GbMFT1 基因(GenBank 登录号为 KC513744)。GbMFT1 基因的开放阅读框(ORF)为 528 bp, 编码
175个氨基酸的蛋白, 含一个磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)结构域。GbMFT1蛋白的羧基端含有 MFT蛋白都含有的
脯氨酸。系统进化树分析表明 GbMFT1编码产物与葡萄、番茄亲缘关系较近, 属于同一进化分支。实时荧光定量 PCR
分析表明, GbMFT1基因在棉花的不同组织中均有表达, 在花瓣中的表达量较高; 在纤维发育的不同时期中均有表达,
在开花后 2 d的胚珠、9 d的纤维中表达量最高。半定量 RT-PCR结果表明, GbMFT1基因在刚萌发的种子中表达量高,
用不同浓度的 ABA处理种子后其表达变化不明显, 表明 GbMFT1基因的表达不受 ABA的调节。
关键词: GbMFT1基因; 早花; 表达分析; 成花素
Cloning and Expression Analysis of GbMFT1 Gene in Gossypium barbadense L.
GU Chao1, LI Chao1, LI Xiao-Bo2, XIAO Xiang-Wen2, CUI Bai-Ming1, and HUANG Xian-Zhong1,*
1 Key Laboratory of Agrobiotechnology, College of Life Sciences, Shihezi University, Shihezi 832003, China; 2 Key Laboratory of Chemistry of Plant
Resources in Arid Regions, Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830011, China
Abstract: Angiosperm genes sharing a conserved phosphatidylethanolamine-binding (PEBP) domain have been shown to be in-
volved in the control of flowering time.The family is divided into three subfamilies, FT-like, TFL1-like and MFT-like. Evolution
analysis showed that MOTHER OF FT AND TFL1 (MFT) is the ancestral form of all PEBP genes in plant; however the exact fuc-
tion of MFT is still unknown. One MFT-like homolog, designated GbMFT1, was isolated from Gossypium barbadense L. cv.
Xinhai 14 using RT-PCR and RACE methods. The open reading frame of GbMFT1 is 528 bp in length, which encodes a putative
protein of 175 amino acids. GbMFT1 gene has a PEBP conserved motif. In consistency with almost all MFT-like proteins,
GbMFT1 has a conserved proline residue near the C-terminus. Phylogenetic analysis revealed that GbMFT1 has high sequence
similarities with VvMFT and SP2G and they belong to the same clade. The result of qRT-PCR assay indicated that GbMFT1 ex-
pressed in different tissues of cotton, with a maximum expression in petal, and in different developmental stages of fibre, espe-
cially in two-day ovule and nine-day fibre. Semiquantitative RT-PCR assay indicated that GbMFT1 had a high level of transcrip-
tion at the beginning of seed germination. Exogenous abscisic acid (ABA) of different concentrations resulted in no significant
change in GbMFT1 expression in germinating seeds, indicating that the expression of this gene is not regulated by ABA.
Keywords: GbMFT1 gene; Early flowering; Gene expression; Florigen
金鱼草 CENTRORADIALIS (CEN)基因的突变造
成正常的无限花序被破坏, 茎端形成顶花, 克隆研
究表明 CEN 蛋白与动物的磷脂酰乙醇胺结合蛋白
(phosphatidylethanolamine-binding proteins, PEBP)
很相似[1]。利用 CEN基因作为异源探针从拟南芥中
克隆了一个同源基因 TERMINAL FLOWER 1 (TFL1),
tfl1 突变体开花提早, 形成末端花, 顶端分生组织由
无限生长变成有限生长, 表明 TFL1 具有维持顶端
分生组织无限生长的能力[2]。FLOWERING LOCUS T
(FT)是拟南芥中的一个开花位点的控制基因, FT 和
1392 作 物 学 报 第 39卷

TFL1 氨基酸序列有 71%的相似性, 二者同属 PEBP
基因家族[3-4]。FT和 TFL1蛋白晶体结构分析表明二
者高度相似, 形成一个包含阴离子结合位点的口袋,
口袋入口处的关键氨基酸对于 FT和 TFL1功能的转
变起着重要作用[5]。TFL1的 His88/Asp144在结合口
袋的入口处形成氢键, 而 FT的 Tyr85/Gln140不能形
成氢键, 这在决定蛋白的特定功能上起着关键作用;
把这个口袋里的单个氨基酸改变, 就可以使 FT变成
TFL1, 相反也是这样[6]。拟南芥基因组的 PEBP基因
家族还包括 Arabidopsis thaliana CENTRORADIALIS
(ATC)[7]、BROTHER OF FT AND TFL1 (BFT)[8]、
MOTHER OF FT AND TFL 1 (MFT)[9]和 TWIN
SISTER OF FT (TSF)[10]。系统进化研究表明, PEBP
家族基因主要分为 MFT-like, FT-like和 TFL1-like 3
个亚家族, 该基因家族成员起着开花促进因子或开
花抑制因子的作用。
FT 是一个开花促进因子, 它整合来自不同途径
的信号从而控制开花, 已经证明 FT蛋白是一个从叶
片到顶端分生组织的长距离运输信号, 是拟南芥的
成花素[11-13]。水稻中的 HEADING DATE 3a (Hd3a)
是拟南芥FT的同源基因, Hd3a蛋白即水稻中的成花
激素[14], Hd3a基因在叶片中表达并通过微管组织运
输到顶端分生组织, 同成花素受体 14-3-3蛋白结合,
然后又附着到另一种转录因子 OsFD1上形成成花素
激活复合体 , 使开花基因 OsMADS15 功能活跃起
来[15]。近年来研究发现, 除了对开花的控制功能以
外, FT-like和 TFL1-like基因还涉及到很多不同功能,
如马铃薯块茎的形成[16]、茎的伸长[17]、杨树芽的休
眠 [18]、顶端分生组织生长前的衰减 [19]等。相对于
FT-like和 TFL1-like基因, MFT-like基因的研究仍然很
有限。进化分析认为MFT是植物 PEBP家族基因的祖
先[20]。MFT基因也具有促进开花的作用, 但失去功能
的 mft突变体在正常生长条件下没有明显的表型[9]。
ABA和 GA是种子适应外界环境的生物和非生
物胁迫调节种子发芽的 2 个重要的拮抗激素[21]。近
年来的研究表明, MFT参与了ABA和GA信号通道在
种子发芽过程中起着重要的调节作用[22]。拟南芥 MFT
在种子萌发过程中的胚根和下胚轴的转变区特异表达,
MFT 的转录分别受到 ABA 信号通道中的 2 个关键的
转录因子ABA-INSENSITIVE3 (ABI3)和ABI5的调节;
并且 DELLA 蛋白 RGA-LIKE2 (RGL2)可以明显地促
进 MFT的转录。表明 MFT通过组成 ABA信号通道中
的反馈调节环来促进种子的发芽[22]。对小麦 MFT同源
基因 MFT-3A的研究也表明, MFT-3A在小麦种子的发
芽中起着重要的调节作用[23]。
棉花是重要的经济作物, 开花早晚和产量、品
质性状之间存在显著相关 , 并且影响霜前皮棉产
量、纤维长度等。已有的研究表明棉花开花途径中
也存在 PEBP 基因家族[24-25], 但相对于拟南芥和水
稻等植物, 棉花的 PEBP 基因家族的功能研究报道
较少。Argiriou等[24]从棉花中分离到了 TFL1-like基
因 GhTFL1a和 GhTFL1b, 二者具有相似的外显子和
内含子结构, 但在不同组织中表达模式不同。东锐
等[25]从陆地棉中克隆了一个 FT-like 基因 GhFTL1,
该基因具有 FT-like基因的结构, 且在拟南芥中过量
表达, 长日照下明显的促进早花。本研究从海岛棉
中克隆得到了一个 MFT类似基因, 对其组织表达和
ABA 胁迫诱导表达等进行分析, 为进一步研究棉花
PEBP基因家族的功能奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 参试材料
海岛棉品种新海14 由新疆农业科学院经济作物
研究所李雪源研究员提供。2012 年 4 月 20 日在石
河子大学试验农场播种新海 14。采集棉花幼苗期的
根、茎、叶, 开花期的花瓣、苞叶, 开花前 5、3 和
1 d及开花当天到开花后 6 d的胚珠, 开花后 9~18 d
间每 3 d的纤维样。将所有样品立即浸于液氮, –80
℃保存备用。
1.2 菌种、质粒与试剂
大肠杆菌 DH5α、农杆菌 GV3101、 pCAM
BIA2300-CaMV35S-OCS 质粒为本实验室保存; 克
隆载体 pGEM-T Easy、凝胶回收试剂盒、限制性内
切酶等均购自 Promega; 反转录试剂盒, DNA 分子
量Marker, Ex Taq等购自 TaKaRa; cDNA末端 RACE
试剂盒采用 Clontech 公司的 SMART RACE cDNA
Amplification Kit。
1.3 总 RNA提取和 cDNA第 1链合成
采用改良的 CTAB 法参照文献[26]的方法提取
棉花各组织的 RNA。总 RNA 经琼脂糖凝胶电泳
检测 , 质量完好的 RNA 置–80℃保存备用。参
照 TaKaRa 公司提供的试剂盒说明书合成 cDNA
第 1链。
1.4 基因克隆
以拟南芥AtFT蛋白的氨基酸序列(AAD37380.1)
为探针(query), 利用 tBlastN (http://ncbi.nlm.nih.gov/
第 8期 顾 超等: 海岛棉 GbMFT1基因的克隆及表达分析 1393


Blast), 在棉花的表达序列标签(EST)数据库中搜索
到一个相似的 EST (GenBank登录号为 ES800631.1)
序列。该序列含一个最大的完整开放阅读框(ORF),
并含部分 5′UTR, 设计该 ORF的引物 GbMFT1-F和
GbMFT1-R (表 1), 以开花当天的胚珠 cDNA第一链
为模板进行 RT-PCR扩增, 体系为 20 μL, 含 cDNA 2
μL (约 50 ng)、10×Ex Taq buffer 2.0 μL、2.5 mmol L–1
dNTPs 1.5 μL、10 μmol L–1的上下游引物各 0.5 μL、
5 U μL–1的 Ex Taq 0.2 μL。反应程序为 94℃预变性
2 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 45 s, 35个循环后,
72℃延伸 10 min。在 1%的琼脂糖凝胶电泳上检测并
用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收 PCR 产物 , 与
pGEM-T Easy载体连接、转化 DH5α感受态细胞, 将
鉴定正确的阳性克隆质粒送北京六合华大基因有限
公司测序。
1.5 3′RACE扩增
按照说明书合成 3′RACE的 cDNA。3′RACE引
物为GbMFT1-3-GSP1和GbMFT1-3-GSP2 (表 1), 扩
增 GbMFT1 基因的 3′RACE 扩增包含两部分, 第 1
轮反应的反应液含 cDNA 1.0 μL、10×buffer 2.0 μL、
2.5 mmol L–1 dNTPs 1.5 μL、10×UPM 2.0 μL、10 μmol
L–1 GbMFT1-3-GSP1 0.5 μL、5 U μL–1的 Ex Taq 0.2
μL、ddH2O补到 20 μL。反应程序为 94℃预变性 5 min;
94℃ 30 s, 68℃ 30 s, 72℃ 2 min, 25个循环。第 2
轮反应的反应液含第 1 轮反应液 1.0 μL、10×buffer
2.0 μL、2.5 mmol L–1 dNTPs 1.5 μL、10×UPM 2.0 μL、
10 μmol L–1 GbMFT1-3-GSP2 0.5 μL、5 U μL–1的 Ex
Taq 0.2 μL, 用 ddH2O 补足到 20 μL。反应程序为
94℃预变性 5 min; 94℃ 30 s, 68℃ 30 s, 72℃ 2 min,
25个循环。在 1%琼脂糖凝胶电泳检测并用琼脂糖凝
胶回收试剂盒回收 PCR 产物 , 将回收产物与
pGEM-T Easy载体连接、转化 DH5α感受态细胞, 将
鉴定正确的阳性克隆质粒送北京六合华大基因有限
公司测序。
1.6 序列比较及进化树分析
利用 MEGA 4.1 进行基因家族的系统进化分
析 [27], 利用 ClustalW 程序比对蛋白序列 , 利用
Neighbor-Joining方法构建进化树, 其中进行 1000次
Bootstrap分析以使得分枝的结果更可靠。
1.7 基因的组织表达分析
根据获得的目的基因序列, 设计实时荧光定量
PCR (qRT-PCR)引物 GbMFT1-RTF和 GbMFT1-RTF
(表 1)。以棉花的 Ubiquitin7 (UBQ7, GenBank登录号
为 DQ116441)基因序列设计内参引物 UBQ7F 和
UBQ7R (表 1), 以棉花不同组织的 cDNA为模板, 采
用 TaKaRa公司的 SYBR Premix Ex Taq II (Prefect
real-time)试剂盒, 利用 Roche 公司的 Light Cycle
480II 实时荧光定量 PCR 仪进行扩增。检测每份样
品的基因和内参基因 Ct 值(循环阈值), 每份样品 3
次重复。采用 2–∆Ct 法分析实验数据, 相对定量, 先
分别计算出每组的∆Ct=Ct,目的基因–Ct,内参基因, 再根据∆Ct
求出 2–∆Ct以及标准误。使用 Microsoft Excel 2007软
件处理数据并作图。
1.8 GbMFT1基因在 ABA胁迫下的表达分析
参照文献[22]分析 ABA胁迫诱导基因的表达。
将棉花种子分别播种在含不同浓度 ABA (0、0.5、
1.0、5.0和 10.0 μmol L–1)的 1/2 MS固体培养基, 其
成分含 1%的葡萄糖、2.2 g L–1 MS培养基(Duchefa

表 1 本研究所用的引物
Table 1 PCR primers used in this study
引物
Primer
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
用途
Function
GbMFT1-F GGGGTACCATGGCCCGGTCCGTTGAACCACTGG
GbMFT1-R CGGGATCCCTAACGTTTCTTAGCTGCTGGTTCC
基因克隆 Gene clone

GbMFT1-RTF CAAGTGAACCAAGATTGAGGGAG
GbMFT1-RTR GAGCACCCGCCACTTGAATCCTT
UBQ7F AGAGGTCGAGTCTTCGGACA
UBQ7R GCTTGATCTTCTTGGGCTTG
基因表达分析
Gene expression
内参基因
Reference Gene
GbMFT1-3-GSP1 TTCCAGAGGGACAAGATGCTACCAA
GbMFT1-3-GSP2 TAAGCAGGAAGGAGCAATGGAAGGA
3′RACE
UPM (long)
UPM (short)
CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
CTAATACGACTCACTATAGGGC Universal Primer A Mix
下画线部分分别是酶切位点 Kpn I和 BamH I。
The underlines indicate the sites Kpn I and BamH I for restricted digestion, respectively.
1394 作 物 学 报 第 39卷

Biochemie、Netherland)、0.05%的 MES (Amersham,
America)和 0.8%琼脂, pH 5.8。将播种后培养皿放入
28℃的恒温培养箱内培养, 20 h胚根已经伸出种壳,
此时收集不同处理的棉花种子; 24 h和 70 h再次收
集不同处理的棉花种子并将其立即浸于液氮中, –80
℃保存备用。采用半定量 RT-PCR 方法[25]分析目的
基因的表达情况。基因特异引物是 GbMFT1-RTF和
GbMFT1-RTR, 内参基因为 UBQ7。
2 结果与分析
2.1 海岛棉 GbMFT1基因的克隆与分析
通过生物信息学分析棉花的 EST 序列
ES800631.1, 发现该 EST 含一个最长的 ORF, 推测
编码的氨基酸序列和植物的 MFT蛋白高度相似。根
据 EST 设计引物, 通过 RT-PCR 和 RACE 技术从海
岛棉中扩增了 MFT的同源基因。该基因的 cDNA序
列长度为 856 bp, 含一长度为 528 bp 的最大 ORF,
5′UTR为 138 bp, 3′UTR为 190 bp, 推测 ORF编码
175 个氨基酸 (图 1), 将该基因命名为 GbMFT1
(GenBank登录号为 KC513744)。比较二倍体雷蒙德
氏棉(Gossypium raimondii)的基因组结构, 表明雷蒙
德氏棉的 GrMFT1 基因从 ATG 到 TAG 基因序列全
长 902 bp。将其与 GbMFT1基因的 ORF比较, 表明
棉花 MFT1 基因含 4 个外显子和 3 个内含子(图 2),
这和其他植物的 MFT-like 基因结构类似 , 并且
GbMFT1和 GrMFT1的 ORF有 97.9%相似性。
Blast 比对分析表明, GbMFT1 蛋白含有高度保
守的 PEBP 结构域(图 3), 属于 PEBP 家族蛋白。
G b M F T 1 和 G h F T L 1 ( G e n B a n k 登录号为
ADK95113.1) , GhTFL1a (GenBank 登录号为
ABW24967.1)和 GhTFL1b (GenBank 登录号为
ABW24968.1)的相似性分别为 52.0%和 53.7%。


图 1 GbMFT1基因的全长序列及推断的氨基酸序列
Fig. 1 Full-length sequence and deduced amino acids sequence of GbMFT1
方框代表起始密码子; *代表终止密码子; 下画线代表 poly(A)。
Frame: start codon; * termination codon; underline: poly(A).


图 2 GbMFT1内含子及外显子分析
Fig. 2 Analysis of intron and exon of GbMFT1
ATG和 TAG分别代表起始密码子和终止密码子, 黑色方框和直线分别代表外显子和内含子, 数字表示外显子和内含子的长度。
AGT and TAG represent initiation codon and termination codon, respectively. Black box and lines represent exponic and intronic regions,
respectively. Numbers indicate the length of exons and introns (base pairs).
第 8期 顾 超等: 海岛棉 GbMFT1基因的克隆及表达分析 1395



图 3 GbMFT1蛋白的磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)保守结构域
Fig. 3 Conserved phosphatidylethanolamine-binding proteins (PEBP) domain in GbMFT1

GhMFT1和 AtMFT (GenBank登录号为 AAD37380.1)
氨基酸序列的相似性为 50.6%。将拟南芥中的 6 个
PEBP 基因家族成员, 即 AtFT (GenBank 登录号为
AAF03936.1)、AtTFL1 (GenBank 登录号为 AAB
41624.1), AtTSF (GenBank 登录号为 AAF03037.1),
AtMFT (GenBank 登录号为 AAD37380.1), AtBFT
(GenBank登录号为Q9FIT4.1)及ATC (GenBank登录
号为 BAA75931.1), 与本研究克隆的棉花 GbMFT1、
棉花 GhFTL1、GhTFL1a和 GhTFL1b的氨基酸序列
比对分析(图 4), 表明 GbMFT1 蛋白含有 FT-like 和
TFL1-like 都存在的 D-P-D-x-P (图 4-A)和 G-x-H-R
(图 4-D)基序。GbMFT1中的第 85位色氨酸(W)取代
了 FT-like中关键的酪氨酸(Y) (图 4-B)。在 GbMFT1
蛋白羧基末段含一个保守的脯氨酸(P) (图 4-F), 该
脯氨酸只在 MFT-like被发现, 而在 FT-like和 TFL1-
like中至今还没有发现类似的保守氨基酸, 另外, 脯
氨酸被认为具有改变蛋白质结构的能力[28]。Hedman
等[20]研究发现被子植物MFT-like含有 2个亚家族(A
和 B), 双子叶植物含 A和 B亚家族, 单子叶禾本科
植物只含 B亚家族, 在 MFT-like基因的进化过程中
其中一类 MFT-like基因丢失, 而 A亚家族基因一般
羧基末端都含保守的脯氨酸, B亚家族基因一般都含
保守的谷氨酸(E)。本研究获得的 GbMFT1 蛋白在羧
基末段都含有保守的脯氨酸, 第 95 位为谷氨酸(图
4-C), 表明 GbMFT1 可能属于 MFT-like 家族中的 B
亚家族。


图 4 GbMFT1蛋白氨基酸序列同其他物种 MFT同源蛋白的多重比对
Fig. 4 Multiple sequences alignment of GbMFT1 protein amino acid sequence with that of other species
A: D-P-D-x-P基序; B: 区分 FT/TFL1的关键氨基酸酪氨酸 Tyr (Y)/组氨酸 His (H); C: B亚家族中的保守谷氨酸 Glu (E), D: G-x-H-R基
序, E: FT/TFL1家族蛋白羧基端保守基序; F: 大多数 MFT-like中保守的脯氨酸 Pro (P)。
A: D-P-D-x-P motif; B: amino acids Tyr/His that are critical to define FT or TFL1-like proteins; C: glutamic acid (E) residues conserved in
clade B; D: G-x-H-R motif; E: conserved motif involved in FT/TFL1 protein family; F: proline (P) residue found in most MFT protein.
1396 作 物 学 报 第 39卷

2.2 GbMFT1蛋白进化树分析
从GenBank数据库中下载 12个物种 33个 PEBP
家族同源基因, 其编码的氨基酸序列同 GbMFT1 比
较, 相似性最高达 72%。利用 MEAG 4.1 构建系统
进化树(图 5), 这些家族蛋白可分为 3个主要的分支
即 FT-like、TFL-like和 MFT-like。棉花 GbMFT1与
葡萄 VvMFT (GenBank 登录号为 ABI99469.1)蛋白,
番茄 SP2G (GenBank 登录号为 AAO31791.1)蛋白
亲缘关系较近 , 都属于 MFT-like 家族中的 B 亚
家族。


图 5 GbMFT1与其他高等植物 PEBP蛋白的进化树分析(0.05: 相对遗传距离)
Fig. 5 Phylogenetic tree of GbMFT1 and other PEBP genes from higher plant species (0.05: relative genetic distance)
▲: 克隆的海岛棉的 GbMFT1。MdFT: 苹果; CuFT: 温州蜜柑; PtFT1和 PtMFT: 毛果杨; GmFT: Glycine max;
SP3D、SP和 SP2G: 番茄; InFT: 牵牛花; HvFT2、HvFT1和 HvMFT1: 大麦; Hd3a、RCN1、RCN2和 OsMFT2: 水稻;
DET和 LF: 豌豆; VvTFL1和 VvMFT: 葡萄; CEN: 金鱼草; PnFTL4a: 黑杨; ZEN9和 ZCN10: 玉米。
Triangle indicates GbMFT1 protein used in this study. MdFT: Malus × domestica; CuFT: Citrus unshiu;
PtFT1, PtMFT: Populus trichocarpa; GmFT: Glycine max; SP3D, SP, SP2G: Lycopersicon esculentum; InFT: Ipomoea nil;
HvFT2, HvFT1, HvMFT: Hordeum vulgare; Hd3a, RCN2, RCN1, OsMFT2: Oryza sativa; DET, LF: Pisum sativum;
VvTFL1, VvMFT: Vitis vinifera; CEN: Antirrhium majas; ZEN9, ZCN10: Zea mays.
第 8期 顾 超等: 海岛棉 GbMFT1基因的克隆及表达分析 1397


2.3 GbMFT1基因的组织表达分析
qRT-PCR 实验结果表明, GbMFT1 基因在海岛
棉的花瓣、胚珠(15 DPA)、茎、叶、根和苞叶中均
表达, 在花瓣中有较高的表达量(图 6)。对海岛棉的
分析表明, 从开花前 5 d的胚珠到开花后 18 d的纤
维等不同发育时期 GbMFT1 基因都有表达, 而在开
花后 2 d 的胚珠和开花后 9 d 的纤维中表达量较高
(图 7)。


图 6 棉花不同组织中的 GbMFT1基因的表达
Fig. 6 Expression patterns of GbMFT1 in different stages of
tissues development of cotton


图 7 棉花纤维发育不同时期 GbMFT1基因的表达
Fig. 7 Expression patterns of GbMFT1 in different fiber
development periods of cotton

2.4 GbMFT1基因在 ABA胁迫下的表达分析
半定量 RT-PCR实验表明, GbMFT1基因在萌发
的种子中有较高的表达量, 用不同浓度的 ABA胁迫
处理萌发的种子, 随着ABA含量的增加GbMFT1的
表达变化不明显(图 8)。用不同浓度的 ABA 胁迫处
理 70 h后表明, GbMFT1基因在种子萌发的过程中
都有表达, 但没有明显的差异(图 9)。


图 8 不同浓度 ABA处理萌发种子 20 h GbMFT1基因的表达
Fig. 8 GbMFT1 expression of germinating seeds treated for 20
hours with different ABA concentrations
1: 0 μmol L–1; 2: 0.5 μmol L–1; 3: 1.0 μmol L–1; 4: 5.0 μmol L–1;
5: 10.0 μmol L–1 ABA.

图 9 不同浓度 ABA处理萌发种子 24 h和 72 h后 GbMFT1基
因的表达
Fig. 9 GbMFT1 expression of germinating seeds treated for 24
hours and 72 hours with different ABA concentrations
1, 3, 5: 处理 24 h; 2, 4, 6: 处理 70 h。1, 3, 5: treated for 24 hours;
2, 4, 6: treated for 70 hours.

3 讨论
PEBP 家族蛋白是植物中存在的一类分子量较
小序列相对保守的家族蛋白 , 分为 3 个亚家族
MFT-like、FT-like 和 TFL1-like [20, 29]。对该基因家
族中功能研究较为清楚的是 FT 和 TFL1 基因, 二者
蛋白的氨基酸序列高度相似, 但 FT起着促进开花的
作用, 而 TFL1却是开花抑制基因[8]。研究认为, MFT
是 FT 和 TFL1 的祖先, 早在地钱和苔藓植物中就已
经含有MFT基因, 而 FT和 TFL1基因出现在石松门
分化以后[20]。在双子叶植物如拟南芥[8]、番茄[30]、
葡萄[31]和杨树[32]中, PEBP 家族的基因为 6~9 个。
PEBP 的家族成员数量在单子叶植物中大约是双子
叶植物的 3~4 倍, 在水稻[29]、小麦[29]和玉米[33]中分
别有至少 19、20 和 24 个, 且分布也不同。如拟南
芥的 TFL1-like、MFT-like 和 FT-like 亚家族基因的
数量比例为 3∶1∶2, 水稻中为 4∶2∶13, 玉米中
为 6∶3∶15 [34]。
本研究从新疆海岛棉品种新海14 中克隆得到了
一个MFT同源基因GbMFT1, 氨基酸比对分析表明,
该基因编码的蛋白包含 FT-like 和 TFL1-like 亚家族
的保守基序, 并且在羧基末段含有只在 MFT-like 家
族中含有的保守氨基酸脯氨酸。根据氨基酸保守位
点的差异, GbMFT1可能属于 B亚家族, 说明棉花中
可能还存在 A亚家族的 MFT基因。系统进化分析表
明 GbMFT1和葡萄 VvMFT的亲缘关系较为接近, 它
们都属于 B 亚家族。研究发现, 大部分 B 亚家族的
植物多为多浆果实的双子叶植物, SP2G是番茄中的
MFT 同源基因, 在番茄的各个组织中都有表达, 尤
其是在子房、雌蕊、和果实中的表达量极高[30]。葡
萄 VvMFT 的表达类似于 VvFT 的表达, 它可能是葡
萄中的开花促进因子[31]。另外, 在苔藓植物中, MFT
基因与孢子体的发育有关[35], 说明 MFT 可能也与植
物的受精作用有关, 本研究表明, GbMFT1 基因在棉
花开花后 2 d 达到高峰, 而棉花从授粉到受精完成
1398 作 物 学 报 第 39卷

一般需要 24~30 h, GbMFT1基因与棉花的受精作用
是否存在一定关系, 还需进一步证实。拟南芥 MFT
基因参与 ABA 信号在发芽调控中的重要调节作用
[22]。用不同浓度 ABA胁迫处理棉花种子, 刚萌发的
种子中可以检测到 GbMFT1 基因较高的表达水平,
随着 ABA处理时间的延长, GbMFT1基因的表达没
有明显的变化, 表明GbMFT1的表达不受ABA的胁
迫诱导。GbMFT1 基因在花瓣中的表达明显高于在
根、茎、叶、胚珠和纤维等组织中的表达 , 暗示
GbMFT1 基因可能在种子的发芽中不起主要作用 ,
棉花中可能还存在其他 MFT基因调节种子的发芽。
在长日照条件下, 过表达 MFT基因的拟南芥的开花
时间提前[9], GbMFT1 基因是否促进棉花的开花, 还
需进一步研究。
比较雷蒙德氏棉的基因组序列, 只在第 9 染色
体上发现一个高度相似的序列, 表明 D 供体只有一
个高度相似的 MFT1 基因, 但四倍体棉花中有几个
MFT-like 基因 , 各有什么功能 , 需结合经典的
Southern blot以及进一步深入研究方可确定。对棉花
PEBP 家族基因的分离和功能分析, 可以进一步解
析植物生长发育及开花的分子机制, 为将来利用这
类基因调节棉花的开花时间, 对提高棉花产量和纤
维品质具有重要的理论指导意义。
4 结论
克隆了 GbMFT1 基因, 该基因位于棉花的第 9
染色体上, 有 4个外显子, ORF长 528 bp, 编码一个
含 175 个氨基酸的蛋白; 氨基酸序列和其他植物的
MFT1蛋白高度相似, 尤其与葡萄 VvMFT的相似性
极高。GbMFT1被聚类到MFT-like家族中的 B亚族。
该基因在花瓣中的表达明显高于在其他组织中; 纤
维发育的不同时期均有表达; 种子发育过程中, 该
基因的表达不受 ABA诱导。
References
[1] Bradley D, Carpenter R, Copsey L, Vincent C, Rothstein S, Coen
E. Control of inflorescence architecture in Antirrhinum. Nature,
1996, 379: 791–797
[2] Bradley D, Ratcliffe O, Vincent C, Carpenter R, Coen E.
Inflorescence commitment and architecture in Arabidopsis. Sci-
ence, 1997, 275: 80–83
[3] Kardailsky I, Shukla V, Ahn J, Dagenais N, Christensen S,
Nguyen J, Chory J, Harrison M, Weigel D. Activation tagging of
the floral inducer FT. Science, 1999, 286: 1962–1965
[4] Kobayashi Y, Kaya H, Goto K, Iwabuchi M, Araki T. A pair of
related genes with antagonistic roles in mediating flowering sig-
nals. Science, 1999, 286: 1960–1962
[5] Hanzawa Y, Money T, Bradley D. A single amino acid converts a
repressor to an activator of flowering. Proc Natl Acad Sci USA,
2005, 102: 7748–7753
[6] Ahn J H, Miller D, Winter V J, Banfield M J, Lee J H, Yoo S Y,
Henz S R , Brady R L, Weigel D. A divergent external loop con-
fers antagonistic activity on floral regulators FT and TFL1.
EMBO J, 2006, 25: 605–614
[7] Ohshima S, Murata M, Sakamoto W, Ogura Y, Motoyoshi F.
Cloning and molecular analysis of the Arabidopsis gene Terminal
Flower 1. Mol Gen Genet, 1997, 254: 186–194
[8] Mimida N, Goto K, Kobayashi Y, Araki T, Ahn J H, Weigel D,
Murata M, Motoyoshi F, Sakamoto W. Functional divergence of
the TFL1-like gene family in Arabidopsis revealed by characteri-
zation of a novel homologue. Genes Cells, 2001, 6: 327–336
[9] Yoo S Y, Kardailsky I, Lee J S, Weigel D, Ahn J H. Acceleration
of flowering by overexpression of MFT (MOTHER OF FT AND
TFL1). Mol Cells, 2004, 17: 95–101
[10] Yamaguchi A, Kobayashi Y, Goto K, Abe M, Araki T. TWIN
SISTER OF FT (TSF) acts as a floral pathway integrator redun-
dantly with FT. Plant Cell Physiol, 2005, 46: 1175–1189
[11] Corbesier L, Vincent C, Jang S, Fornara F, Fan Q, Searle I,
Glakountis A, Farrona S, Gissot L, Turnbul C, Coupland G. FT
protein movement contributes to long-distance signaling in floral
induction of Arabidopsis. Science, 2007, 316: 1030–1033
[12] Jaeger K E, Wigge P A. FT protein acts as a long-range signal in
Arabidopsis. Curr Biol, 2007, 17: 1050–1054
[13] Zeevaart J A D. Leaf-produced floral signals. Curr Opin Plant
Biol, 2008, 11: 541–547
[14] Tamaki S, Matsuo S, Wong H, Yokoi S, Shimamoto K. Hd3a
protein is a mobile flowering signal in rice. Science, 2007,
316:1033–1036
[15] Taoka K, Ohki I, Tsuji H, Furuita K, Hayashi K, Yanase T, Ya-
maguchi M, Nakashima C, Purwestri Y A, Tamaki S, Ogaki Y,
Shimada C, Nakagawa A, Kojima C, Shimamoto K. 14-3-3 pro-
teins act as intracellular receptors for rice Hd3a florigen. Nature,
2011, 476: 332–335
[16] Navarro C, Abelenda J A, Cruz-Oró E, Cuéllar C A, Tamaki S,
Silva J, Shimamoto K, Prat S. Control of flowering and storage
organ formation in potato by FLOWERING LOCUS T. Nature,
2011, 478: 119–121
[17] Ruonala R, Rinne P L H, Kangasjärvi J, van der Schoot C.
CENL1 expression in the rib meristem affects stem elongation
and the transition to dormancy in Populus. Plant Cell, 2008, 20:
59–74
[18] Böhlenius H, Huang T, Charbonnel-Campaa L, Brunner A M,
Jansson S, Strauss S H, Nilsson O. CO/FT regulatory module
controls timing of flowering and seasonal growth cessation in
trees. Science, 2006, 312: 1040–1043
[19] Lifschitz E, Eviatar T, Rozman A, Shalit A, Goldshmidt A, Am-
第 8期 顾 超等: 海岛棉 GbMFT1基因的克隆及表达分析 1399


sellem Z, Alvarez J P, Eshed Y. The tomato FT ortholog triggers
systemic signals that regulate growth and flowering and substitute
for diverse environmental stimuli. Proc Natl Acad Sci USA, 2006,
103: 6398–6403
[20] Hedman H, Källman T, Lagercrantz U. Early evolution of the
MFT-like gene family in plants. Plant Mol Biol, 2009, 70:
359–369
[21] Gubler F, Millar A A, Jacobsen J V. Dormancy release, ABA and
pre-harvest sprouting. Curr Opin Plant Biol, 2005, 8: 183–187
[22] Xi W Y, Liu C, Hou X L, Yu H. MOTHER OF FT AND TFL1
regulates seed germination through a negative feedback loop
modulating ABA signaling in Arabidopsis. Plant Cell, 2010, 22:
1733–1748
[23] Nakamura S, Abe F, Kawahigashi H, Nakazono K, Tagiri A, Ma-
tsumoto T, Utsugi S, Ogawa T, Handa H, Ishida H, Mori M,
Kawaura K, Ogihara Y, Miura H. A wheat homolog of MOTHER
OF FT AND TFL1 acts in the regulation of germination. Plant
Cell, 2010, 23: 3215–3229
[24] Argiriou A, Michailidis G, Tsaftaris A S. Characterization and ex-
pression analysis of TERMINAL FLOWER1 homologs from cul-
tivated alloteraploid cotton (Gossypium hirsutum) and its diploid
progenitors. J Plant Physiol, 2008, 165: 1636–1646
[25] Dong R(东锐), Yuan H-Y(院海英), Gu C(顾超), Zheng Y-Y(郑
银英), Huang X-Z(黄先忠), Cui B-M(崔百明). Clone and pri-
mary analysis of the function of GhFTL1 gene in cotton (Gos-
sypium hirsutum). Cotton Sci (棉花学报), 2011, 23(6): 515–521
(in Chinese with English abstract)
[26] Hu G-H(胡根海), Yu S-X(喻树迅). Extraction of high-quality
total RNA in cotton leaf with improved CTAB method. Cotton
Sci (棉花学报), 2007, 19(1): 69–70 (in Chinese with English ab-
stract)
[27] Kumar S, Nei M, Dudley J, Tamura K. MEGA: a Biolo-
gist-centric software for evolutionary of DNA and protein se-
quences. Brief Bioinform, 2008, 9: 299–306
[28] Reiersen H, Rees A R. The hunchback and its neighbours: proline
as an environmental modulator. Trends Biochem Sci, 2001, 26:
679–684
[29] Chardon F, Damerval C. Phylogenomic analysis of the PEBP
gene family in cereals. J Mol Evol, 2005, 61: 579–590
[30] Carmel-Goren L, Liu Y S, Lifschitz E, Zamir D. The SELF-
PRUNING gene family in tomato. Plant Mol Biol, 2003, 52:
1215–1222
[31] Carmona M J, Calonje M, Martínez-Zapater J M. The FT/TFL1
gene family in grapevine. Plant Mol Biol, 2007, 63: 637–650
[32] Igasaki T, Watanabe Y, Nishiguchi M, Kotoda N. The FLOWER
LOCUS T/TERMINAL FLOWER 1 family in Lombardy poplar.
Plant Cell Physiol, 2008, 49: 291–300
[33] Danilevskaya O N, Meng X, Hou Z, Ananiev E V, Simmons C R.
A genomic and expression compendium of the expanded PEBP
gene family from maize. Plant Physiol, 2008, 146: 250–264
[34] Sun H-B(孙洪波), Jia Z(贾贞), Han T-F(韩天富). Roles of PEBP
family genes in the development of plants. Plant Physiol J (植
物生理学通讯), 2009, 45(8): 739–747 (in Chinese with English
abstract)
[35] Karlgren A, Gyllenstrand N, Kallman T, Sundstrom J F, Moore D,
Lascoux M, Lagercrantz U. Evolution of the PEBP gene family in
plants: functional diversification in seed plant evolution. Plant
Physiol, 2011, 156: 1967–1977