全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(4): 469481 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)(2013AA102602)项目, 教育部长江学者和创新团队发展计划(PCSIRT13073)项目, 中央高
校基本科研业务费专项资金, 教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-12-0891)和农业部大豆生物学与遗传育种创新团队和江苏省双
创计划资助。
This study was supported by the National High-tech R&D Program of China (2013AA102602), the Program for Changjiang Scholars and
Innovative Research Team in University of Ministry of Education of China (PCSIRT13073), the Fundamental Research Funds for the Central
Universities, Program for New Century Excellent Talents in University of Ministry of Education of China (NCET-12-0891), Program for
Soybean Biology and Genetic Breeding Innovative Research Team of Ministry of Agriculture of China, and Program for High-level Innova-
tive and Entrepreneurial Talents in Jiangsu Province.
* 通讯作者(Corresponding authors): 李艳, E-mail: yanli1@njau.edu.cn; 盖钧镒, E-mail: sir@njau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: wttmrzf@163.com, Tel: 15195987620
Received(收稿日期): 2015-08-21; Accepted(接受日期): 2016-01-11; Published online(网络出版日期): 2016-01-27.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160127.1344.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00469
大豆中一个WRKY28-like基因的克隆与功能分析
王婷婷 丛亚辉 柳聚阁 王 宁 帅 琴 李 艳* 盖钧镒*
南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 / 国家大豆改良中心 / 农业部大豆生物学与遗传育种重点实验室 / 江苏省现代
作物生产协同创新中心, 江苏南京 210095
摘 要: WRKY转录因子参与调节植物生长发育、生物与非生物胁迫应答等多种过程, AtWRKY28是拟南芥中与抗病
和耐逆相关的重要转录因子。为探讨大豆中一个 AtWRKY28同源基因 GmWRKY28-like (Glyma.14G028900)的生物学功
能, 本文对该基因进行了克隆、生物信息学分析、亚细胞定位、组织表达等试验, 并对其在 ABA、PEG、NaCl胁迫
下的表达水平进行了分析。结果显示 , GmWRKY28-like 基因的编码区 (CDS)为1008 bp, 编码335个氨基酸。
GmWRKY28-like 蛋白具有保守的 WRKY 结构域 , 含有22个丝氨酸(Serine)、1个苏氨酸(Threonine)、2个酪氨酸
(Tyrosine), 不含跨膜结构与信号肽; 进化树分析表明大豆 GmWRKY28-like与菜豆(Phaseolus vulgaris) WRKY28的相
似性最高; 亚细胞定位显示 GmWRKY28-like定位在细胞核中。该基因在根、种子中表达量很低, 在真叶、花、及茎
尖分生组织表达量较高。GmWRKY28-like 启动子中含有多种与生物和非生物逆境胁迫应答相关的元件, 如 MBS、
W-box、ABRE、Box-W1等, 且表达受到 ABA、PEG、NaCl的诱导。此外, 过表达 GmWRKY28-like显著增强了拟南
芥的耐盐性。
关键词: GmWRKY28; 进化树分析; 亚细胞定位; 非生物胁迫
Cloning and Functional Analysis of a WRKY28-like Gene in Soybean
WANG Ting-Ting, CONG Ya-Hui, LIU Ju-Ge, WANG Ning, SHUAI Qin, LI Yan*, and GAI Jun-Yi*
National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement / National Center for Soybean Improvement / Key Laboratory for Biology
and Genetic Improvement of Soybean (General), Ministy of Agriculture / Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production, Nan-
jing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: WRKY transcription factors play important roles in regulating plant growth and development, and participate in plant
response to abiotic and biotic stresses. Arabidopsis WRKY28 is an essential transcription factor for plant response to necrotrophic
pathogen and abiotic stress. To explore the function of the homologues gene of AtWRKY28 in soybean, we cloned GmWRKY28-
like (Glyma.14G028900) and performed bioinformatics analysis. Its sub-cellular localization and tissue expression patterns were
further investigated. We also analyzed the expression levels of GmWRKY28-like under ABA, PEG, and NaCl stress treatments.
Our results showed that the coding DNA sequence (CDS) of GmWRKY28-like gene is 1008 bp in length, encoding 335 amino
acids. GmWRKY28-like contains a conserved WRKY domain with 22 serine, one threonine and two tyrosine, without any trans-
membrane domain or signal peptide. Phylogenetic analysis showed that the WRKY28 from Phaseolus vulgaris was most similar to
GmWRKY28-like. GmWRKY28-like was verified to be located in the nucleus. This gene expressed at low levels in root and seed
while high levels in true leaf, flower and shoot apical meristem. The 1500 bp upstream region of GmWRKY28-like contains a
470 作 物 学 报 第 42卷


variety of cis-elements, such as MBS, W box, ABRE, and box-W1, which are involved in the response to biotic and abiotic
stresses, and its expression was induced by ABA, PEG, and NaCl treatments. In addition, overexpressing GmWRKY28-like in
Arabidopsis thaliana enhanced plant tolerance to NaCl. This study would provide reference basis to further study the functions of
GmWRKY28-like in soybean tolerance to abiotic stresses.
Keywords: GmWRKY28; Phylogenetic analysis; Subcellular location; Abiotic stress
植物在生长发育过程中会受到多种多样的逆境
影响, 因此植物通过调节一系列复杂的信号通路来
改变许多基因的表达以适应逆境。植物在逆境胁迫
下基因表达量上调的转录因子有很多, 例如 DREB、
NAC (NAM、ATAF1、ATAF2和 CUC2)、ZF-HD、
AREB/ABF、MYC和 MYB、WRKY和 HSF等[1-4]。
其中, WRKY 转录因子是植物中最大的转录因子家
族之一, 如拟南芥中含有 74个 WRKY 家族成员[5],
粳稻和籼稻基因组中也分别鉴定到 98个和 102个
WRKY家族成员[6]。WRKY转录因子在 N端都有一
个由 60 个氨基酸残基组成的 WRKY 结构域, 并含
有一个保守的WRKYGQK序列, 同时在 C端有一个
锌指状结构域 CX4–7-CX23–28-HX1–2-(H/C)。根据
WRKY 结构域数目和锌指状结构特征可以将
WRKY转录因子分为 3类[7], I类含有 2个WRKY结
构域, 其锌指结构为 C2H2型(C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H,
其中X为任意氨基酸); II类只含 1个WRKY结构域,
锌指结构为C2H2型, 与 I类相似, 在拟南芥中, 该类
又进一步分成 IIa、IIb、IIc、IId 和 IIe 亚类 , 如
AtWRKY28 含有 1 个 WRKY 结构域, 其锌指结构为
C2H2型, 属于第 II大类WRKY蛋白家族中的 d亚类[8];
III类虽也只含有 1个WRKY结构域, 但其锌指结构
模型为 C2-HC型(C-X7-C-X23-H-X1-C)。WRKY通过
结合启动子上保守的 W box顺式元件来调节目标基
因的表达[9]。
WRKY转录因子广泛参与到植物的生长发育及
次生物质代谢途径中, 如毛状体发育、内种皮中单
宁酸生成、根系发育、胚胎发生、种皮生成、衰老
等[10-11], 同时该家族还参与植物应答多种环境信号
刺激 , 调节防御病原体感染系统的复杂信号网络 ,
响应低温、高盐、干旱等非生物胁迫 [12-13]。水稻
中过表达 OsWRKY13 可以增强对白叶枯病菌
(Xanthomonas oryzae pv. oryzae Xoo) 和 真 菌
(Magnaportha grisea)的抗性 [14-15]。棉花(Gossypium
hirsutum L.)中的 GhWRKY15可被真菌感染强烈诱导,
过表达 GhWRKY15 的烟草具有较高的抗病毒和真
菌能力[16]。GhWRKY40受机械损伤和细菌 Ralstonia
solanacearum 感染的诱导表达 [17]。拟南芥中的
WRKY8可以调控 ABI4等相关基因参与对烟草花叶
病毒的防御反应, 并可能介导 ABA和乙烯信号传导
途径中的交联反应[18]。在拟南芥中过表达 OsWRKY77
则可抑制丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.
Tomato DC3000)的生长[19]。
WRKY 转录因子通过组成正、负反馈环调节植
物的多项生理过程[5]。OsWRKY62 在水稻防御中起
到负调节作用, 过表达时会降低水稻基础防御功能,
并会降低 Xa21基因介导的对白叶枯病菌 Xoo的抗性,
抑制防御基因的表达[20]。在拟南芥中进行的基因功
能缺失和功能获得研究表明 [21], AtWRKY7、
AtWRKY11、AtWRKY17、AtWRKY18、AtWRKY23、
AtWRKY25、AtWRKY27、AtWRKY38、AtWRKY40、
AtWRKY41、AtWRKY48、AtWRKY53、AtWRKY58、
AtWRKY60、AtWRKY62在植物免疫上都起负调控作
用 ; 而 AtWRKY34、 AtWRKY33、 AtWRKY53 和
AtWRKY70 在植物抵抗腐殖营养的病原真菌, 如葡
萄孢菌(Botrytis cinerea)和链格孢菌(Alternaria bras-
siciola)中 , 则发挥着积极作用 [22-24]; AtWRKY46、
AtWRKY70、AtWRKY53 在抗病原菌丁香假单胞菌
(Pseudomonas syringae)方面也起着积极作用, 并在
基础防御方面作用相互重叠、协同作用[25]。
WRKY28与众多WRKY家族基因一样, 能同时参
与调控多种生理过程, 在多种生物和非生物逆境下
起重要作用。WRKY28基因受ABA、高盐、机械损伤
而诱导表达[26], 并很可能通过水杨酸途径或茉莉酸
信号通路参与对葡萄孢菌的免疫应答反应 [27]。
WRKY28表达量在低磷胁迫下显著升高, WRKY28通
过正调控PHO1和PHT1;4响应低磷胁迫 [28]。过表达
AtWRKY28的转基因株系对草酸和菌核病(Sclerotinia
sclerotiorum)都表现出抗性增强的现象, 表明拟南芥
中AtWRKY28是该防御反应的正调控因子[29]。
大豆是一种重要的油料作物和植物蛋白质来源,
在生长过程中, 受到多种环境因素的影响, 生物和
非生物逆境均可造成大豆减产。本实验通过克隆大
豆中一个WRKY28-like基因, 研究其在非生物胁迫条
件下的表达水平 , 以期为研究大豆中的WRKY28基
因在耐逆方面的功能提供借鉴。
第 4期 王婷婷等: 大豆中一个 WRKY28-like基因的克隆与功能分析 471


1 材料与方法
1.1 试验材料与仪器
大豆(Glycine max)品种科丰 1 号由南京农业大
学国家大豆改良中心提供; 引物合成及测序均由上
海英骏生物技术有限公司完成; pJIT166-GFP载体由
南京农业大学国家大豆改良中心提供; 其他试剂类
未经特别说明者均为国产; PCR仪器为 Biometrad的
070-851 型; 实时荧光定量 PCR 仪为 Roche 公司的
LightCycler 480II型; 激光共聚焦显微镜是 Zeiss的
LSM780型。
1.2 WRKY28-like基因 CDS全长序列的克隆
利用 Phytozome (http://www.phytozome.net/)查
找大豆中与拟南芥 WRKY28 (At4g18170.1)相似的基
因。选择相似度最高的基因, 登录 NCBI发现其基因
注释为 WRKY28-like (XP_003545146.1), 确定其为
研究对象。用总 RNA提取试剂盒(TIANGEN)提取正
常条件下生长的科丰 1 号叶片总 RNA, 利用反转录
试剂盒(TaKaRa)合成 cDNA 第一链作为模板扩增基
因。根据 WRKY28-like 的 CDS 序列设计引物, 以
cDNA 为模板进行扩增。由于该基因的 5端序列在
大豆中存在 2个拷贝, 因此利用 Primer Premier 5.0
设计 3 对引物 (引物序列如表 1), 即 14g-F 和
14g-REV1、14g-REV2、14g-REV3, 进行 3次扩增。
PCR体系含 cDNA 5 μL、5×PS GXL缓冲液 10
μL、引物 STAR GXL DNA聚合酶(TaKaRa) 1 μL、
2.5 mmol L–1 dNTPs 4 μL、20 μmol L–1引物各 1 μL、
ddH2O 29 μL。反应程序为: 95℃ 5 min; 95℃ 30 s,
56℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35个循环; 72℃ 10 min。产
物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测, 并回收目的条带, 经
3 次扩增回收(AXYGEN), 获得完整的 CDS 片段。
将其与 pMD19-T载体(TaKaRa)连接, 转化大肠杆菌
DH5α 感受态细胞 (TIANGEN), 涂布在含有氨苄
(Sangon Biotech)抗生素的平板上, 过夜培养, 挑斑,
菌液 PCR、质粒酶切验证来筛选阳性克隆, 测序验
证。将正确克隆命名为 T-GmWRKY28。
1.3 GmWRKY28-like基因的生物信息学分析
用在线软件 ExPASy (http://cn.expasy.org/tools/
pi_tool.html)和 SOPMA (http://nhjy.hzau.edu.cn/kech/
swxxx/jakj/dianzi/Bioinf7/Expasy/Expasy8.htm) 分 析
蛋白质的物理和化学性质, 并预测二级结构。利用
DNAMAN和 TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.
dtu.dk/services/TMHMM/)跨膜预测。利用 SignalP 4.1
Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析
信号肽; 选择参数: Eukaryotes; Default; PNG (inline);
Standard; Input sequences do not include TM regions。
利用 NetPhos 2.0 Server 程序分析磷酸化位点 (http://
www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) 。 利 用 SMART
(http://smart.embl-heidelberg.de/)和 NCBI 的保守结
构 域 (CDD) 数 据 库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Structure/cdd/wrpsb.cgi)预测基因的保守性功能域。
利用 PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.
be/webtools/plantcare/html/)预测 GmWRKY28-like 基
因上游 1500 bp 区域的顺式作用元件。应用 BlastP
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)和 Phytozome 查找与
GmWRKY28-like 同源性高的序列(每个物种保留同
源性最高的一条序列), 用 DNAMAN 比对氨基酸序
列; 用MEGA 5.0软件中的邻近相连法(NJ)构建系统
进化树, 校验参数 BootStrap重复 1000次。
1.4 GmWRKY28-like蛋白的亚细胞定位
用WoLF PSORT (http://www.genscript.com/psort/
wolf_psort.html)预测亚细胞定位。并同时构建
GmWRKY28-like与 GFP的融合表达载体, 转入拟南
芥原生质体进行亚细胞定位。以 T-GmWRKY28为模
板, 扩增、回收目的片段。使用 Sal I和 BamH I (NEB)
分别酶切目的片段和载体 pJIT166-GFP, 连接酶切
产物, 使 GmWRKY28插入 GFP, 将连接后的载体转
入 DH5α 感受态细胞中。挑取单克隆测序。使用
TaKaRa 无内毒素大提质粒试剂盒提取质粒, 采用
PEG-4000 介导的方法[30]将质粒转染入拟南芥(野生
型 Col-0)的叶片原生质体中, 培养 15~20 h后, 在激
光共聚焦显微镜下观察。
1.5 大豆组织取样
挑选籽粒圆润饱满、大小较为一致的科丰 1 号
种子, 以 1% NaClO浸泡 1 min, ddH2O冲洗干净, 黑
暗中沙萌 3 d, 取根尖; 其余移入蛭石中在室温下培
养, 16 h光照/8 h黑暗, 每 3 d浇一次改良的 1/2 MS
营养液。待真叶自然舒展开后, 取真叶。再分别取
14 d苗龄的茎尖分生组织、18 d苗龄的三出复叶和
茎、开花盛期的花组织、鼓粒盛期的绿荚、成熟的
种子。将样品迅速保存于液氮冷冻备用。
1.6 胁迫处理
挑选籽粒圆润饱满、大小较为一致的科丰 1 号
种子, 以 1% NaClO浸泡 1 min, ddH2O冲洗干净, 黑
暗中沙萌 3 d 后, 于光照培养箱里采用改良的 1/2
Hoagland营养液(pH 5.8)培养。每 500 mL烧杯内放
3株苗, 每 3 d更换一次新鲜营养液, 水培温度 26℃
472 作 物 学 报 第 42卷


/24℃ (L/D), 16 h 光照/8 h 黑暗, 湿度 70%, 光强
600 μmol m–2 s–1。在培养 11 d后进行相应胁迫处理,
参考钟贵买等[26]的做法, 同时结合预试验结果, 在营
养液中分别添加 100 μmol L–1ABA、20% (质量体积比)
PEG-6000、200 mmol L–1 NaCl, 对照组仍采用改良的
1/2 Hoagland营养液。处理 0、3、6、12、24、48和
72 h后, 取舒展的最上端三出复叶的中间一片叶作为
叶样, 取根尖 1 cm组织作为根样, 将 3株样等量混和,
迅速置液氮中冷冻备用, 生物学重复 3次。
1.7 RNA提取与 qRT-PCR
用总 RNA 快速提取试剂盒(TIANGEN, 北京)
提取叶片和根的总 RNA。使用 PrimeScript 1st Strand
cDNA Synthesis Kit 试剂盒(TaKaRa 公司)反转录合
成 cDNA第 1链。参照 SYBR Premix Ex Taq II操作
说明书进行 qRT-PCR (表 1)。以大豆 ACT11为内参
基因对 GmWRKY28-like基因在不同组织下的表达进
行 qRT-PCR 分析 ; 以大豆 60S 为内参基因对
GmWRKY28-like基因在不同逆境胁迫(ABA、PEG或
NaCl)下的表达进行 qRT-PCR 分析。每个样品 3 个
重复孔(技术性重复), 生物学重复 3 次, 采用 2−ΔΔCt
法[31]分析 GmWRKY28-like 的相对表达量, 并计算 3
次生物学重复的标准误。

表 1 试验中使用的引物
Table 1 Primers used in this study
名称
Name
序列
Sequence(5–3)
用途
Function
14g-F GAAGATCTATGGAGAATGAGAAGGACCG GmWRKY28-like基因克隆 Cloning of GmWRKY28-like gene
14g-REV1 TGCAACAAACCATAGTCACGAG GmWRKY28-like基因克隆 Cloning of GmWRKY28-like gene
14g-REV2 GGAATGATGGTAGTAGGTCTTGCA
ACAAACCATAGTCACGAG
GmWRKY28-like基因克隆 Cloning of GmWRKY28-like gene
14g-REV3 GGGTAACCTCTGGCACTTGTTTGC
CAGGGAATGATGGTAGTAGGTCTTGC
GmWRKY28-like基因克隆 Cloning of GmWRKY28-like gene
cell-F ACGCGTCGACATGGAGAATGAGAAGGACCG 亚细胞定位 Subcellular localization
cell-REV CGCGGATCCTGGCACTTGTTTGCCAGG 亚细胞定位 Subcellular localization
ACT11-F CGGTGGTTCTATCTTGGCATC 实时荧光定量内参 Reference gene in qRT-RCR
ACT11-REV GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA 实时荧光定量内参 Reference gene in qRT-RCR
qRT-F CGAGTCAGAAGTGCGGTGTAAAG GmWRKY28-like实时荧光定量 qRT-RCR of GmWRKY28-like
qRT-REV CTTAGTGTTGCTGGACAGTGATGG GmWRKY28-like实时荧光定量 qRT-RCR of GmWRKY28-like
60S-F AAAGTGGACCAAGGCATATCGTCG 实时荧光定量内参 Reference gene in qRT-RCR
60S-REV TCAGGACATTCTCCGCAAGATTCC 实时荧光定量内参 Reference gene in qRT-RCR
下画线部分表示酶切位点与保护碱基。Restriction sites and protective bases are underlined.

1.8 转 GmWRKY28-like基因的纯合 T3代拟南芥
在 NaCl胁迫下的表型分析
用限制性内切酶 Bgl II 和 BstE II 酶切
T-GmWRKY28质粒和 pCAMBIA1301载体, 然后连
接转入农杆菌菌株 EHA105, 构建 GmWRKY28-like
的植物表达载体, 采用“floral dip”方法转化拟南芥,
潮霉素筛选出纯合株系。收获纯合转基因 T3代, 37℃烘
2 d左右, 密封存放于 4℃冰箱备用。
对野生型拟南芥 Col-0 和过表达 GmWRKY28-
like 基因的纯合 T3 代转基因株系＃11、＃40 进行
NaCl胁迫处理。经过预试验, 确定设置 0、50、100、
和 150 mmol L–1 NaCl处理水平, 以 1/2MS为基本培
养基, 统计、分析种子的萌发率和主根长。其中, 萌
发率每次以 30~50粒种子计数; 根长则以 30株左右
幼苗计算。试验重复 3次。
2 结果与分析
2.1 GmWRKY28-like基因全长 CDS序列的克隆
根据同源基因比对 , 与拟南芥 WRKY28 基因
( A t 4 g 1 8 1 7 0 . 1 )同源性最高的大豆基因为 X P _
003545146.1 (即 Glyma.14G028900), 其编码的蛋白
与拟南芥 AtWRKY28蛋白的相似度为 46.6%。由于
该基因的 5端序列在大豆中存在 2 个拷贝, 先后通
过 3 次扩增得到该基因: 首先利用 14g-F 和 14g-
REV1为引物得到长度预计为 968 bp的片段(图 1-A),
然后以第 1 次 PCR 产物为模板, 利用 14g-F 和
14g-REV2为引物得到长度预计为 988 bp的片段(图
1-B), 最后以第 2 次 PCR 产物为模板, 利用 14g-F
和 14g-REV3为引物得到长度预计为 1008 bp的片段
(图 1-C)。经过 3次扩增获得了完整的目的片段。测
第 4期 王婷婷等: 大豆中一个 WRKY28-like基因的克隆与功能分析 473



图 1 GmWRKY28-like基因克隆过程的 PCR产物电泳图
Fig. 1 Electrophoresis results of the PCR fragments during cloning GmWRKY28-like gene
A: 14g-F和 14g-REV1为引物的 PCR扩增产物; B: 14g-F和 14g-REV2为引物的 PCR扩增产物; C: 14g-F和 14g-REV3为引物的 PCR
扩增产物; 每张图片的左边电泳道为 DL 15000 DNA marker。
A: amplification products using primer pairs of 14g-F and 14g-REV1; B: amplification products using primer pairs of 14g-F and 14g-REV2;
C: amplification products using primer pairs of 14g-F and 14g-REV3; DL 15000 DNA marker is shown on the left of each photo.

序结果显示, 所得序列与 NCBI 中 XP_003545146.1
的序列(即 Williams 82序列)完全一致, 为 1008 bp。
2.2 GmWRKY28-like 基因及其蛋白的生物信息
学分析
GmWRKY28-like 基因的 CDS 区域共 1008 个核
苷酸, 编码 335个氨基酸, 其等电点为 6.99, 蛋白质
量为 37 960.54 Da, 蛋白质二级结构由 26.87%的-
螺旋、9.85%的延伸、6.57%的 β-转角和 56.72%的无
规则卷曲 4种结构模块组成。预测发现GmWRKY28-
like没有信号肽和跨膜结构。GmWRKY28-like磷酸
化位点预测结果如图 2显示, GmWRKY28-like含有
22个丝氨酸(Serine), 1个苏氨酸(Threonine)和 2个酪
氨酸(Tyrosine), 推测这些磷酸化位点的作用可能与
GmWRKY28-like蛋白的活性调控有关。
对该基因的保守性功能域的预测(图 3)显示, 在
187~246 氨基酸位置(LEDGYRWRKYGQKAVKNSP
YPRSYYRCTSQKCGVKKRVERSFQDPTIVITTYEG
QHNHHC)有一个WRKY的功能结构域, 其锌指结构
为 C2H2型(C-X4-C-X23-H-X1-H), 属于 WRKY 蛋白
II类。其中WRKYGQK是WRKY结构域的核心序列。
用 PlantCARE 分析 GmWRKY28-like 基因上游
1500 bp 序列包含的顺式作用元件(表 2), 发现共有
39 种顺式元件。根据这些元件的注释, 可以将其分
成非生物胁迫相关、生理功能相关、生物胁迫相关、
和功能未知 4 类。非生物胁迫相关的顺式作用元件
又可以分为两类, 一类是环境因子, 主要包括光、厌
氧、干旱、热击、机械损伤等响应, 其中以光响应
元件最多, 包括ACE、Box-4、G-box等 11种元件; 第

图 2 GmWRKY28-like的磷酸化位点预测
Fig. 2 Predication of phosphorylation sites in GmWRKY28-like

474 作 物 学 报 第 42卷



图 3 GmWRKY28-like蛋白的保守结构域预测(SMART)
Fig. 3 Predicted conserved domain of GmWRKY28-like
protein (from SMART)

2类是激素相关的顺式作用元件, 包括脱落酸(ABA)
反应元件 (ABRE)、茉莉酸甲酯 (MeJA)应答元件
(CGTCA-motif) 和 水 杨 酸 (SA) 应 答 元 件 (TCA-
element), 其中 ABRE出现频率最高。生理功能相关
的顺式作用元件中, 出现频率较高的是 CAAT-box、
TATA-box、Skn-1_motif。生物胁迫相关元件包括
Box-W1和W box元件, 可对真菌、病原体产生响应。
另外还有一些功能未知的顺式元件 , 如 AAGAA-
motif、Unnnamed_1、Unnnamed_4等。
应用 DNAMAN对不同植物中WRKY28的氨基
酸序列进行多重序列比对(图 4), 以黑色区域标注完
全相同的氨基酸, 以灰色标注相似度在 50%以上的
氨基酸。可以看到, 不同植物的 WRKY28在 WRKY
结构域中存在一定的保守性, 而两端的非WRKY结
构域保守性比较弱, 不同物种的序列差异明显。
用MEGA5.0对 GmWRKY28-like与其他物种中
的 WRKY28 的氨基酸序列进化树分析(图 5), 与大
豆 GmWRKY28-like 相似性最高的是菜豆, 一致性
(identity)为 82%, 鹰嘴豆、蒺藜苜蓿与大豆的一致性
也比较高, 分别为 64% 和 59%, 大麦、小麦、陆地
棉与大豆的 GmWRKY28-like蛋白相似性最低。
2.3 GmWRKY28-like的亚细胞定位
拟南芥原生质体亚细胞定位结果表明 , 融合
蛋白 GmWRKY28-GFP 信号全部集中于细胞核中
(图 6), 因此 GmWRKY28-like 很可能在细胞核内
发挥作用。

表 2 GmWRKY28-like基因上游 1500 bp调控区的顺式作用元件
Table 2 cis-elements in the 1500 bp upstream regulatory regions of GmWRKY28-like gene
分类 Classification 功能 Function 启动子元件 Promoter element
光照响应 Light response ACE, AE-box, AT1-motif, ATCT-motif, Box 4,
Box I, G-box, G-Box, Gap-box, I-box, MNF1, Sp1
厌氧胁迫 Anoxic response ARE
干旱胁迫 Droughtresponse MBS (MYB binding site)
机械损伤 Responsiveness responsiveness W box
热击 Heat stress responsiveness HSE
防卫和逆境响应 Defense and stress responsiveness TC-rich repeats
水杨酸响应 Salicylic acid responsiveness TCA-element
茉莉酸甲酯应答元件 MeJA-responsiveness TGACG-motif
非生物胁迫相关
Abiotic stress response
脱落酸响应要件 Abscisic acid responsiveness ABRE
与 TGAGTCA motif相关 Associated to the TGAGTCA motif ATGCAAAT motif
高转录水平 Conferring high transcription levels 5UTR Py-rich stretch
增强子 Enhancer regions CAAT-box
胚乳 Endosperm expression GCN4_motif, Skn-1_motif
生理节奏控制 Circadian control circadian
生理功能
Physiological function
启动子核心元件 Core promoter element TATA-box
病原体响应 Pathogen responsiveness W box 生物胁迫相关
Biotic stress response 真菌诱导响应元件 Fungal elicitor responsive element Box-W1
功能未知
Unknown function
AAGAA-motif, Unnamed_1, Unnamed_10,
Unnamed_12, Unnamed_13, Unnamed_14,
Unnamed_2, Unnamed_3, Unnamed_4,
Unnamed_8, Unnamed_9

第 4期 王婷婷等: 大豆中一个 WRKY28-like基因的克隆与功能分析 475



图 4 不同植物 WRKY28氨基酸序列多重比对
Fig. 4 Multiple sequence alignment of amino acids of WRKY28 proteins from different plant species
XP_003545146.1: 大豆; NP_193551.1: 拟南芥; AIY62465.1: 旱地棉; AEQ29024.1: 西洋参; ACD69418.1: 小麦; AIE43853.1: 陆地棉;
AHB33834.1: 芜菁; AGQ04216.1: 麻风树; XP_002870066.1: 琴叶拟南芥亚种; ABI13394.1: 大麦; DAA05093.1: 水稻; 序列比对软件
为 DNAMAN。
XP_003545146.1: Glycine max; NP_193551.1: Arabidopsis thaliana; AIY62465.1: Gossypium aridum; AEQ29024.1: Panax quinquefolius;
ACD69418.1: Triticum aestivum; AIE43853.1: Gossypium hirsutum; AHB33834.1: Brassica rapa; AGQ04216.1: Jatropha curcas;
XP_002870066.1: Arabidopsis lyrata subsp. lyrata; ABI13394.1: Hordeum vulgare; DAA05093.1: Oryza sativa japonica Group;
The alignment was done using DNAMAN.
476 作 物 学 报 第 42卷



图 5 大豆 GmWRKY28-like与其他植物 WRKY28-like蛋白的氨基酸序列系统进化树
Fig. 5 Phylogenic tree of amino acid sequences of WRKY28-like proteins in soybean and other plant species
节点上的数字表示 1000次 BootStrap值。The numbers at the nodes indicate the 1000 BootStrap values.
XP_003545146.1: Glycine max; XP_007141406.1: Phaseolus vulgaris; XP_004491329.1: Cicer arietinum; XP_003617423.1: Medicago
truncatula; XP_002302140.1: Populus trichocarpa; XP_ 010102144: Morus notabilis; XP_006484858.1: Citrus sinensis; KJB75385.1: Gos-
sypium raimondii; XP_007217821: Prunus persica; CDP06161.1: Coffea canephora; XP_006350002.1: Solanum tuberosum;
XP_010243705.1: Nelumbo nucifera; XP_010926916.1: Elaeis guineensis; CAN72742.1: Vitis vinifera; XP_007025165.1: Theobroma cacao;
XP_002519733.1: Ricinus communis; XP_011008002.1: Populus euphratica; AHB33834.1: Brassica rapa; NP_193551.1: Arabidopsis
thaliana; XP_002870066.1: Arabidopsis lyrata subsp. lyrata; AEQ29024.1: Panax quinquefolius; JA32875.1: Brassica oleracea var. capitata;
DAA05093.1: Oryza sativa japonica Group; AIY62465.1: Gossypium aridum; AGQ04216.1: Jatropha curcas; ABI13394.1: Hordeum vulgare;
ACD69418.1: Triticum aestivum; AIE43853.1: Gossypium hirsutum.

2.4 GmWRKY28-like基因组织表达分析
分别取幼苗期的根、真叶、茎尖分生组织、茎、
第一个三出复叶、盛花期的花、鼓粒盛期的绿荚和
成熟种子的 cDNA 为模板, 以种子表达量为对照,
进行组织表达分析。实时荧光定量 PCR 结果(图 7)
表明, GmWRKY28-like 在根和种子中的相对表达量
很低, 在真叶、花、茎尖分生组织和绿荚中则大量
表达。
2.5 GmWRKY28-like 基因在逆境胁迫下的表达
分析
实时荧光定量 PCR结果(图 8)显示, 分别以各时
间点正常生长条件下的样品为对照, 在 3 种胁迫处
理下, 大豆叶片和根中 GmWRKY28-like 的相对表达
量较对照都有不同程度的改变。
第 4期 王婷婷等: 大豆中一个 WRKY28-like基因的克隆与功能分析 477



图 6 GmWRKY28-like蛋白的亚细胞定位
Fig. 6 Subcellular localization of GmWRKY28-like protein
含 GFP的质粒 pJIT166-GFP和 pJIT166-GmWRKY28-GFP分别转入拟南芥(野生型 Col-0)叶片原生质体中,
并在激光共聚焦显微镜下观察。
The pJIT166-GFP and pJIT166-GmWRKY28-GFP vectors were transformed into the protoplasts from Arabidopsis leaf (wild-type Col-0)
and observed using confocal microscopy.


图 7 GmWRKY28-like基因在不同大豆组织中的相对表达量
Fig. 7 Relative expression level of GmWRKY28-like gene in
soybean different tissues
1: 根; 2: 真叶; 3: 茎尖分生组织; 4: 茎; 5: 第一复叶; 6: 花;
7: 豆荚; 8: 种子; 误差线表示 3次重复的标准误, 误差线上方的
不同大写字母表示在新复极差法分析中 0.01水平上存在显著性
差异。大豆 ACT11为 qRT-PCR的内参基因。
1: root; 2: true leaf; 3: SAM; 4: stem; 5: first trifoliolate leaf; 6:
flower; 7: pod; 8: seed. Error bars represent the standard errors of
three replicates. Bars superscripted by different capital letters are
significantly different at the 0.01 probability level. The soybean
ACT11 was used as the reference gene in qRT-PCR.

ABA处理下, GmWRKY28-like在叶片中的相对
表达量在 24 h 达到高峰 , 是对照的 4 倍 ; 根中
GmWRKY28-like的相对表达量在 48 h最高, 也达到
对照的 4 倍。PEG 处理下, 叶片中 GmWRKY28-like
的表达水平在处理后短时间内即受诱导上调表达, 3
h时 PEG处理是对照的 9.3倍; 在根中的表达量则一
直低于对照。在 200 mmol L–1 的 NaCl 处理下 ,
GmWRKY28-like 在叶片中的相对表达量升高, 72 h
的相对表达量是对照的 5.5 倍; 而根中的相对表达
量在 24 h达到最高。
2.6 过表达 GmWRKY28-like基因的纯合 T3代拟
南芥在 NaCl处理下的表型分析
如图 9所示, 野生型 Col-0、过表达 GmWRKY28-
like基因的纯合 T3代转基因株系＃11和＃40的种子
在正常 1/2MS 培养基上的萌发状况都很好, 播种后
2 d 萌发率都达到了 98%以上, 没有明显差异; 50
mmol L–1 NaCl处理下播种 2 d的萌发率有极显著差
异, Col-0 为 86.6%, 而＃11、＃40 分别为 96.2%和
97.7%; 100 mmol L–1 NaCl处理下, 2 d和 4 d三者间
的萌发率也存在极显著的差异, Col-0在 2 d萌发率
仅为 24.2%, 到 4 d 才达到 67.2%; ＃11 在 2 d 为
76.7%, 4 d为 81.9%; ＃40在 2 d萌发率就已经达到
96.0%; 萌发率差异最为明显的是 150 mmol L–1
NaCl处理, 萌发 2、4、6和 8 d, 转基因株系和对照
株系都具有极显著差异; Col-0在 4 d才开始有萌动
现象, 仅为 3.4%, 到 8 d才达到 85.3%, 且生长状态
很差, 植株无变绿现象; ＃11在 2 d已经达到 14.2%,
4 d的萌发率达到了 70.1%, 8 d就已经全部萌发, 生
长状况良好; ＃40株系拟南芥最耐高盐, 2 d萌发率
为 74.2%, 4 d时已经全部萌发。
图 10表明, 在正常 1/2MS培养基上萌发的野生
型 Col-0、过表达 GmWRKY28-like基因的纯合 T3代
478 作 物 学 报 第 42卷



图 8 不同逆境胁迫下 GmWRKY28-like的相对表达量
Fig. 8 Relative expression of GmWRKY28-like under different stress treatments
处理浓度分别为 ABA 100 μmol L–1, PEG-6000 20%, NaCl 200 mmol L–1。-L表示叶片, -R表示根。误差线表示 3次重复的标准误。误
差线上方的不同大写和小写字母分别表示在新复极差法分析中 0.01和 0.05水平上存在显著性差异。大豆 60S为 qRT-PCR的内参基因。
The concentration of ABA, PEG-6000, and NaCl is 100 μmol L–1, 20%, and 200 mmol L–1, respectively. -L represents leaf and -R represents
root. Error bars represent the standard errors of three replicates. Bars superscripted by different capitals and lowercases are significantly
different at the 0.01 and 0.05 probability levels, respectively. The soybean 60S was used as the reference gene in qRT-PCR.

图 9 拟南芥在对照和 NaCl处理下的萌发率
Fig. 9 Germination rate of Arabidopsis in control and NaCl treatments
野生型 Col-0、过表达 GmWRKY28-like基因的纯合 T3代转基因株系＃11、＃40分别在添加不同浓度的 NaCl的 1/2MS培养基上的萌
发率。每次以 30~50粒种子计数, 误差线表示 3次重复的标准误。每个时间点都使用新复极差法分析 Col-0、＃11和＃40之间是否存
在显著性差异; 大写和小写字母分别表示在 0.01水平和 0.05水平上差异性显著。
The germination rate of wild type Col-0 and homozygous T3 GmWRKY28-like overexpressing transgenic Arabidopsis lines＃11 and ＃40 on
1/2MS medium with the different concentrations of NaCl. Data represents mean of three replicates with 30-50 seeds within each replication.
Error bars represent standard errors of three replicates. Shortest Significant Ranges method was used to analyze whether there were signifi-
cant differences at each time point among Col-0, # 11, and # 40, whereas capital and lowercase letters represent significant difference at the
0.01 and 0.05 probability levels, respectively.

转基因株系＃11、＃40, 根系生长情况良好, 2 d时
基本都长到了 4.5 mm, 4 d时在 20.0 mm上下, 到 12
d时都超过了 43.0 mm。50 mmol L–1 NaCl处理下,
Col-0、＃11、＃40 根系生长速度略微减缓, 在 6 d
时, Col-0和＃11没有明显区别, 但与＃40具有显著
差异, 此后三者主根长度相差不大, 12 d时基本都在
40.0 mm以上。100 mmol L–1的 NaCl条件下, 株系＃
40根系伸长量较 Col-0更多, 在 8、10、12 d时, ＃40
第 4期 王婷婷等: 大豆中一个 WRKY28-like基因的克隆与功能分析 479



图 10 拟南芥在对照和 NaCl处理下的根长
Fig. 10 Root length of Arabidopsis in control and NaCl treatments
野生型 Col-0、过表达 GmWRKY28-like基因的纯合 T3代转基因株系＃11、＃40在不同浓度的 NaCl的 1/2MS培养基上的根长。每次
以 30棵左右的幼苗计数, 误差线表示 3次重复的标准误。每个时间点都使用新复极差法分析 Col-0、#11和#40之间是否存在显著性
差异; 大写和小写字母分别表示在 0.01和 0.05水平上差异性显著。
The root length of wild type Col-0 and homozygous T3 GmWRKY28-like overexpressing transgenic Arabidopsis lines #11 and #40 on 1/2MS
medium with the different concentrations of NaCl. Data represents mean of three replicates with about 30 seedlings within each replication.
Error bars represent standard errors of three replicates. Shortest Significant Ranges method was used to analyze whether there were signifi-
cant differences at each time point among Col-0, #11, and #40, whereas capital and lowercase letters represent significant difference at the
0.01 and 0.05 probability levels, respectively.

和Col-0的根长具有显著差别, ＃11和 Col-0没有明
显差异。利用高浓度 150 mmol L–1 NaCl处理时, 野
生型 Col-0的长势明显弱于转基因株系, 2 d时＃11、
＃40 根长显著大于 Col-0, 此后一直表现出极显著
的根系伸长量差异; ＃11、＃40 在 4 d 平均根长为
4.0 mm、4.1 mm, 而 Col-0只有 0.8 mm; 12 d的＃11、
＃40根长为 6.5 mm和 8.1 mm, Col-0只有 2.2 mm。
3 讨论
WRKY 家族属于植物中特有的一类转录因子,
其家族庞大, 成员众多。很多研究结果表明该家族
基因广泛参与调节植物的生长发育、生物和非生物
应答等多种生理过程。然而, 目前对大豆该家族基因
的研究还较少, 因此, 研究大豆中 WRKY28 基因的功
能对了解该家族成员具有更进一步的借鉴意义。
GmWRKY28-like 基因上游1500 bp 区域具有多
种参与生理功能、生物和非生物胁迫应答相关的顺
式作用元件, 推测 GmWRKY28-like 很可能与植物应
对干旱、机械损伤、热击等逆境胁迫和 ABA、水杨
酸、茉莉酸等激素的应答过程。前期研究认为[32], 如
果某个基因可以受到 ABA诱导, 且在它的启动子中
含有 ABRE 顺式元件, 那么这个基因很可能与增强
植物抵抗干旱和脱水胁迫的能力有关。GmWRKY28-
like 的启动子区域含有4个 ABRE 顺式元件和2个干
旱应答的顺式元件 MBS, 且表达受到 ABA 的诱导,
推测该基因在抗旱方面很可能具有一定作用。PEG
处理下, 大豆叶片中的 GmWRKY28-like 在很短时间
内即受到强烈的诱导, 表达量提高近10倍。PEG 处
理和干旱条件下都对植物造成渗透胁迫 , 因此
GmWRKY28-like 可能参与干旱条件下的渗透胁迫应
答。但 PEG渗透胁迫与常规意义上的土壤渐进失水
情况并不完全相同, 因此 PEG 只能模拟而不能完全
代替干旱情况。GmWRKY28-like 在干旱条件下的具
体表达情况, 还要通过土壤失水处理来确定。
虽然在启动子区域中并没有发现明确的与高盐
有关的顺式作用元件 , 但GmWRKY28-like基因可受
到高浓度NaCl的诱导表达, 说明GmWRKY28-like可
能参与植物对高盐离子毒害或者渗透胁迫的应答反
480 作 物 学 报 第 42卷


应。此外, WRKY转录因子可以激活植物防御细菌和
真菌感染的系统。草酸在大豆菌核菌的发病机制中
起到重要作用 [19], 过表达AtWRKY28的转基因株系
对菌核病以及草酸都表现出抗性增强的现象, 其应
对机制主要是通过激活茉莉酸 /乙烯途径来发挥作
用[29]。在GmWRKY28-like基因的启动子区域也有一
些和生物胁迫相关的作用元件, 如W box和Box-W1,
也有茉莉酸甲酯应答元件 TGACG-motif, 因此
GmWRKY28-like基因在防御、抵抗病原体侵害方面
很可能也具有一定的作用。
拟南芥中AtWRKY28被定位在细胞核中[26], 且
受到 ABA、高盐、机械损伤诱导[26], 并很可能通过
水杨酸途径或茉莉酸信号通路参与对葡萄孢菌的免
疫应答反应[27]。本研究表明 GmWRKY28-like 定位
于细胞核中, 且能受到 ABA、高盐、PEG诱导表达。
荧光定量 PCR结果显示, GmWRKY28-like对 ABA有
较强程度的应答能力, 很可能参与 ABA 信号途径,
同时该基因还可能参与对干旱、高盐、渗透胁迫等
方面的响应。通过比较 NaCl胁迫下野生型和过表达
GmWRKY28-like 的转基因拟南芥的萌发率和根长 ,
发现过表达 GmWRKY28-like 提高了拟南芥的耐盐
性。据此推测大豆中的这个 WRKY28-like极有可能
是作为一个类似 AtWRKY28 的转录因子在细胞核
中发挥作用, 参与大豆对非生物逆境的应答过程。
4 结论
在大豆品种科丰1号中 , 克隆了 GmWRKY28-
like 基因 , 该基因编码 335个氨基酸 , 具有一个
WRKY 保守结构域, 无信号肽和跨膜结构, 编码的
蛋白与菜豆中的 WRKY28同源性很高。启动子区域
中含有多个与生物和非生物逆境胁迫相关的顺式作
用元件。GmWRKY28-like蛋白定位于细胞核。该基
因在多种组织中均可表达 , 但具一定组织特异性 ,
在真叶、花、及茎尖表达量较高 , 同时该基因受
ABA、PEG和 NaCl的诱导表达。过表达 GmWRKY28-
like 的转基因拟南芥在高盐环境下的萌发率和根长
比野生型显著提高。
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