全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (2) : 295 - 300
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 07 - 16; 修回日期 : 2007 - 09 - 20
基金项目 : 国际竹藤网络中心青年基金项目 (103) ; 国家林业局 ‘948’项目 (2006242C07)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: pengzh@ icbr1ac1cn)
陈段芬为共同第一作者。
一个中国水仙 M ADS2box基因的克隆与分析
高志民 1 , 陈段芬 1 , 李雪平 1 , 蔡春菊 1 , 彭镇华 23
(1国际竹藤网络中心 , 国家林业局竹藤科学与技术重点开放实验室 , 北京 100102; 2中国林业科学研究院林业研究所 ,
北京 100091)
摘 　要 : 采用 RT2PCR技术从中国水仙 (N arcissus tazetta var. chinensis Roem. ) 幼嫩花蕾中分离到一个
新的水仙花发育相关 MADS2box基因 , 命名为 N TMADS1 ( GenBank登录号 : EF421828)。该基因长 879 bp,
编码区共编码 230个氨基酸 , 具有典型的植物 MADS2box基因结构 , 由 MADS区、 I区、K区和 C末端组
成。序列分析结果表明 , N TMADS1编码的蛋白与其它植物的 MADS2box蛋白有着较高的一致性 , 其中与扫
状天门冬 (A sparagus virgatus Baker) 的 AVAG1的一致性高达 89%。系统进化树分析表明 N TMADS1属于
AG亚族。
关键词 : 中国水仙 ; MADS2box基因 ; 克隆 ; 系统进化树分析
中图分类号 : S 68212 + 1　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0220295206
C lon ing and Sequence Ana lysis of a Flower ing2rela ted M AD S2box Gene in
N a rc issus tazetta var. ch inensis Roem.
GAO Zhi2m in1 , CHEN Duan2fen1 , L I Xue2p ing1 , CA I Chun2ju1 , and PENG Zhen2hua23
( 1 In terna tional Cen ter for B am boo and Rattan, SFA Key Labora tory of B am boo and Rattan Science and Technology, B eijing
100102, Ch ina; 2 Research Institu te of Forestry, Chinese A cadem y of Forestry, B eijing 100091, Ch ina)
Abstract: MADS2box genes p lay important role in various p lant development p rocesses, especially in
the development of floral organs. The flowering2related MADS2box gene, named as N TMADS1 ( GenBank ac2
cession number: EF421828) , was cloned from the first strand of N arcissus tazetta var. ch inensis Roem. cDNA
through RT2PCR using p rimers designed according to the MADS2box gene fam ily conserved region. The frag2
ment was 879 bp long and contained an open reading frame of 693 bp coding a polypep tide of 230 am ino acids
which had a typ ical MADS2box domain. Homology analysis showed that the deduced N TMADS1 p rotein was
highly homologous to otherMADS2box p roteins from different species, especially with A sparagus virga tus Baker
to 89%. Phylogenetic tree analysis also indicated that N TMADS1 belongs to AG subfam ily.
Key words: N arcissus tazetta var. ch inensis Roem. ; MADS2box gene; clone; phylogenetic tree analysis
继花器官发育过程 ABC模型 (Coen & Meyerowitz, 1991) 构建之后 , Theissen等 (2000) 又构建
了 ABCDE模型。在上述模型中 , A类基因控制萼片和花瓣的发育 , B类基因控制花瓣和雄蕊的发育 ,
C类基因控制雄蕊和雌蕊的形成 , D类基因控制胚珠的发育 , E类基因则是与 ABC三类共同对特定
的花器官的发育进行调控。
中国水仙 (N arcissus tazetta var. ch inensis Roem. ) 为石蒜科水仙属多年生草本植物 , 是我国十大
名花之一 , 目前仅有 ‘玉玲珑 ’、‘金盏银台 ’等少数几个品种 , 因此中国水仙的花型改造是其育种
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的重要研究目标之一。由于中国水仙为同源三倍体植物 , 极少产生种子 , 限制了其实生选种和杂交育
种。随着花卉基因工程的深入开展 , 人们相继从中国水仙中分离了的 CHS (黄胤怡 等 , 2002 )、
N TAG (W ang et al. , 2006)、PSY (邹清成 等 , 2006) 等基因 , 其中从单瓣品种 ‘金盏银台 ’中分离
的 N TAG基因为 AGAMOUS类花型调控基因 , 这为研究中国水仙花型提供了新思路。采用 RT2PCR技
术从中国水仙重瓣品种 ‘玉玲珑 ’中分离了 C类花发育功能基因 N TMADS1, 从而为中国水仙花型变
异机理的研究和通过基因工程手段开展中国水仙育种奠定基础。
1　材料与方法
111　植物材料和菌株
试材为中国水仙品种 ‘玉玲珑 ’鳞茎球 (产地福建漳州 )。菌株大肠杆菌 ( Esherich ia coli)
DH5α由国家林业局竹藤科学与技术重点开放实验室保存。
112　总 RNA提取与 cD NA合成
采用 Invitrogen公司的 Trizol试剂 , 参照 Gao等 (2006) 的 RNA提取方法 , 从中国水仙幼嫩花蕾
中提取 RNA, 用 Promega公司的反转录试剂盒合成 cDNA。
113　基因克隆与测序分析
根据 MADS2box基因家族的保守区序列设计引物 , 由上海生工生物工程技术有限公司合成。引物
1: 5′2CCTCATAACCAAAAGCAACCTC23′; 引 物 2: 5′2CACCTCCAGTCATTCCATC23′。以 中 国 水 仙
cDNA为模板 , 进行梯度 PCR, 反应条件为 : 94 ℃预变性 5 m in; 94 ℃ 1 m in, 58～63 ℃ 1 m in,
72 ℃ 2 m in, 35个循环 ; 72 ℃延伸 10 m in。PCR产物电泳分析后回收 , 按照 Promega的快速连接试
剂盒操作流程 , 将 DNA片段直接连到载体上 , 转化 DH5α后提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析 , 送
宝生物工程有限公司测序。应用 DNASTAR、SMART和 Clustal W 等生物软件分析序列及其编码蛋白
质的结构特点 , 并与国际核酸和蛋白质数据库联网进行 BLAST比较分析。
2　结果与分析
211　基因克隆与结构分析
将 PCR产物在 1%的琼脂糖凝胶中电泳 , EB染色结果如图 1所示 , 在 900 bp左右有一条亮带 ,
与预测的基因片段相符 , 初步确定为目的基因片段。回收目的片段 , 测序结果表明插入片段 879 bp。
序列分析表明 , 插入片段含有一个完整的开放阅读框 (693 bp) , GenBank登录号为 EF421828。
图 1　梯度 PCR产物电泳结果
1: 6118 ℃; 2: 6110 ℃; 3: 6012 ℃; 4: 5914 ℃; 5: 5818 ℃; M2: 1 kb分子量标记。
F ig. 1　D NA fragm en ts am plif ied by grad ien t PCR
1: 6118 ℃; 2: 6110 ℃; 3: 6012 ℃; 4: 5914 ℃; 5: 5818 ℃; M2: 1 kb ladder.
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　2期 高志民等 : 一个中国水仙 MADS2box基因的克隆与分析 　
对 EF421828的序列进行分析 , 结果 (图 2) 显示包含一个完整的编码 230个氨基酸的开放读码
框 , 具有典型的植物 MADS2box基因结构。其编码肽链具有两个保守结构域 , 即 MADS区 (第 1～61
位 ) 和 K区 (第 74～173位 ) , MADS区和 K区之间为 12个氨基酸的间区 ( I区 ) , 而 C2端区域是含
有鸟苷酸结合蛋白 ( G蛋白 ) 的 57个氮基酸 , 属于 M IKC型 (崔永兰 等 , 2003)。其中包含了双向
细胞核定位信号 1个 (第 9～26位 ) , N端糖基化位点 2个 (第 13～16位、第 59～62位 ) , 蛋白激酶
C的磷酸化位点 6个 (第 15～17位、第 49～51位、第 61～63位、第 107～109位、第 120～122位、
第 140～142位 ) 和酪氨酸激酶 Ⅱ (CK2) 磷酸化位点 7个 (第 81～84位、第 120～123位、第 129～
132位、第 172～175位、第 191～194位、第 211～214位、第 203～206位 )。该基因命名为 N T2
MADS1 (MADS1 from N. tazetta var. ch inensis)。此外 , 通过 DNASTAR软件预测 , N TMADS1编码的蛋
白质等电点和分子量分别为 91345和 26 633112 Da。
图 2　N TMADS1编码区核酸序列及其推导出的氨基酸序列
单下划线为 MADS2box区 , 双下划线为 K区。
F ig. 2　Nucleotide sequence and deduced am ino ac ids sequence of N TMADS1
MADS2box domain underlined with single line and K domain with double lines.
212　氨基酸序列比较与系统进化树分析
对 N TMADS1基因编码的蛋白与数据库中已知的序列进行比较分析 , 结果显示 N TMADS1与扫状
天门冬 (A. virga tus) 的 AVAG1 (BAD18011)、藏红花 (C rocus sa tivus) 的 AG1 (AAS67611)、风信
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子 (Hyacin thus orien ta lis) 的 HAG1 (AAD19360)、油棕 ( E laeis gu ineensis) 的 AG2 (AAW 66882) 等
有着较高的一致性 , 都在 80%以上。其中与扫状天门冬的 AVAG1一致性最高 , 达 89% , 与拟南芥
(A. tha liana) 的 AG (NP_567569) 一致性为 65%。N TMADS1与 NTAG (W ang et al. , 2006) 的一致
性为 9911% , 区别在于第 119位和 227位的氨基酸 , 在 NTAG中分别为 V和 L, 而在 N TMADS1中为
M和 P。图 3是 N TMADS1编码的蛋白质与一致性靠前的 4个不同物种蛋白质序列的 Clustal W 比较分
析结果 , 可以看出氨基酸序列的 5′端的保守性较高 , 而 3′端的保守性较低。
图 3　N TMAD S1编码的氨基酸序列与其他物种 M AD S2box蛋白的序列比较
F ig. 3　A lignm en t of NTM AD S1 prote in w ith other M AD S2box prote in s
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　2期 高志民等 : 一个中国水仙 MADS2box基因的克隆与分析 　
在拟南芥中 MADS2box基因分为 5个亚族 ———AP1、AP3 /P I、AG、AGL2和孤儿亚族 ( Theissen
et a l. , 2000)。以拟南芥中的 5个亚族作为对照 , 选取其中一些典型基因对 N TMADS1基因进行系统
进化树分析 (图 4) , 结果表明 N TMADS1基因属于 AG亚族 , 为 C类功能基因。
图 4　M AD S2box基因编码蛋白的系统进化树分析
F ig. 4　Phylogenetic tree ana lysis of prote in s encoded by M AD S2box genes
3　讨论
与模式植物拟南芥的 MADS2box基因家族相比 , N TMADS1与拟南芥的 AGAMOUS (AG) 和 SHA T2
TERPROO F2 (SHP2) 编码的蛋白 (AAU82070) 的一致性均为 65%。AG作为 C类功能基因参与雄
蕊和心皮的发育 , 而 SHP2 ( Pinyop ich et al. , 2003) 属于 MADS2box基因家族的 Ⅱ型转录调控子 , 与
SHP1 (L iljegren et al. , 2000) 一起在 SEP1 /S EP2 (A lvarez2Buylla et al. , 2000) 的下游发挥调控功
能 , 控制拟南芥心皮边缘和开裂区的分化 , 同时与 AG和 SEEDS TICK ( S TK) 基因有部分功能的重
叠 , 即参与心皮和胚珠的调控 ( Pinyop ich et al. , 2003)。因此 , 认为 N TMADS1可能与中国水仙花的
生殖发育有关 , 与 E类功能基因有着部分重叠的功能。
N TMADS1与 N TAG (W ang et al. , 2006) 的一致性高达 9911% , 同属于 C类功能基因 , 其区别在
于两个氨基酸的差异。其原因可能在于 N TAG来源于中国水仙单瓣品种 ‘金盏银台 ’, N TMADS1来源
于重瓣品种 ‘玉玲珑 ’, 而且 ‘玉玲珑 ’增加的花瓣来源于雄蕊瓣化 , 编码氨基酸的差异也许是导致
花型变异的内在因素。
因此 , N TMADS1基因将有助于研究中国水仙花型发育的分子机制 , 对于进一步通过基因工程手
段来培育水仙花新品种有着重要价值。
虽然关于中国水仙遗传转化体系的建立 (叶祖云 等 , 2001 ) 以及水仙转基因 (曹荣华 等 ,
2001; 邹清成 等 , 2006) 已有研究报道 , 但由于水仙是单子叶植物 , 对农杆菌不甚敏感 , 目前尚未
建立成熟的遗传转化体系 , 给验证中国水仙基因的功能带来了不便。N TMADS1基因的克隆为进一步
研究基因功能奠定了基础。目前已经将 N TMADS1基因转入烟草、拟南芥中 , 对其功能的初步鉴定正
在进行中。
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