全 文 ：书文章编号:1674 － 148X(2012)03 － 0201 － 07
条斑紫菜 Rab11 基因的克隆、序列分析及原核表达
王 斌，郭宝太，牛孟华，隋炯明
收稿日期:2012 － 04 － 20
基金项目:国家转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08009 － 100B) ;江苏省植物功能基因组学重点实验室开放课题(K10004)和青
岛农业大学创新教育项目资助
作者简介:王斌(1985 －) ，男，山东泰安人，在读硕士，主要从事植物基因工程。
通讯作者:隋炯明，E － mail:suijiongming@ 163． com
(青岛农业大学生命科学学院 /山东省高校植物生物技术重点实验室，山东 青岛 266109)
摘要:Rab蛋白是小 GTP结合蛋白家族最大的亚族，调控着植物的生长发育、形态建成，参与植物对病原菌的应答
等过程，有些成员还受多种逆境胁迫的诱导表达。本研究通过 RT － PCR技术克隆了 1 个条斑紫菜 Rab基因，测序
结果显示其 cDNA含有长 648 bp的完整开放阅读框．与拟南芥 Rab比较时，该基因与拟南芥 Rab11 编码产物同源
性最高，因此命名为 PyRab11。条斑紫菜 Rab11 基因与多种生物的 Rab11 基因编码的氨基酸序列具有较高的同源
性，是典型的 Rab蛋白编码基因。以 pET28a为起始载体，构建了该基因的原核表达载体 pET28a － PyRab11。重组
大肠杆菌 BL21(pET28a － PyRab11)经 IPTG 诱导后，SDS － PAGE 显示得到了分子量约 24 KDa 的特异性重组蛋
白，该基因的表达可提高重组菌的耐盐能力。
关键词:条斑紫菜;Rab11 基因;进化树分析;原核表达;耐盐性
中图分类号:Q781 文献标识码:A DOI:10． 3969 /J． ISSN． 1674 － 148X． 2012． 03． 009
Cloning and Sequencing Aanlysis of Rab11 Gene from
Porphyra yezoensis and its Prokaryotic Expression
WANG Bin，GUO Baotai，NIU Menghua，SUI Jiongming
(College of Life Science，QAU /Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong，Qingdao 266109，China)
Abstract:Rab protein belongs to small GTP － binding protein family，it regulates plant growth，development，mor-
phogenesis，and response to pathogens in plant． Some members of Rab proteins are also closely related to abiotic
stress tolerance in plant． In this experiment，a Rab gene of Porphyra yezoensis (PyRab)was amplified successfully
by RT － PCR． After T － A cloning，sequencing result indicated that the cloned cDNA contained a continuous com-
plete open reading frame (ORF)of 648 bp． Phylogenetic analysis showed that the PyRab and Rab11 of Arabidopsis
was one class of GTP － binding protein，so that its coding gene was named PyRab11 ． Amino acid sequence com-
parison revealed that PyRab11 had high level identity with Rab11 from other species． PyRab11 is a typical Rab pro-
tein coding gene． Prokaryotic expression vector of PyRab11 gene was constructed and named pET28a － PyRab11．
After induction of the recombinant strain BL21(pET28a － PyRab11 )with IPTG，a specific 24 KDa protein band
was found in SDS － PAGE pattern． Due to the expression of PyRab11 gene，the salt － tolerance of the recombinant
was increased．
Key words:Porphyra yezoensis;Rab11 gene;Phylogenetic analysis;Prokaryotic expression;Salt － tolerance
Rab 蛋白是小 GTP 结合蛋白家族最大的亚
族［1］，作为囊泡运输的分子开关，它不断在 GDP(非
活化)和 GTP(活化)结合状态之间转换，在囊泡的
形成、转运、粘附和融合过程中起着重要作用［2］。
Rab蛋白调节着植物的生长发育、形态建成，参与植
物对细菌病原应答中抗菌化合物的极性分泌过
程［3］。当植物受干旱、盐碱、病害胁迫时，有许多
Rab蛋白被诱导表达［4 － 7］。
青岛农业大学学报(自然科学版) 29(3) :201 ～ 207，2012
Journal of Qingdao Agricultural University (Natural Science)
条斑紫菜是可以在潮间带生长的大型藻，具有
极强的耐盐与抗失水(干旱)能力，是抗旱耐盐等抗
逆基因的重要来源。另外，紫菜的生活周期中，形态
差异明显的叶状体与丝状交替出现，是研究藻类分
子生物学的理想材料。本文克隆了条斑紫菜 Rab11
基因的 cDNA序列，进行了序列测定、生物信息学分
析及重组菌耐盐性测定，为研究该基因的作用机理
和利用该基因进行作物耐盐转基因改良奠定了
基础。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
条斑紫菜叶状体由中国海洋大学戴继勋教授提
供。RNA提取试剂盒 RNAiso TM Plus 和反转录试
剂盒购自 TaKaRa公司。
1． 2 总 RNA的提取
参考冯艳宾描述的方法［8］，取条斑紫菜叶状体
0． 05g，液氮速冻并研磨成粉末状，用 RNAisoTM Plus
试剂盒抽提，并进行纯化。
1． 3 引物设计及 RT － PCR扩增
以拟南芥 Rab 基因 cDNA 序列为信息探针，运
行 BLAST 程序在条斑紫菜 EST 数据库中寻找同源
性最高的序列。重叠序列拼接后用 ORF Finder 程
序寻找最长的开放阅读框，推测其编码的氨基酸序
列。根据拼接出的条斑紫菜 Rab 基因的序列，设计
了一对引物:
P1:5 － AGTGATGGCGCGTACGGACG －3;
P2:5 － CATCATCAGCAGCACTTGGAAC －3 。
取条斑紫菜总 RNA 1μg，以 Oligo (dT)为引物，
用 TaKaRa 的第一链 cDNA 合成试剂合成 cDNA 第
一链。以 cDNA 第一链产物为模板进行 RT － PCR
反应，反应体系 25μL，包含 10mmol /L Tris － HCl
(pH8． 3)、50mmol /L KCl、1． 5mmol /L MgCl2、1 U 的
Taq酶、4nmol /L dNTP、10pmol /L 引物，20ng cDNA。
PCR 扩增程序如下:95℃、5min;95℃、30s，56℃、
1min，72℃、50s，33 个循环;72℃、10 min。
1． 4 基因克隆及生物信息学分析
在 T4 DNA 连接酶作用下，回收纯化的 PCR 产
物与 pMD18 － T 载体连接，连接产物用热激法转化
E． coli菌株 DH5α感受态细胞。挑取抗氨苄的单菌
落培养并提取质粒，经 PCR 和双酶切鉴定后，阳性
克隆送交上海生物工程公司测序。
利用 NCBI (http:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov)的
BLAST软件对测序结果进行分析，编码蛋白的氨基
酸序列的预测用 Protparam，氨基酸序列多重比对和
进化树分析采用 ClustalW 软件，保守功能域分析利
用 NCBI的 CDD软件。
1． 5 原核表达载体的构建
根据 PyRab11 基因起始密码子和终止子邻近
序 列 设 计 了 一 对 引 物， 5 端 引 物 为 5
－ CATATGGCGCGTACGGACGAC － 3，3端引物为
5 － AAGCTTAGCAGCACTTGGAACTCTTC － 3，分
别加入 Nde Ⅰ和 Hind Ⅲ酶识别位点序列。以重组
质粒 pMD18 － T － PyRab 为模板，利用该对引物进
行 RCR扩增。用 Nde Ⅰ和 Hind Ⅲ对 PCR 产物和
原核载体 pET28a 分别进行双酶切，经 1%琼脂糖凝
胶电泳回收纯化目的片段。用 T4 DNA 连接酶连接
两个回收片段，形成重组质粒 pET28a － PyRab 11，
转化 E． coli 菌株 BL21 感受态细胞，选用上述引物
和内切酶对获得的重组质粒进行 PCR 和双酶切鉴
定。该质粒就是 PyRab11 基因的原核表达载体。
1． 6 重组菌的诱导表达及耐盐分析
参考杨晓华的方法［9］，挑取重组大肠杆菌 BL21
(pET28a － PyRab11 )单菌落，接种于 LB 液体培养
基(含 100μg /mL 卡那霉素)中，37℃、250rpm 培养
16h。按 130 的比例接入 10mL含 100μg /mL卡那
霉素的 LB 液体培养基中，37℃、250rpm 活化 2 ～
3h。当菌液的 OD600值达到 0． 6 ～ 0． 8 时，加入 IPTG
至终浓度为 1mM，250rpm 培养 8h，用诱导 8h 的
BL21 作对照。取诱导后的菌夜 1． 5mL，离心加入
60μL磷酸缓冲液，取分离物进行 SDS － PAGE 分
析。取经 IPTG 诱导的重组菌和对照菌 BL21
(pET28a) ，按 1100 的比例分别接入 10mL 含 0、
1． 5%、3． 5%、5． 5%、7． 5%、10% NaCl 的液体 LB
中(含 100μg /mL 卡那霉素) ，分别取培养 0h、1h、
2h、3h、4h、5h的培养物测其 OD600值，重复 3 次，根
据试验结果绘制其生长曲线，试验结果进行统计
分析。
2 结果与分析
2． 1 条斑紫菜 Rab11 基因的克隆与序列测定
以拟南芥 Rab基因作为查询序列，在条斑紫菜
的 dbEST 中进行 BLAST 分析，获得了 AU188805、
AV433537、AV436369、AV434508 等多条高度相似
并且彼此重叠的 EST 序列，并拼接产生一条长 741
bp的序列。根据此序列设计引物，RT － PCR 扩增
产物为长约 650 bp 的特异性条带，大小符合预期结
果见图 1 所示。
202 青岛农业大学学报(自然科学版) 29 卷
图 1 条斑紫菜 Rab11 基因的 RT － PCR扩增
M． Marker DL2000;1． 对照;2 ～ 5． RT － PCR产物
目的片段与 pMD18 － T 载体的连接物转化
DH5α感受态细胞后，挑取白斑菌落提取质粒，先进
行 PCR鉴定(图 2 － a) ，再用 Xba Ⅰ 和 Pst Ⅰ 进行
双酶切鉴定(图 2 － b) ，结果符合预期。阳性克隆测
序结果显示 PyRab 基因序列长 657bp，含有完整的
ORF(图 3)。该 ORF 编码产物含 215 个氨基酸残
基，分子量大小约为 24kDa。
图 2 重组质粒的鉴定
(a)． PCR鉴定;M． Marker DL2000;1． 对照;2 ～ 4． 克隆; (b)．
酶切鉴定;M． Marker DL15000;1 － 2． 重组质粒 / Xba Ⅰ + Pst Ⅰ
图 3 条斑紫菜 Rab11 基因及推导的氨基酸序列
2． 2 条斑紫菜 Rab11 基因的生物信息学分析
拟南芥 Rab蛋白可分为 8 个亚家族，不同亚家
族的成员之间同源性较低［10］。选取这 8 个家族的
多个成员同条斑紫菜 Rab 蛋白的氨基酸序列进行
3023 期 王 斌，等:条斑紫菜 Rab 11 基因的克隆、序列分析及原核表达
聚类分析，结果表明克隆的条斑紫菜 Rab 蛋白同拟
南芥 Rab11 亚家族不同成员的同源性最高，为
50. 2% ～ 64． 7%，因 此 其 编 码 基 因 命 名 为
PyRab11 。该基因与其它亚家族成员的同源性较
低，同源性为 27． 6% ～44． 4%。
以条斑紫菜 Rab11 氨基酸序列为探针对 Gen-
Bank中的非冗余蛋白质数据库进行 Blastp 分析，结
果发现水稻 (Oryza sativa)、拟南芥(Arabidopis
thaliana)、角叉菜(Gracilaria lemaneiformis)、小立
碗藓 (Physcomitrella patens)、 秀 丽 隐 杆 线 虫
(Caenorhabditis elegans)、 黑 猩 猩 (Pan
troglodytes)、斑马鱼 (Danio rerio)、小鼠 (Mus
musculus)、人类(Homo sapiens)等多种生物的
Rab11 与其高度相似。将上述生物的 Rab11 和条斑
紫菜 Rab11 进行多重序列比对(图 4) ，并用 Neigh-
bour － joining 法构建系统发生进化树(图 5) ，结果
表明在进化上 PyRab11 与角叉菜的 Rab11 亲缘关
系最近，与小立碗藓的亲缘关系次之，与高等植物的
图 4 条斑紫菜与其他物种 Rab11 氨基酸序列的同源比较
亲缘关系最远，一致性为 59． 5% ～ 71． 5%。其中条
斑紫菜 Rab11 与角叉菜 GlRab11 － 3、小立碗藓
PpRab11、拟南芥 AtRab11B1 和水稻 OsRab11C1 的
序列一致性分别为 71． 5%、70． 2%、60． 9% 和
402 青岛农业大学学报(自然科学版) 29 卷
59. 5%。
为进一步揭示 PyRab11 蛋白的功能，对其保守
结构域进行了分析。结果显示编码蛋白序列中
GDSGVGK(18 － 24)、ESKSTI(39 － 44)、DTAG(66 －
69)、VGNK(122 － 125)和 ETSA(152 － 155)是 5 个
保守的 GTP /GDP 结合和水解区域，该区域在整个
Ras小分子 GTP酶超家族成员中都具有保守性［3］。
RabF模体(RabFl － RabF5)是 RabGTP 酶家族所特
有的 5 个氨基酸序列，在 PyRab11 中分别为 NEFN
(34 － 37)、KAQIW(61 － 65)、RYRAIT(72 － 77)、
YRGAV(81 － 85)和 FEGIER(99 － 104) ，RabSF 序
列可以用来划定各个 Rab GTP 酶亚家族的成员，该
模体在 Rab 亚家族内部具有更高的一致性，在
PyRab11 中分别为 GDSGVGKS(18 － 26)、NLLSR-
FTRNEF (26 － 37)、IVIAL(117 － 122)和 TEIY(170
－ 173)。
图 5 不同生物 Rab11 蛋白的进化树分析
2． 3 PyRab11 基因的原核表达及重组菌耐盐性的
测定
以质粒 pMD － T － PyRab11 为模板，用含酶切
位点的特异引物进行扩增，经 Nde Ⅰ和 Hind III 双
酶切后的 PCR 产物插入原核表达载体 pET28a 中，
成功构建了该基因的原核表达载体，命名为 pET28a
－ PyRab11 ，测序结果确认了构建的正确性。重组
菌 BL21(pET28a － PyRab11 )经 1 mM IPTG 诱导
后，利用 SDS － PAGE电泳，获得和预期大小相同的
特异性条带(图 6) ，结果表明 PyRab11 基因成功实
现了诱导。
图 6 PyRab11 蛋白的诱导表达分析
M． 蛋白 marker;1． 对照菌 BL21(pET28a)诱导 8h;2、3． 重组
菌 BL21(pET28a － PyRab11 )诱导 8h。箭头指 PyRab11 重组蛋白
为了研究重组菌对高盐胁迫的耐受力，将重组
菌 BL21(pET28a － PyRab11 )和含空载体的对照菌
BL21(pET28a) ，用 1 mM IPTG 诱导后，在含有不同
浓度 NaCl的 LB 液体培养基中培养。在 600 nm 下
测量各时间段的 OD 值，绘制其生长曲线(图 7 － a、
图 7 － b)。由图 7 中可见，当 NaCl 的浓度在 0． 5%
～3． 5% 之间时，对照菌和重组菌都能正常生长，
PyRab11 基因的过量表达并未对其生长产生明显影
响。当盐浓度为 5． 5% ～ 7． 5%时，含空载体的对照
菌生长明显受到抑制，而重组菌还能缓慢生长(图 7
－ c) ;当盐浓度增大为 10%，重组菌的生长也受到
抑制。结果表明 PyRab11 基因提高了大肠杆菌的
耐盐性。
3 讨 论
本研究采用生物信息学预测、RT － PCR 扩增获
得了条斑紫菜 Rab11 基因的 cDNA 序列，这是条斑
紫菜中分离到的第一个 Rab11基因。比对结果显示
PyRab11 蛋白具有与 GTP结合有关的高度保守的序
列，和高度可变的 N端和 C端，与其它物种的 Rab11
具有较高的氨基酸序列一致性。经软件预测分析，
PyRab11 蛋白中的半胱氨酸模序 CC 为异戊二烯基
转移酶的识别修饰位点，它可把十五碳法尼基或二
十碳香叶基转移至末端半胱氨酸残基上，其半胱氨
酸经异戊二烯化修饰能使 PyRabl1 的疏水性增加，
5023 期 王 斌，等:条斑紫菜 Rab 11 基因的克隆、序列分析及原核表达
修饰后蛋白利用高度变化的 C 末端插入细胞内膜
或质膜上，有利于其与膜的结合［11］。
图 7 pET28a和 pET28a － PyRab 11 经 IPTG
诱导后在不同盐浓度的生长情况
a:pET28a;b:pET28a － PyRab 11; c:pET28a 和 pET28a
－ PyRab 11 在含 7． 5% NaCl 的 LB 培养基中的生长情况;* P ＜
0. 05，＊＊ P ＜ 0. 01 表示 pET28a或 pET28a － PyRab 11 处理后显著
或极显著高于处理前的生长量
目前已在多种植物中克隆了受逆境胁迫诱导表
达的 Rab 基因。O’Mahony 等在极端耐旱的牧草
Sporobolus stapfianus中克隆了 Rab2基因，其 mRNA
的表达丰度与叶片脱水性相关，在大肠杆菌中表达
的该基因的蛋白产物具有与 GTP 结合的特性，它涉
及由脱落酸参与的耐旱信号的传导通路［4］。耐盐
植 Mesembryanthemum crystallinum经高盐溶液处理
后，Rab5 蛋白表达量显著增加［5］。来自牧豆树的
PjRab 7 基因在高盐、干旱等胁迫下表达上调，在烟
草中异位表达后，显著提高了转基因植株的耐盐能
力，转基因植株在体内积累了更多的盐离子［6］。本
研究表明 PyRab11 的 cDNA 在大肠杆菌中表达后，
重组蛋白耐盐能力增加。
拟南 芥 Rab 基 因 被 分 为 AtRab1、AtRab2、
AtRab5、AtRab6、AtRab7、AtRab8、AtRab11、AtRab16
等 8个亚家族，其中 AtRab11基因有 18 个［10］。对番
茄 Rab11 功能的研究表明，除参与逆境胁迫途径
外，反义表达番茄 Rab 11 的 RNA，细胞分裂素含量
增加，乙烯含量降低，果实成熟后颜色发生变化但不
能软化，Rab11 蛋白很可能调节包装有和果实软化
相关的多种酶的小泡从高尔基体运输到细胞壁［7］。
条斑紫菜 Rab11 基因也可能具有相似功能，其对细
胞内的某些生命活动可能有着重要影响，这还有待
于进一步研究。
作物耐盐、抗旱基因工程研究的关键是目的基
因的获取，高效耐盐基因的缺乏仍是最主要的限制
因子。陆生植物起源于海洋藻类等海洋植物，而海
洋植物在长期的进化过程中，由于特殊、多样的潮间
带生存环境，积累了丰富的抗逆基因资源，逐步形成
并发展了其耐盐等抗胁迫能力。从海洋植物中克隆
新型耐盐基因，并用于作物的基因工程改良是一项
应用潜力巨大的工作。
海洋植物功能基因克隆的研究落后于陆地植
物，对于终生生活于高盐环境具有高度耐盐能力的
海洋植物，其耐盐重要功能基因的克隆及功能研究
还非常缺乏。条斑紫菜是食用藻，来源于它的基因
用于作物转基因改良可以更好地消除转基因作物及
食品的安全顾虑。因此，从海洋植物特别是真核藻
中克隆耐盐基因将具有更大的应用潜力与优势。本
研究将克隆得到了条斑紫菜 Rab11 基因，该基因可
提高重组菌的耐盐性，为研究该基因与抗逆性的关
系及利用该基因进行作物的转基因改良奠定了
基础。
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( 上接 195 页)
对棉花的产量和主要品质，处理 7 即每公顷施氮
(N)300kg、磷(P2O5)37． 5kg、钾(K2O)300kg的效果
最好，从降低肥料成本来说，以处理 8 效果较好，即
每公顷施氮(N)300kg、磷(P2O5)75kg、钾(K2O)
150kg。
图 15 氮和钾对可纺性指数的交互作用立体效果图
3 结 论
1)经数理统计分析，建立了氮磷钾肥料三因素
对棉花单株产量和公顷产量影响的数学模型，求得
了各项指标达最佳值时的三因素值。
2)分析了三因素单独或交互作用对各项指标
的影响，得出结论是对棉花产量而言，氮是主要影响
因子，氮肥可以适量多施，磷钾肥中等用量即可;对
棉花断裂比强度而言，氮钾是主要影响因子，氮钾肥
可适量多施，磷肥中等用量即可;对棉花可纺性指
数而言，磷钾是主要因子，磷钾肥可适量多施，氮肥
中等用量即可。
3)在本试验类似的土壤条件下，棉花获得较高
产量和较好品质时，氮、磷、钾三因素用量分别为:
每公顷施氮 300kg、P2O5 37． 5 kg和 k2O 300 kg(N
P2O5k2O = 818、处理 7) ，从降低肥料成本考
虑，以每公顷施氮 300kg、P2O5 75kg和 k2O 150kg(N
P2O5 k2O = 412、处理 8)的效果也较为
理想。
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