全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(10): 1727−1738 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2011ZX08010-004)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 杨德光, E-mail: ydgl@tom.com; 黎裕, E-mail: liyu03@caas.cn, Tel: 010-62131196
第一作者联系方式: E-mail: yslizhao@163.com
Received(收稿日期): 2013-01-28; Accepted(接受日期): 2013-06-02; Published online(网络出版日期): 2013-08-01.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130801.1725.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01727
玉米再生相关基因ZmLEC1的序列变异及其与胚性愈伤组织形成能力
的关联分析
李 钊 1,2 张登峰 2 孙永华 2 吴 迅 2 李永祥 2 石云素 2
宋燕春 2 杨德光 1,* 王天宇 2 黎 裕 2,*
1 东北农业大学农学院, 黑龙江哈尔滨 150030; 2 中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081
摘 要: 以 95份玉米微核心种质和 3份常用玉米转基因受体材料(A188、HiII和综 31)组成的关联作图群体, 对玉米
再生相关候选基因 ZmLEC1 进行序列变异分析, 并利用候选基因关联分析策略揭示该基因与胚性愈伤组织形成能力
的关系, 发掘提高胚性愈伤组织形成能力的有益等位变异。结果表明, 不同材料之间的幼胚胚性愈伤组织形成能力和
再生能力有显著差异, 其中粤 267-1-1 诱导的愈伤组织和国际上普遍利用的 HiII 极为相似, 胚性愈伤组织率达到
98.48%, 可以用于幼胚的遗传转化。ZmLEC1 基因多态性分析表明, 在 852 bp 编码区内共发现 33 个 SNPs 和 9 个
INDELs, LD衰减距离为 300 bp (R2=0.1), ZmLEC1基因中 4个多态性位点与胚性愈伤组织形成能力存在显著关联。
关键词: 玉米; ZmLEC1; 胚性愈伤组织; 关联分析
Sequence Diversity of ZmLEC1 and Association Analysis of Embryogenic calli
Formation Ability in Maize
LI Zhao1,2, ZHANG Deng-Feng2 , SUN Yong-Hua2, WU Xun2, LI Yong-Xiang2, SHI Yun-Su2, SONG
Yan-Chun2, YANG De-Guang1,*, WANG Tian-Yu2, and LI Yu2,*
1 College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural
Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: A maize association mapping population consisted of a mini core collection of ninety-five maize inbred lines and three
elite maize accessions (A188, HiII, and Zong 31) usually for genetic transformation was used to analyze the sequence diversity
and linkage disequilibrium (LD) of ZmLEC1, a candidate gene of regeneration ability in maize. A candidate gene association
strategy was used to reveal the relationship between this gene and embryogenic calli formation ability and discover favorable
alleles and genotypes enhancing the embryogenic calli formation ability. The results showed that there existed significant differ-
ences in abilities of embryogenic calli formation and regeneration among these accessions. The calli induced from Yue 267-1-1
were very similar to those of HiII, the popularly used genotype in maize transformation. Yue 267-1-1 had the highest ability of
embryogenic calli formation and regeneration and could be a new germplasm for immature embryo-based genetic transformation.
The result of sequence polymorphism analysis of ZmLEC1 showed that there were thirty-three SNPs and nine InDels in the coding
region of 852 bps. The LD between all of the informative polymorphisms decayed rapidly to about 300 bp at R2=0.1. Totally four
polymorphic sites in the ZmLEC1 gene were significantly associated with embryogenetic calli formation ability.
Keywords: Zea mays; ZmLEC1; Embryogenetic callus; Association analysis
植株再生是受多个基因调控的复杂的无性繁殖
过程。已有的研究发现存在多种与植物体细胞胚胎
发生有关的候选基因, 如体细胞胚胎发生相关类受
体蛋白激酶 (somatic embryogenesis receptor-like
kinase, SERK) 基因 [1]、亚硝酸还原酶 (Nitrite re-
ductase, NiR)基因 [2-3]、生长素结合蛋白 (Auxin
1728 作 物 学 报 第 39卷


Binding Protein 1, ABP1)基因 [4]、抗氧化酶(super-
oxide dismutase, SOD)基因、细胞分裂周期相关基
因[5](cdc2)和调控胚胎发育相关基因(leafy cotyledon
1, LEC1)等。Meinke等[6]发现在拟南芥中 LEC1在胚
胎发生过程中起重要作用, LEC1编码CCAAT-box结
合因子 HAP3 的一个亚基。Lotan 等[7]证明拟南芥
LEC1 基因在发育早期胚性细胞的形成中起关键作
用, 是胚发育的重要调节因子并能激活胚形态发生
及细胞分化所需的转录因子。在玉米中, Zhang等[8]
研究表明 ZmLEC1 基因在体细胞胚中的表达模式与
在拟南芥合子胚中的表达模式一样, ZmLEC1基因在
胚性愈伤组织中持续表达, 在球形胚状体中高表达,
说明 ZmLEC1 基因与离体组织胚状体发生关系密
切。玉米幼胚培养获得的胚性愈伤组织具有较强的
长期继代能力和分化植株能力 [9], 因而通常被用于
构建转基因受体系统。目前国际上普遍利用的玉米
遗传转化受体是 HiII (是 A188与 B73的杂交种)。
由于植株再生能力具有明显的基因型依赖性 ,
国内外对再生能力进行了基于分子标记的遗传分
析 , 并试图克隆高效再生相关基因 [10]。在玉米上 ,
Armstrong等[11]利用RFLP标记对组织培养能力进行
QTL 分析, 共找到 3 个相关性状的 11 个 QTL。
Krakowsky 等[12]在利用重组近交系(RILs)群体对玉
米愈伤组织诱导能力的遗传研究中, 检测到分布在
8条染色体上的 11个 QTL, 这些位点所在的区域均
含有与脱落酸代谢有关的基因。张红伟等[13]利用黄
早四和 Mo17 为亲本组配的 RIL 群体, 以幼胚出愈
率、II 型愈伤组织诱导率、绿点及绿苗分化率作为
相关性状指标, 共检测到与各性状相关的 8个 QTL,
分别位于第 2、第 3、第 5、第 6、第 8 和第 9 染色
体。进一步发掘和利用玉米优异再生相关基因, 不
但有助于提高组织培养植株再生率和遗传转化效率,
在转基因玉米新品种培育中也具有应用前景[14]。
关联分析是利用自然群体、以连锁不平衡(LD)
为基础来建立性状与遗传标记或候选基因间的关系
的技术方法[15], 该方法不仅是新基因发掘的有效途
径, 而且也是联系结构基因组学和表型组学的一座
桥梁[16]。基于候选基因的关联分析是发掘与表型变
异密切相关的功能等位变异的有效手段。
Thornsberry 等[17]在 2001 年首次在植物中应用关联
分析技术, 发掘出 9 个与玉米开花期相关的 Dwarf8
多态性位点(包括 5个 SNPs和 4个 InDels)。随后关
联分析广泛应用于玉米胚乳颜色[18]、淀粉合成[19]、
绿原酸含量[20]、饲用品质等[21]数量性状的研究。严
建兵等[22]发现 β 羟化酶基因(CrtRB1)可使玉米 β 胡
萝卜素含量增加 18倍, 在代谢途径中降低 β胡萝卜
素的同化效率, 使 β胡萝卜素的含量增加。
本研究对 98份材料幼胚胚性愈伤组织形成能力
鉴定评价, 分析 ZmLEC1 基因在目标群体中的序列
多样性 , 并基于候选基因关联分析策略研究
ZmLEC1 基因与胚性愈伤组织形成之间的内在联系,
旨在筛选再生率高的新基因型, 探讨玉米幼胚胚性
愈伤组织形成的遗传机制。
1 材料与方法
1.1 供试材料
98 份材料包括本实验室构建的 95 份自交系微
核心种质 [23]和 3份国内外常用于玉米幼胚遗传转化
的材料(自交系 A188和综 31, 以及杂交种 HiII)。根
据以前的研究, A188 属于瑞德群, 综 31 属于 P 群,
HiII是 A188与 B73的杂交种; 95份核心材料划分为
4个优势类群: 兰卡斯特、塘四平头、P、瑞德群, 以
及混合(mixed)群[23]。
1.2 表型鉴定
2012年将 98份材料种植于中国农业科学院作物
科学研究所试验农场内。分 2次播种, 其间相隔 20 d
以保证有充足的自交授粉幼穗。在幼穗自交授粉后
9~12 d, 取回实验室, 去除苞叶, 用 70%的酒精浸泡
幼穗 1 min, 用无菌医用刀片削去幼穗表面约 0.5 cm
深的籽粒, 用尖头镊子或刀片小心挑出幼胚, 幼胚
的合适长度为 1.0~1.2 mm [24]。将完整的幼胚摆放在
诱导愈伤培养基上, 盾片向上, 每皿摆放 50 个左右
幼胚, 每种材料 5 皿。暗培养 2 周之后将诱导出的
愈伤组织转移到继代培养基上, 2 周继代一次(暗培
养), 继代 2~3 次之后胚性愈伤组织出现, 培养基配
方见表 1。根据 Armstrong等[25]将愈伤组织质量分为
3种类型, I型为乳白色或白色, 结构紧密、坚硬, 表
面皱起 , 生长慢 , 易发生器官分化 , 胚性差不易长
期继代; II型淡黄色或黄色, 结构松散、易碎, 有明
显的颗粒状, 易发生胚状体, 且能长期继代培养, 是
理想类型; III型结构疏松, 绵软如絮, 水渍状, 白色透
明或半透明, 易褐化死亡, 不具有分化能力。
II 型胚性愈伤组织诱导率=(II 型胚性愈伤组织
数目/愈伤组织总数)×100%


第 10期 李 钊等: 玉米再生相关基因 ZmLEC1的序列变异及其与胚性愈伤组织形成能力的关联分析 1729


表 1 培养基配方
Table 1 Formula of media
培养基类型
Medium type
基础培养基
Basic
medium
蔗糖
Sucrose
(g L−1)
L-脯氨酸
L-proline
(g L−1)
水解酪蛋白
Casein
hydrolysate
(mg L−1)
肌醇
Inositol
(mg L−1)
2,4-D
(mg L−1)
KT
(mg L−1)
琼脂
Agar
(g L−1)
pH
诱导培养基
Induction medium
N6 30.00 1.38 500.00 120.00 2.00 7.00 5.80
继代培养基
Subculture
medium
N6 30.00 0.69 100.00 120.00 1.50 7.00 5.80
再生培养基
Regeneration
medium
MS 30.00 0.69 100.00 120.00 1.00 7.00 5.80

将继代 2~3 次之后出现的胚性愈伤组织转移到
再生培养基上, 光照培养, 1周左右分化出绿色幼苗,
观察各材料间愈伤组织分化成幼苗的能力。试验所
用试剂购自于北京拜尔迪生物技术有限公司。
1.3 基因型鉴定
1.3.1 目的片段的获得和测序 以 NCBI 中的
ZmLEC1 基因序列(NM_001112048.1)为参照 , 使用
DNAMAN (version 5.2.9)设计引物 , FP: 5′-AGC
CACTACTCCATCCACCACA-3′, RP: 5′-CCGGGAC
AGAATCACAGTACAACT-3′。以供试材料基因组
DNA为模板, 采用高保真的 Trans Taq HiFi酶(北京
全式金生物技术有限公司)进行 PCR 扩增, 程序为:
95℃预变性 5 min; 95℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 1 min,
30个循环; 最后 72℃延伸 10 min; 4℃保存。选取特
异性好的目标条带用试剂盒(百泰克生物公司)回收
纯化, 送农作物基因资源与基因改良国家重大科学
工程测序部用 ABI3730XL DNA 测序仪双向测序,
对每个试样测 3次以保证测序结果的准确性。
1.3.2 目标片段 DNA 序列单核苷酸多态性检测
用 Vector NTI advance 10 (Invitrogen Corpora-
tion, 2005)软件的 ContigExpress 对靶标序列进行拼
接, 用 DNAStar (version 7.10)软件包内的 EditSeq去
掉两端多余序列, 将得到的一致序列(consensus se-
quence)用 ClustalX 软件[26]进行对比, 并将完成比对
的序列保存为 PHYLIP 格式文件, 用 DNAsp5.10[27]
计算 Tajima’s D 值, 用 TASSEL[28]软件进行单核苷
酸多态性分析和连锁不平衡(LD)分析。
1.3.3 关联分析 基于 ZmLEC1序列对目标群体
进行 LD评价和目标性状关联分析, 选取 TASSEL软
件的一般线性模型。当 P<0.05时, 该位点被认为与
目标性状显著关联。
2 结果与分析
2.1 胚性愈伤组织诱导情况
98份材料中有 11份(掖 478、京糯 2号、辐 842、
大 MO、K36、H2、X.L9010-3/O2、CML67、H205、
赤黄 32、55113-3-3-5)(表 2)由于花期不遇或幼胚在
组织培养中污染而没有数据。对表型数据方差分析
显示, 不同材料之间胚性愈伤组织诱导率差异极显
著, 材料各重复之间差异不显著(表 3)。关联群体胚
性愈伤组织诱导率的平均值是 51.85%, 变幅为
6.78%~98.48%, 变异系数(CV)为 41.72, 峰度(Skew-
ness)为 0.02527, 偏度(Kurtosis)为−0.5046, 关联群
体表型数据符合正态分布, 因此用此结果进行关联
分析有可行性。
在获得表型数据的 87 份材料中有 43 份经继代
和分化而得到再生幼苗, 粤 267-1-1、资玉 3号、HiII、
A188、综 31、B73、承 18、旅 28、齐 319、黄 C、
郑 58、黄早四等材料分化及再生能力较强, 能分化
出较多幼苗, 吉 63、太 184、CN165、齐 318、XZ19
等材料分化出的幼苗较少, 且部分为畸形苗。8份 P
群材料(综 31、齐 319、遵 90110、沈 135等)诱导胚
性愈伤组织率较高, 平均胚愈率为 59.74%, 且 P 群
诱导的愈伤组织大多都能分化出绿色幼苗, 再生能
力较好。12 份瑞德群材料的平均胚愈率为 39.89%,
其中将近半数(掖 8112、5003、辽 7794、FR218、
Lo1125)胚愈率都低于 20%, 且愈伤组织质量较差,
大部分不能再生出幼苗。28份兰卡斯特群的材料平
均胚愈率是 50.91%, 13份塘四平头群材料的平均胚
愈率是 50.29%, 兰卡斯特和塘四平头类群材料都既
有胚性愈伤组织形成率高的材料又有胚愈率低的材
料。胚性愈伤组织形成能力较强的粤 267-1-1、资玉
3号、92黄 7、黄 C属于混合群。
1730 作 物 学 报 第 39卷


表 2 98 份材料胚性愈伤组诱导织率
Table 2 Embryogenic calli formation frequency of the 98 accessions
编号
ID
材料名称
Accession name
胚性愈伤
组织诱导率
FEC (%)
幼苗分化
Seedlings
differentiated
(Y/N)
编号
ID
材料名称
Accession name
胚性愈伤
组织诱导率
FEC (%)
幼苗分化
Seedlings dif-
ferentiated
(Y/N)
1 吉 63 Ji 63 48.64 Y 50 K36 — —
2 矮金 525 Aijin 525 40.63 Y 51 遵 90110 Zun 90110 69.84 Y
3 C103 31.25 N 52 P138 43.75 N
4 自 330 Zi 330 50.00 N 53 H21 38.46 N
5 塘四平头 Tangsipingtou 11.76 N 54 488 50.00 N
6 获白 Huobai 54.55 N 55 X178 41.22 Y
7 Mo17 41.00 N 56 昌 7-2 Chang 7-2 60.21 Y
8 旅 28 Lü28 72.64 Y 57 DH65232 55.78 Y
9 威风 322 Weifeng 322 91.22 Y 58 沈 137 Shen 137 58.41 N
10 华 160 Hua 160 43.48 Y 59 H2 — —
11 黄早四 Huangzaosi 50.00 Y 60 晋穗 54 Jinsui 54 49.87 N
12 E28 56.32 N 61 GB 45.24 N
13 掖 8112 Ye 8112 19.35 N 62 X.L9010-3/O2 — —
14 5003 18.67 N 63 龙抗 15 Longkang 15 37.74 N
15 掖 478 Ye 478 — — 64 皖系 23 Wanxi 23 47.98 Y
16 丹 340 Dan 340 47.30 Y 65 关 17-1 Guan 17-1 48.00 N
17 黄野四 3 Huangyesi 3 89.66 Y 66 粤 267-1-1 Yue 267-1-1 98.48 Y
18 获唐黄 17 Huotanghuang 17 49.52 N 67 粤 89E4-2 Yue 89E4-2 61.67 Y
19 综 3 Zong 3 6.78 N 68 粤 20-3 Yue 20-3 55.46 N
20 郑 58 Zheng 58 81.25 Y 69 武 202 Wu 202 63.77 Y
21 鲁原 92 Luyuan 92 18.75 N 70 CML67 — —
22 齐 319 Qi 319 48.39 Y 71 辽 2204 Liao 2204 56.89 N
23 K12 5.43 N 72 黄 C Huang C 69.24 Y
24 资玉 3号 Ziyu 3 93.02 Y 73 CN165 63.49 Y
25 京糯 2号 Jingnuo 2 — — 74 沈 135 Shen 135 69.23 Y
26 冀甜 15 Jitian 15 84.21 N 75 原武 02 Yuanwu 02 33.33 N
27 D729 36.84 N 76 444 62.37 Y
28 太 184 Tai 184 52.94 Y 77 早 49 Zao 49 73.03 N
29 XZ19 69.09 Y 78 朝鲜白 Chaoxianbai 41.11 Y
30 13A/O2 47.14 N 79 H205 — —
31 抚 96 Fu 96 87.05 Y 80 87-20 56.00 N
32 辽 7794 Liao 7794 12.50 N 81 岩 172 Yan 172 48.68 Y
33 吉 846 Ji 846 29.63 N 82 中二/O2 Zhonger/O2 73.11 Y
34 吉 880 Ji 880 52.33 Y 83 峰 273 Feng 273 30.16 N
35 九 03 Jiu 03 50.34 N 84 P39/su 53.45 N
36 辐 842 Fu 842 — — 85 92黄 7 92 huang 7 63.75 Y
37 鹿 65 Lu 65 38.46 N 86 785 67.50 N
38 岩 103 Yan 103 28.94 N 87 92黄 40 92 huang 40 42.00 N
39 齐 318 Qi 318 58.82 Y 88 赤黄 32 Chihuang 32 — —
40 48-2 70.90 Y 89 兴 83 Xing 83 18.51 N
41 FR218 15.00 N 90 龙抗 1号 Longkang 1 58.33 Y
42 大 MO DaMo — — 91 Lo1067 24.54 Y
43 遗 67 Yi 67 12.50 N 92 HR962 34.32 N
44 91黄 5 91 huang 5 66.21 Y 93 55113-3-3-5 — —
45 辽 5110 Liao 5110 88.50 Y 94 承 18 Cheng 18 80.00 Y
46 邯 102 Han 102 38.63 Y 95 B73 73.75 Y
47 De811 31.51 N 96 A188 80.39 Y
48 A632 36.42 N 97 HiII 85.09 Y
49 Lo1125 14.89 N 98 综 31 Zong 31 88.26 Y
“—”代表数据缺失。“—”: no data available. FEC: frequency of embryogenic calli.
第 10期 李 钊等: 玉米再生相关基因 ZmLEC1的序列变异及其与胚性愈伤组织形成能力的关联分析 1731


表 3 胚性愈伤组织诱导率方差分析
Table 3 Analysis of variance for induction percentage of the embryogenic callus
变异原因
Source
自由度
df
平方和
SS
均方
MS
F-value Pr>F
基因型间变异 Genotype 86 183723.3778 2136.3183 123.87 <0.0001
重复间误差 Error 301 5191.3080 17.2469
总变异 Corrected Total 387 188914.6858

2.2 ZmLEC1的序列多态性分析
2.2.1 ZmLEC1基因组DNA全长及基因结构 以
玉米自交系 B73为参照(图 1), ZmLEC1位于玉米第 5
条染色体上, 对 ZmLEC1 的结构分析表明, 编码区
自起始密码子(ATG)至终止密码子(TAG)长 837 bp,
由一个外显子组成, 无内含子。


图 1 玉米 ZmLEC1 基因结构
Fig 1 Structure of Zm LEC1 in maize
UTR: 非翻译区; CDS: 编码序列。
UTR: un-translated region; CDS: coding sequence.

2.2.2 ZmLEC1 基因的序列多态性及单倍型分析
98 份材料中有 2 份没有得到扩增产物, HiII 为
杂交种不用测序, 因此共获得 95 份材料的 ZmLEC1
序列。用 TASSEL软件分析序列多样性及 LD, 发现
在编码区共检测到 42个多态性位点, 其中包括 33个
单核苷酸多态性(SNP)和 9个插入缺失多态性(InDel),
平均每 26 bp检测到一个 SNP, 每 95 bp检测到一个
InDel, 在 ZmLEC1 整个分析区域的单核苷酸变异频
率为平均每 21 bp就有一个多态性位点。32个多态
性位点中有 29个多态性位点发生了非同义突变, 从
而引起了氨基酸的改变, 10 个多态性位点发生了同
义突变, 没有引起氨基酸的改变。核苷酸多态性 π
值为 0.01037, θw 值为 0.00799。Tajima’s D 值为
0.91698, 未达到显著水平。
该基因 14种单倍型中, 胚性愈伤组织形成能力
强的几种材料资玉 3号、沈 135、遵 90110属于单倍
型8 (平均胚性愈伤组织形成率 59.71%), 粤 267-1-1、
综 31、齐 319、黄 C 属于单倍型 9 (平均胚愈率
72.06%), A188属于单倍型 10 (平均胚愈率 54.90%),
抚 96、丹 340属于单倍型 11 (平均胚愈率 67.18%),
比较这几种单倍型的多态性位点发现, 单倍型 8、9、
10、11 与其他单倍型相比在位点 501、528 发生了
C/G转换, 其中 528位点发生了氨基酸变异, 由组氨
酸变为谷氨酰胺, 并且在位点 539 处发生了 3 个碱
基的缺失。
2.3 ZmLEC1序列多态性位点连锁不平衡分析
对 ZmLEC1 基因中的多态性(SNP 和 InDel)间
LD 的分析表明, 处于显著 LD 状态的相邻多态性位
点几乎遍布整个基因序列(图 2)。位点 40和 53、54、
57; 73和 77; 90和 91、92; 391和 419、434、440、
442; 445和 446、447; 448和 449、450; 454和 455、
456、457、458、459; 501和 528; 534和 535、536; 539
和 540、541; 594和 595、596、597、598、599、600、
601、602、642、643、644、645; 718和 729; 735和
736、737、738、739、740、741、742、743; 846和
847、848、849、850、851、852之间均存在较强的
连锁不平衡结构(R2>0.9)。
对 ZmLEC1 基因的序列多态性位点进行连锁不
平衡分析 , 以位点距离和连锁不平衡参数 R2
(squared allele-frequency correlations)作散点图表明,
ZmLEC1 在 300 bp 处 R2为 0.1, 随着遗传距离的增
加, R2 小于 0.1 水平, 即说明本研究群体该基因的
LD衰减速度较快。
2.4 ZmLEC1基因与表型性状的关联分析
关联分析共检测到 4 个与胚性愈伤组织显著关
联的位点, 其中 1 个位点达到显著水平, 位于基因
的 466位点, 而另外 3个位点则达到极显著水平, 分
别位于基因的 501、528、539位点(表 5)。在显著关
联的 4个位点中, 位点 501(G/C)、528(G/C)以及 539
(InDel)处于完全 LD状态, 位点 528G/C的转换引起
了组氨酸和谷氨酰胺的改变, 539(ACC)的插入/缺失
引起了一个组氨酸的插入/缺失, 位点 528、539可能
是引起表型变异的位点, 其位点贡献率为 9.9272%;
位点 466T/G 的颠换引起了丝氨酸和丙氨酸的改变,
其位点贡献率为 6.0656%。







表 4 95 份材料 ZmLEC1 基因的单倍型
Table 4 Haplotypes of ZmLEC1 among 95 maize accessions
多态性位点 Polymorphic site 单倍型
Haplotype
胚性愈伤组织诱
导率 FEC (%) 19 20 49 53 54 57 73 77 83 90 100 391 419 434 440 442 445 454 463 466 496
1 38.49 G T G C G C C T A 0 G G C G A C 6 6 A T C
2 42.96 G T T G T T C T A 0 G G C G A C 6 0 A T C
3 31.12 G T T G T T C T A 0 C G C G A C 6 0 A T C
4 46.86 G T T G T T C T A 0 C G C G A C 6 0 A T C
5 51.25 G C T G T T C T A 0 C G C G A C 6 0 A T C
6 80.00 G C T G T T C T C 0 C G C G A C 6 0 A T C
7 44.59 C T G C G C G C A 3 G G C G A C 6 0 A T C
8 59.71 G C T G T T C T C 0 C G C G A C 6 6 A G C
9 72.06 G T G C G C C T A 0 G G C G A C 6 6 A G C
10 54.90 C T G C G C G C A 3 G G C G A C 6 6 A G C
11 67.18 G T G C G C C T A 0 C G C G A C 6 6 A G C
12 58.34 G T G C G C C T A 0 G G C G A C 6 6 A T C
13 55.00 G T G C G C C T A 0 C G C G A C 0 6 G G T
14 51.00 G C T G T T C T C 0 C A G C G G 3 6 A G C
氨基酸变异
Change of amino acids
L/V V/A A/S A/G A/G G/R A/V Q/P
H/Q
A/-
A/P A/T A/G G/A D/G H/D HP/- PH/- M/V S/A P/S














(续表 4)
多态性位点 Polymorphic site 单倍型
Haplotype
胚性愈伤组织
诱导率 FEC (%) 498 501 528 534 539 560 594 642 643 672 702 705 718 729 735 765 768 769 781 846 847
1 38.49 C C C 3 3 G 9 T 3 G T A G G 9 T C G A G 0
2 42.96 A C C 0 3 C 9 T 3 G T A G G 9 T C G A G 0
3 31.12 A C C 0 3 C 9 T 3 G C A G G 0 C T G A C 6
4 46.86 A C C 0 3 C 9 T 3 G T A G G 9 T C G A G 0
5 51.25 A C C 0 3 C 9 T 3 G T A G G 9 T C G A G 0
6 80.00 A C C 0 3 C 9 T 3 G T A G G 9 T C G A G 0
7 44.59 A C C 0 3 C 9 T 3 G T A G G 9 T C G A G 0
8 59.71 C G G 0 0 C 9 T 3 G T A G G 9 T C G A G 0
9 72.06 C G G 0 0 C 9 T 3 G T A G G 9 T C G A G 0
10 54.90 C G G 0 0 C 9 T 3 G T A G G 9 T C G A G 0
11 67.18 C G G 0 0 C 9 T 3 G T A G G 9 T C G A G 0
12 58.34 C C C 3 3 G 0 C 0 G C A C C 9 C C A G G 0
13 55.00 C C C 3 3 G 0 C 0 A C G G G 9 T C A A G 0
14 51.00 C C C 3 3 C 0 C 0 G C A G G 9 T C A A G 0
氨基酸变异
Change of amino acids
H/Q
H/Q
H/-
H/- A/G AGP/- S/- A/P GNG/- G/S S/G Y/- YK/-
数字代表插入位点的碱基数，如 0为没有插入；3为 3个碱基插入，其他 Indel位点类推；“/” 为氨基酸改变, “/-” 为氨基酸插入或缺失.
FEC: frequency of embryogenic calli. Figures mean the number of base inserted at the site, for example, 0 for 0 insert, 3 for 3-base insert；“/”: amino acid change, “/-”: amino acid InDel.
The IDs of entries belonged to different haplotypes are listed as follows. Haplotype 1：3, 5, 11, 17, 23, 53, 54, 61, 76, 77, 82, 89, 91；Haplotype 2：2, 21, 25, 78, 85, 87, 88, 90, 92；Haplotype
3：19, 68；Haplotype 4：49, 63, 64, 65, 69, 83, 86, 81, 79, 73, 48, 43, 42, 33, 29, 28, 26, 7, 1；Haplotype5：4, 34, 37, 44；Haplotype 6：94；Haplotype 7：8, 10, 13, 32, 41, 45, 47, 62, 95；
Haplotype 8：6, 14, 24, 50, 51, 57, 59, 71, 74, 93；Haplotype 9：12, 22, 66, 72, 98；Haplotype 10：30, 46, 84, 96；Haplotype11：16, 31；Haplotype 12：9, 15, 18, 20, 36, 38, 40, 60, 67, 75；
Haplotype 13：35, 56；Haplotype 14：39, 52, 55, 58, 70




1734 作 物 学 报 第 39卷



图 2 ZmLEC1 基因多态性位点间的连锁不平衡(*表示显著性位点)
Fig. 2 Linkage disequilibrium between pairs of ZmLEC1 sequence polymorphic sites (* Significant sites)


图 3 ZmLEC1 基因多态性间的连锁不平衡衰退
Fig. 3 Decay of LD between pairs of ZmLEC1 sequence informative polymorphisms




第 10期 李 钊等: 玉米再生相关基因 ZmLEC1的序列变异及其与胚性愈伤组织形成能力的关联分析 1735


表 5 ZmLEC1 基因多态性位点与表型性状的关联分析
Table 5 Association analysis between ZmLEC1 polymorphic sites and phenotypic trait
多态性位点
Polymorphism
P值
P-value (–log10)
位点贡献率
Contribution (%)
多态性类型
SNP/InDel
是否引起氨基酸改变
Amino acid change
501 2.2151 9.9272 SNP —
528 2.2151 9.9272 SNP His/Gln
539 2.2151 9.9272 InDel His/–
466 1.4698 6.0656 SNP Ser/Ala
“—”为无氨基酸改变, “/”为氨基酸改变, “/–”为氨基酸插入或缺失.
“—”: no amino acid change, “/”: amino acid change, “/–”: amino acid indel.

3 讨论
3.1 不同材料诱导胚性愈伤组织的能力
本研究供试的材料在相同的培养条件下胚性愈
伤组织形成率从最低的 6.78%到最高的 98.48%不等,
给基因型依赖是玉米幼胚愈伤组织发生及器官建成
的重要制约因子这一观点提供了新证据。研究发现,
粤 267-1-1 的胚性愈伤组织诱导率高达 98.48%, 其
继代及分化出绿色幼苗的能力强。目前应用于玉米
幼胚遗传转化的材料仅限于少数几种, 如 A188 [25]、
HiII [29]、H99 [30]、综 31 [31]等, 今后可将粤 267-1-1
作为一种新的遗传转化受体, 扩大应用范围。
前人对不同基因型玉米幼胚离体培养筛选适合
组培的基因型, 但是由于培养基等培养条件存在差
异, 不同研究者所得出的结论不尽一致。本研究结
果表明 HiII、A188、综 31、B73、郑 58 [32]、齐 319
等一些常用于幼胚培养的材料胚性愈伤组织形成率
高, 与多数学者结论比较一致[31]。对个别不常用于
幼胚培养的材料(如昌 7-2、48-2 等)观点存在差异,
在本研究中昌 7-2 胚性愈伤组织诱导率为 60.21%且
易分化出绿色幼苗, 与胡彦民等[33]认为昌 7-2 能产
生易再生植株的 II 型愈伤组织结论一致, 而王汉宁
等[34]对 6 个玉米自交系幼胚培养研究认为昌 7-2 表
现最差, 愈伤组织诱导率≤25%。这可能是培养基和
培养环境不同所致, 从另一方面也证明基因型是影
响玉米幼胚培养的主要控制因子, 培养条件是重要
的外部因素。Duncan 等[9]用 101 份自交系、群体以
及杂交种等遗传来源较广泛的材料, 及 N6、B5、
MS 等多种培养基和不同的激素种类与水平进行实
验, 表明玉米组织培养再生能力在基因型间存在显
著差异, 仅有 49%的基因型能够产生能再生出植株
的胚性愈伤组织。吴红等[35]对 49个玉米自交系进行
幼胚培养, 其中有 15个自交系能诱导出胚性愈伤组
织最终再生成植株。本研究所用试验材料具有广泛
的遗传多样性, 幼苗再生比例(49.4%)高于吴红等的
研究而与 Duncan等的研究结果接近。
本试验中胚性愈伤组织形成能力较强的 HiII、
粤 267-1-1、资玉 3号、92黄 7、黄 C属于混合类群,
其中HiII是A188 (P群)和B73 (瑞德亚群)的杂交种。
母贵琴等[36]对 53份玉米材料(自交系 24份, 杂交组
合 29份)幼胚培养发现, F1杂种的胚性愈伤组织诱导
率具有明显的杂种优势。因此, HiII的高胚性愈伤组
织诱导率和高再生能力可能与杂种优势有关。粤
267-1-1 与塘四平头亚群和瑞德亚群有 53.9%和
44.9%的遗传相似性; 资玉 3号与兰卡斯特亚群和瑞
德亚群有 76.3%和 21.1%的相似性; 92黄 7与兰卡斯
特亚群和塘四平头亚群有 70.9%和 26.8%的相似性;
黄C与瑞德和塘四平头有 73.4%和 25.7%的相似性[23]。
因此, 粤 267-1-1、资玉 3号、92黄 7、黄 C可能是综
合了不同遗传背景中的与再生能力相关的基因从而
拥有较高的胚性愈伤组织形成能力和再生能力。
3.2 ZmLEC1基因的多样性
本研究结果表明, ZmLEC1 基因在扩增出的 95
份材料中拥有较高的核苷酸多样性水平。ZmLEC1
序列中的 42 个多态性位点中包含 33 个 SNPs 和 9
个 InDels。Ching 等[37]对 36 份自交系 18 个基因研
究表明, 每 61 bp存在一个 SNP, 每 126 bp存在一个
Indel。Jung等[38]研究中检测到每 83~104 bp出现一
个 SNP, 186 bp出现一个 InDel。本研究 ZmLEC1基
因中 SNP、InDel频率均高于玉米中 SNP、InDel的
平均水平, 与 Tenaillon 等对一组多样性玉米种质调
查其序列多样性的研究结果接近(在 14 420 bp中检
测到 522个 SNP位点, 平均每 27.6 bp存在一个 SNP
位点), 这与本研究选用的材料具有广泛的遗传多样
性有关。
利用 ZmLEC1序列中的 SNP位点作 Tajima D测
验, 目的是鉴定目标DNA序列在进化过程中是否遵
循中性进化模型。在中性进化条件下, θw和 π 值应
该近似相等。因此在标准中性进化模型下, Tajima D
1736 作 物 学 报 第 39卷


的理论值为零。在本试验中的 Tajima D 值为
0.91698, 未达到显著水平, 表明 ZmLEC1 基因在进
化过程中经受的选择作用较小 , 未偏离中性进化 ,
没有发生纯化选择。另外, ZmLEC1的 Tajima D值为
正值 , 表明群体中存在较多中等频率的等位基因 ,
可能是存在群体结构、经历瓶颈效应或平衡选择的
结果。因此, 可以认为 ZmLEC1 基因在进化中受到
自然和人工选择、遗传漂变等因素的影响较小。
3.3 ZmLEC1基因的 LD水平及影响因素
玉米为异交作物, 有效重组率高, 重组导致连
锁的位点彼此独立存在, 从而减弱了染色体内部的
LD[38], 因此 LD的衰退一般比较迅速[39]。Remington
等 [40]研究表明在具有广泛变异的玉米白交系中的
LD衰退距离是 1.5 kb, Tenaillon等[41]研究显示第 1
染色体上 21 个位点均存在 LD 的快速衰退, 平均在
100~200 bp以内。本研究中 ZmLEC1基因大约在 300
bp处衰减到 R2=0.1水平, 由于本研究选用的材料是
来自玉米核心种质的一组能最大限度代表我国玉米
遗传多样性的自交系, 这组自交系具有广泛的遗传
多样性, 因此利用这组种质检测到的候选基因的 LD
水平也相应较低一些, 与前人研究结果接近。本研
究中 ZmLEC1基因区域检测到的LD快速衰退, 也暗
示着利用该候选基因的序列多态性进行关联研究 ,
将具有较高的分辨率。
3.4 ZmLEC1 基因的多态性与表型性状的关联
分析
连锁不平衡分析和关联分析发现基于单倍型的
分析比基于单个 SNP分析可提供更多的生物学信息,
并且在分析 SNP—性状关联时更为有效。在 ZmLEC1
基因编码序列中一些多态性位点引起了胚性愈伤组
织形成的表型差异, 在显著关联的 4个位点中, 位点
501 (G/C)、528 (G/C)以及 539 (InDel)处于完全 LD
状态, 组成一个单倍型, 其中位点 528G/C的转换引
起了组氨酸和谷氨酰胺的改变, 胚性愈伤组织形成
能力强的第 8、第 9、第 10、第 11单倍型在位点 528
处为 G, 编码谷氨酰胺, 并且在 539处有 3个碱基的
缺失, 从而引起了一个组氨酸的缺失, 501 位点 G/C
的转换并没有引起氨基酸的改变, 因此, 位点 528、
539 可能是引起表型变异的位点, 其位点贡献率为
9.9272%; 位点 466T/G 的颠换引起了丝氨酸和丙氨
酸的改变, 可能也是引起表型变异的关键位点, 其
位点贡献率为 6.0656%, 因此其 SNP 也可作为一种
分子标记来筛选胚性愈伤组织形成能力强的基因型;
42个多态性位点中有 32个发生了非同义突变, 从而
引起了氨基酸的改变, 10 个发生了同义突变, 没有
引起氨基酸的改变, 这种推测只是根据基因编码的
核酸序列变化, ZmLEC1基因在复制、转录、翻译及
翻译后是否受到其他因素调控从而与原来的参考序
列在蛋白质一级乃至高级结构上是否发生改变, 尚
需研究验证。胚性愈伤组织形成本身是个复杂的过
程, 是受多基因调控的数量性状。本试验在关联分
析时仅用了一个玉米再生相关候选基因 ZmLEC1,
得出的结果尚需进一步验证。
4 结论
自交系粤 267-1-1 诱导出的愈伤与杂交种 HiII
诱导出的愈伤组织极为相似, 都是再生能力好的 II
型愈伤, 可作为玉米幼胚遗传转化的替代受体材料,
也有利于转化基因的回交转育。针对资玉 3 号、92
黄 7、黄 C、威风 322、黄野四 3等胚性愈伤组织形
成能力较好的自交系 , 可以通过优化培养基成分 ,
进一步提高转化效率。ZmLEC1 基因比对序列总长
852 bp区间内共发现 33个 SNPs和 9个 InDels, 在
整个基因序列内 LD水平较高, 在大约 300 bp处 R2
衰减到 0.1水平, ZmLEC1基因符合中性进化模型假
设, 没有发生纯化选择。ZmLEC1基因中有 4个多态
性位点与胚性愈伤组织形成显著关联。通过进一步
开发功能标记, 并用于把优异等位基因向生产上应
用自交系转移的育种程序, 将培育出适应我国不同
玉米生态区的高转化效率自交系, 促进转基因玉米
新品种培育。
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