全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(5): 803−810 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30700504)和国家转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08009-083B和 2009ZX08002-008B)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 徐兆师, E-mail: xuzhaoshi@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2010-10-25; Accepted(接受日期): 2011-03-08.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00803
小麦 ERF转录因子W17互作蛋白的筛选和解析
邱志刚 徐兆师* 郑天慧 李连城 陈 明 马有志
中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基金资源和基因改良国家重大科学工程 / 农业部作物遗传改良与育种重点开放实验室,
北京 100081
摘 要: 来自小麦的 ERF 转录因子 W17 基因参与胁迫应答, 过表达 W17 可显著提高转基因拟南芥的抗旱性和抗病
性。本研究构建了小麦 cDNA文库, 通过酵母双杂技术筛选 W17的互作蛋白, 进一步解析 ERF蛋白的作用机制。将
pGBKT7-W17 质粒、pGADT7 和小麦文库混合转入酵母细胞 AH109, 在 SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade 营养缺陷型平板上
培养, 挑选直径大于 2 mm的克隆, 在 SD/Raf/Gal/X-gal平板上划线培养, 筛选蓝色克隆。将筛出的克隆测序、BLAST
分析, 得到 4 类与 W17 相互作用的候选蛋白, 分别是胁迫相关功能蛋白、翻译后修饰蛋白、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/
加氧酶(Rubisco)大亚基/小亚基以及功能未知蛋白。互作验证表明, HSP90和 PPR蛋白与 W17有相互作用关系。这些
候选蛋白参与信号转导或免疫过程, 暗示 W17 在植物的逆境信号转导、下游基因转录调控, 甚至在翻译过程都有重
要作用。
关键词: 酵母双杂交系统; ERF; 蛋白互作; 信号转导; 小麦
Screening and Identification of Proteins Interacting with ERF Transcription
Factor W17 in Wheat
QIU Zhi-Gang, XU Zhao-Shi*, ZHENG Tian-Hui, LI Lian-Cheng, CHEN Ming, and MA You-Zhi
Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement /
Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding of Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China
Abstract: Ethylene responsive factors (ERFs) regulate a variety of biotic- and abiotic-stress responses. Transcription factor W17
is an ERF isolated from wheat (Triticum aestivum L.), which participates in stress responses. To provide data for exploring the
functional mechanism of ERF proteins, we constructed a wheat cDNA library and screened proteins interacting with W17 by yeast
two-hybrid system. The mixture of recombinant plasmid pGBKT7-W17, pGADT7, and wheat cDNA library was introduced into
yeast cell AH109. Transformed cells were incubated on SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade plate for 3–5 d at 30℃ before selection of
clones with diameter larger than 2 mm, and further incubated on SD/Raf/Gal/X-gal for screening blue clones. Four types of pro-
teins that interacted with W17 were obtained, namely stress-related functional protein, post-translational modification protein,
ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, and unknown protein. The protein–protein interaction was retested using the
co-transformation yeast system of pGBKT7-W17 and candidates of interaction protein carried by pGADT7. The result showed
that HSP90 and PPR proteins interacted with W17 in vivo. Most of candidate proteins involved in signal transduction and immune
process, such as Tir cytoskeleton coupling protein (TCCP), 26S proteasome subunit, RNA binding protein, WD40, PPR, HSP90,
and cysteine proteinase inhibitor. This result suggests that W17 possibly plays significant roles in stress signal transduction, tran-
scription regulation of downstream genes, and translation process in stress environments.
Keywords: Yeast two-hybrid system; Ethylene responsive factor (ERF); Protein interaction; Signal transduction; Common wheat
各种植物病虫害等生物逆境以及干旱、高盐等
非生物逆境严重影响作物的生长和产量。研究植物
对逆境信号的感知、传递以及适应性响应的分子机
制, 对于阐明植物适应逆境机制, 提高作物抗性有
804 作 物 学 报 第 37卷

着重要的意义[1]。
植物在长期进化过程中形成了一套复杂而精细
的信号传递网络, 能对外界胁迫信号产生一系列应
答响应, 诱导抗逆相关基因的表达, 保护细胞正常
的生命活动。其中, 转录因子(transcription factor, TF)
对信号传递和基因的表达调控起非常重要的作用。
植物体内存在大量的转录因子, 拟南芥(Arabidopsis
thaliana)中有 5.9%的基因编码转录因子, 根据 DNA
结构域的特点将转录因子分成若干个家族 , 如
WRKY、AP2/EREBP、MYB 和 bZIP。AP2/EREBP
家族是植物中分布最为广泛且研究比较深入的一类
转录因子 , 包括 AP2、RAV、DREB、 ERF 和
AL079349 5个亚族[2]。ERF转录因子是 AP2/EREBP
家族中最大的一个亚族[3], 参与 GCC-box 和 DRE/
CRT 顺式元件的调控, 介导植物生物和非生物两条
胁迫信号传递途径, 在胁迫相关基因的表达调控中
起重要作用[4]。例如, 烟草的 Tsi1 和辣椒的 CaPF1
蛋白能够结合 GCC-box和 DRE/CRT元件, 诱导 PR
基因(PR1、PR2、PR3、osmotin、SAR8.2)和 RD/COR
基因(COR47、COR6.6、COR78/RD29)的表达, 从而
提高植株的抗性[5-6]。
ERF 基因在提高植物抗病性和非生物胁迫抗性
上发挥着重要作用[4]。据报道, 烟草 Tsi1 基因的超
表达提高了辣椒对细菌和病毒的抗性 [7]; 转大麦
HvRAF 基因的拟南芥植株增强了对青枯病的抗病
力[8]; 大豆 GmERF057 基因提高了转基因烟草对细
菌、盐和干旱的抗性[9]; JERF1和 JERF3基因提高了
转基因烟草的抗盐、抗旱和抗寒性[10-11]; 将辣椒的
CaPF1基因转到弗吉尼亚松(Pinus virginiana Mill.)
中, 提高了转基因树木对重金属、高温和病原菌等
多种抗性, 而且明显增加了植株生长高度[12]; 转小
麦 TaERF1 基因的拟南芥提高了对低温、干旱、高
盐以及灰霉病 (Botrytis cinerea)的抵抗力 , 转
TaERF1 基因的烟草增加了植株的抗盐性和对野火
病(Pseudomonas syringae)的抗病性[13]。
解析逆境胁迫信号调控网络已经成为当前植物
逆境应答反应分子机制研究的热点。过去几年, 对
ERF 基因的研究主要集中在可能介导的信号传递途
径、对下游基因的转录调控和功能上, 而对 ERF 蛋
白的作用模式, 包括与其他蛋白的互作机制研究甚
少。转录因子的活性受许多因素的影响, 如转译后
修饰以及与其他蛋白之间的相互作用。例如, 拟南
芥细胞核提取物能增强拟南芥 GBF1 转录因子的
DNA结合能力[14]。因此, 研究转录因子的互作蛋白
及其功能, 对于研究转录因子的作用机制和抗逆相
关基因的调控具有重要的意义。
小麦是我国的重要粮食作物, 生物和非生物胁
迫严重影响着小麦的产量和品质。我们从小麦中克
隆了一个 ERF 基因 W17, 受干旱、脱落酸(ABA)和
乙烯等诱导, 可显著提高转基因拟南芥的抗旱性和
抗病性[13]; W17 蛋白具有核定位功能, 可通过自身
的 NLS进入核内行使功能[15]。为了进一步研究 W17
的作用机制, 本文采用酵母双杂交技术, 以 W17 作
为“诱饵”蛋白, 从小麦 cDNA 文库中筛选互作蛋
白, 为进一步解析 ERF蛋白的作用机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料及 cDNA文库构建
将普通小麦(Triticum aestivum L.)品种小白麦播
种在苗床上, 20~24℃生长 10 d左右, 从土壤中取出,
用蒸馏水冲洗干净, 放在滤纸上干旱处理 2 h, 取叶
片立即放入液氮中 , 并保存在–80℃条件下准备提
取 RNA。
采用 Trizol 法(TianGen, 北京)提取小麦叶片总
RNA, 第一链 cDNA 合成用反转录酶 XL(AMV)
(TaKaRa, 大连)。采用 SMART法(BD)合成 ds cDNA,
取 2 μL cDNA在 100 μL体系中进行 LD-PCR扩增,
循环数为 24, 延伸时间为 6 min。扩增结束后取
PCR产物 5 µL在 1.0%琼脂糖凝胶中电泳检测。
1.2 诱饵载体的构建及自激活检测
根据 W17基因的序列及 pGBKT7 (Clontech, 美
国)的克隆位点, 在基因的两端分别引入 EcoR I 和
BamH I (Promega, 美国)酶切位点。酶切、连接(T4
连接酶, Promaga, 美国)到质粒 pGBKT7。测序验证
融合质粒 pGBKT7-W17克隆正确。
将 pGBKT7-W17、空 pGBKT7以及阴性对照分
别与 pGADT7 共同转入酵母菌株 AH109 中, SD/–
Trp/–Leu (Sigma, 德国)和 SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade
(Sigma, 德国)平板筛选培养, 验证 pGBKT7- W17是
否具有自激活活性。
1.3 酵母感受态的制备、诱饵质粒及文库质粒的
转化
采用酵母双杂交系统(Clontech, 美国), 按说明
书(MATCHMAK2 ER pLexA Two-Hybrid User Ma-
nual 和 Yeast Protocols Handbook)方法制备 AH109
感受态细胞, 将 pGBKT7-W17质粒、pGADT7和小
第 5期 邱志刚等: 小麦 ERF转录因子 W17互作蛋白的筛选和解析 805


麦文库混合转入酵母细胞 AH109。
1.4 酵母双杂交筛选阳性克隆
诱饵载体 BD质粒 pGBKT7带有 Trp筛选标记,
AD质粒 pGADT7带有 Leu筛选标记。将 pGBKT7-
W17、pGADT7 和文库质粒混合转化 AH109, 涂布
于 SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade营养缺陷型平板, 30℃培
养 3~5 d, 用牙签挑取直径大于 2 mm 的阳性克隆,
然后在 SD/Raf/Gal/X-gal (Sigma, 德国)平板上画线
培养, 筛选蓝色克隆。
1.5 候选克隆 PCR检测、测序及分析
将筛选出的阳性酵母菌落进行 PCR检测。PCR
条件为 94℃预变性 3 min; 94℃ 30 s, 68℃ 3 min, 30
个循环; 68℃ 3 min。PCR引物序列分别为 5′-CTAT
TCGATGATGAAGATACCCCACCAAAC-3′和 5′-G
TGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTAC-3′ 。 用
插入片段大于 500 bp 的克隆提取质粒(TianGen, 北
京), 转化到大肠杆菌 DH5α (TransGen, 北京), 送
SunBiotech 公司 (北京 )测序 , 通过检索 GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和利用 DNAMAN 软
件(Lynnon Biosoft, 美国)进行多重序列比较和同源
性分析。
1.6 酵母双杂交互作验证
按前述方法制备酵母 AH109感受态细胞。采用
共转化方法将 pGBKT7-W17以及连有可能互作基因
的 pGBKT7-W17pGADT7 质粒转化入酵母细胞中。
将转化后的酵母划线于 SD/–Trp/–Leu平板上。若酵
母菌株在 SD/–Trp/–Leu平板上生长则证明诱饵载体
和可能的互作质粒载体均已转入酵母菌株 AH109
中。挑取 SD/–Trp/–Leu平板上生长的单克隆菌株于
1 mL YPDA液体培养基中。在 30℃下振荡培养 2 d
后 , 吸取 1 μL 酵母菌液点到 SD/–Trp/–Leu/–His/
–Ade/X-α-gal 平板上。将平板置于 30℃培养 3~4 d
后长出蓝色菌落组合为互作阳性结果。
2 结果与分析
2.1 cDNA文库的构建
所提取的小麦总 RNA 经紫外分光光度计分析,
A260/A280=1.85。1%琼脂糖凝胶电泳可见 28S 和 18S
的清晰 RNA条带, 而且 28S RNA是 18S RNA的 2
倍左右(图 1), 表明获得的总 RNA 纯度及浓度较高,
可以满足后续实验的需要。
用 3 μL 总 RNA 为模板合成 cDNA, 取 2 μL
cDNA进行 LD-PCR扩增 ds cDNA。合成的 ds cDNA
质量较好, 主要集中在 250~2 000 bp之间(图 2), 可
以用于 cDNA文库的构建。

图 1 小麦总 RNA电泳
Fig. 1 Gel electrophoretic result of total RNA from wheat

图 2 小麦双链 cDNA凝胶电泳图
Fig. 2 Gel electrophoretic result of double-stranded cDNA
from wheat
1: ds cDNA; M: DL2000 marker.

2.2 诱饵载体的构建及自激活检测
将 W17 基因全长克隆到诱饵载体 pGBKT7 中,
得到重组质粒 pGBKT7-W17。经酶切(图 3)并测序鉴
定, W17 基因已成功插入质粒 pGBKT7 中。为检测
重组质粒是否具有自激活活性, 将 pGBKT7-W17、
空 pGBKT7以及阴性对照分别与 pGADT7共同转入
酵母菌株AH109中, SD/–Trp/–Leu和 SD/–Trp/–Leu/–
His/–Ade平板筛选培养 2~3 d (图 4), 除阴性对照外,
在 SD/–Trp/–Leu平板上都能长出菌落, 在 SD/–Trp/–
Leu/–His/–Ade 平板上都没有长出菌落 , 说明
pGBKT7-W17 没有自激活活性, 可以在营养缺陷型
SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade 平板筛选培养上用酵母双
杂交系统筛选小麦 cDNA文库。
2.3 W17互作蛋白的筛选
将“诱饵”质粒 pGBK-W17、文库质粒 pGADT7
混合转化 AH109, 涂布于营养缺陷型 SD/–Trp/
–Leu/–His/–Ade 平板, 30℃培养 3~5 d, 选择直径大
于 2 mm的菌落, 共得到 160个候选克隆(图 5-A)。
牙签挑取候选克隆, 在 SD/Raf/Gal/X-gal 平板上画
806 作 物 学 报 第 37卷


图 3 质粒 pGBKT7-W17双酶切及 PCR鉴定
Fig. 3 Identification of pGBKT7-W17 by EcoR I/BamH I dou-
ble digestion and PCR analysis
M: DL2000 marker; 1: PCR扩增结果; 2: EcoR I/BamH I双酶切鉴
定; 3: 重组质粒 pGBKT7-W17。
M: DL2000; 1: PCR amplification result; 2: identification by EcoR
I/BamH I; 3: recombined plasmid pGBKT7-W17.

图 4 pGBKT7-W17的自激活验证
Fig. 4 Validation of pGBKT7-W17 for auto-activation
1: pGADT7+pGBKT7-W17; 2: H2O+pGADT7;
3: pGADT7+pGBKT7.

线培养, 大约 1/5的阳性克隆显蓝色(图 5-B)。
2.4 候选基因的克隆及序列分析
将显蓝的克隆进行 PCR检测, 检测结果显示插
入片段多数大小不一 , 但是大多数集中在 500~
2 000 bp (图 6), 说明 cDNA文库的质量较好。克隆
10 和克隆 11 有 2 条 PCR 扩增带, 可能有 2 个质粒
被转到酵母细胞, 需要进一步鉴定。
将扩增带大于 500 bp的酵母质粒转化大肠杆菌
DH5α 进行测序 , 测序结果提交到 GenBank 进行

图 5 W17互作蛋白筛选
Fig. 5 Screening proteins interacting with W17
A: 筛库得到的克隆; B: 在 SD/Raf/Gal/X-gal上画线筛选筛选阳
性克隆。
A: clones identified by screening cDNA library; B: the positive
clones were tested on SD/Raf/Gal/X-gal plates.

BLAST分析。结果表明, 克隆到的基因主要分为胁
迫相关功能基因、翻译后修饰蛋白、1,5-二磷酸核酮
糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)大亚基/小亚基以及功能
未知蛋白 4 类。部分测序结果及其可能的功能见表
1。
2.5 蛋白的互作验证
将诱饵和候选蛋白的质粒转化酵母细胞, 在营
养缺陷型 SD/–Trp/–Leu 平板上划线培养, 挑取单菌
落摇菌, 吸取 1 μL点至 SD/–Trp/–Leu平板上。酵母
在 SD/–Trp/–Leu平板上生长证明互作组合蛋白均转
化入酵母细胞中。再吸取 1 μL菌液点在营养缺陷型
SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade/X-α-gal 平板上培养, 结果
显示HSP90和 PPR的菌落能正常生长且菌落显蓝色
(图 7)。这一结果初步证实 HSP90 和 PPR 蛋白与
W17发生了相互作用。
3 讨论
酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)快速、
直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已
知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统
虽然仍有一定的局限性, 如要求蛋白间的相互作用
定位于细胞核内; 同时该系统不适用某些需经过翻

图 6 酵母克隆的 PCR检测
Fig. 6 PCR identification of yeast clones
M: DL2000 marker; 1~19: 酵母克隆。M: DL2000 marker; 1–19: yeast clones.

第 5期 邱志刚等: 小麦 ERF转录因子 W17互作蛋白的筛选和解析 807


表 1 部分测序结果及 Blast分析推测的功能
Table 1 Part of sequencing results and predicted functions by Blast analysis
基因
Gene
GenBank登录号
GenBank accession No.
功能
Function
胁迫相关功能基因 Stress-related function gene
NADPH NM_001069918 参与逆境条件下活性氧的产生。
26S proteasome subunit NM_100359 与 DNA 修复、转录调节、细胞程序性凋亡等细胞生理过程有关。在高等植物
中, 参与植物胁迫、雄性不育、衰老过程。
Cysteine proteinase inhibitor AY062608 抑制半胱氨酸肽链内切酶的水解作用, 有很好的生物防御作用, 可抑制治病真
菌, 如赤霉病、稻瘟病菌等的生长。抑制鞘翅目昆虫消化蛋白质的能力, 起到
抗虫作用。
PPR NM_120563 大多数定位在细胞器叶绿体或线粒体上, 对细胞器基因的表达具有重要的调节
作用, 参与植物雄性不育、胁迫等响应。
翻译后修饰蛋白 Post-translational modification protein
WD40 NM_124800 通过介导蛋白质间的相互作用发挥其功能, 参与调节包括信号转导、mRNA 剪
接、组蛋白修饰、细胞骨架组装和细胞周期调控等重要过程。
TCCP NZ_ABKY02000004 在紧密素转位受体(Tir)与信号分子和细胞骨架之间充当桥梁的作用。
RNA binding protein NM_104627 RNA的特异结构或序列结合, 进而调节 RNA的剪辑、运输、稳定性和翻译, 转
录后水平基因表达调控的主要承担者, 抑制 miRNAs作用。
HSP90 NM_124642 在参与信号转导的蛋白和参与细胞周期调控的蛋白的折叠、激活甚至运输过程
中起重要作用。
1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶 1,5-ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase
Rubisco large/small subunit AY836183 参与植物的光呼吸代谢途径, 大亚基起固定 CO2的催化作用, 小亚基则起着影
响酶的催化效率以及 CO2/O2的注意性结构区域的作用。二者还与植物对氮的吸
收、利用和循环有关。
未知蛋白 Unknown protein


图 7 候选蛋白与 W17的互作验证
Fig. 7 Validation of interaction between candidate proteins
and W17
1: BD+AD; 2: BD-17+AD; 3: BD+AD+PPR; 4: BD+AD-90;
5: BD-17+AD-PPR; 6: BD-17+AD-90.

译后加工才能相互作用的蛋白, 但仍然是从 cDNA
文库中寻找新的互作蛋白的一种快捷有效的方法。
本研究构建了小麦 cDNA 文库, 用酵母双杂交技术
筛选到 4 类与 ERF 转录因子 W17 相互作用的候选
蛋白, 为深入研究 W17的抗逆机制奠定了基础。
早期研究表明, ERF 基因家族介入了乙烯信号
调控途径[16-17], 但近几年的研究发现乙烯、茉莉酸、
水杨酸和 ABA 等几种重要的信号分子传递途径都
参与了对 ERF基因家族的转录调控[18-24]。因此, ERF
转录因子家族可能在乙烯、茉莉酸、水杨酸和 ABA
信号传递途径中处于核心位置, 参与对不同信号的
传递和对下游基因的转录调控。目前, 对 ERF 基因
家族在不同信号传递中的作用以及信号传递涉及到
的蛋白尚不清楚。
许多 ERF蛋白功能的发挥需要转录后修饰或参
与蛋白间的互作, 包括转录因子、腈水解酶和泛素
连接酶等[17,25-26]。因此, 筛选 W17 互作蛋白、构筑
互作图谱、分析互作机制对揭示 W17基因在不同信
号传递中的作用及其转录表达调控具有的重要意
义。本研究获得的 W17互作蛋白的大部分都与植物
的抗逆、基因表达调控有关。
HSP90 是一类大量存在且高度保守的分子伴侣,
在细胞的生长进程中起着至关重要的作用[27-28]。叶
绿体特异性的 HSP90-5 突变导致拟南芥对红光应
答、氯酸盐抗性的改变和 cr88突变体中组成型的叶
绿体发育的延迟[29]; 敲除 HSP90基因能导致植物形
态学的改变[30]。最近发现, HSP90 介导了对植物的
抗逆响应。胞质 HSP90与 R蛋白之间互作而具有抗
病性 [31-32]; 在拟南芥和烟草中 , 多个证据表明
HSP90、SGT1及 RAR1之间存在相互作用, 这种互
作对 R蛋白的活性起重要作用[33-35]。在逆境条件下,
分子伴侣 HSP90 产物急剧增加, 帮助靶蛋白正确折
808 作 物 学 报 第 37卷

叠、或清除损伤的靶蛋白, 从而帮助细胞恢复正常
状态并提高生存能力[36]。因此, 我们推测 HSP90可
能参与了小麦 ERF转录因子介导的信号传递网络。
PPR 基因家族在线粒体和叶绿体基因表达调控
中具有重要作用。玉米 PPR蛋白 CRP1定位在叶绿
体的基质上, 参与叶绿体基因 petD和 petA转录本的
翻译以及对 petD 初始转录本进行加工[37]。拟南芥
PPR 蛋白 HCF152 是叶绿体 RNA 加工和剪接因子,
参与 psbB-psbT-psbH-petB-petD 转录本的正确加工
过程[38-39]。此外, PPR蛋白在线粒体 RNA的加工过
程中也具有重要的作用。酵母 PPR 蛋白 PET309 定
位在线粒体上 , 对保持含有内含子线粒体基因
COX1 初始转录物的稳定性和成熟 mRNA 翻译起重
要作用 [40]。PPR 基因不仅对细胞器基因进行调节,
而且对细胞器外一些基因的表达也起作用。例如 ,
果蝇 PPR蛋白 BSF对果蝇早期胚胎发育模式的形成
起作用, 它特异地结合在 bicoid mRNA 3′端非翻译
区, 提高 mRNA的稳定性[41]。
本研究通过酵母双杂交系统筛选出来的蛋白多
参与信号转导或免疫过程。W17 与 HSP90、RNA
binding protein、PPR等蛋白相互作用, 表明 W17在
植物的逆境信号转导、下游基因的转录调控, 甚至
翻译过程中的作用都至关重要。研究这些蛋白的功
能反过来可以验证W17的生物学作用, 更好地阐明
小麦 ERF转录因子可能参与的信号传递网络、与其
他蛋白的作用机制及其转录表达调控。
4 结论
构建了小麦 cDNA 文库, 用酵母双杂技术筛选
到W17互作蛋白, 许多候选蛋白参与信号转导或免
疫过程, 暗示 ERF 转录因子可能与植物的逆境信号
转导、下游基因的转录调控具有相关性。
References
[1] Zhu J K. Plant salt tolerance. Trends Plant Sci, 2001, 6: 66−71
[2] Sakuma Y, Liu Q, Dubouzet J G, Abe H, Shinozaki K, Yamagu-
chi-Shinozaki K. DNA-binding specificity of the ERF/AP2 do-
main of Arabidopsis DREBs, transcription factors involved in
dehydration- and cold-inducible gene expression. Biochem Bio-
phys Res Commun, 2002, 290: 998−1009
[3] Nakano T, Suzuki K, Fujimura T, Shinshi H. Genome-wide
analysis of the ERF gene family in Arabidopsis and rice. Plant
Physiol, 2006, 140: 411−432
[4] Xu Z S, Chen M, Li L C, Ma Y Z. Functions of the ERF tran-
scription factor family in plants. Botany, 2008, 86: 969−977
[5] Park J M, Park C J, Lee S B, Ham B K, Shin R, Paek K H.
Overexpression of the tobacco Tsi1 gene encoding an EREBP/
AP2-type transcription factor enhances resistance against patho-
gen attack and osmotic stress in tobacco. Plant Cell, 2001, 13:
1035−1046
[6] Yi S Y, Kim J H, Joung Y H, Lee S, Kim W T, Yu S H, Choi D.
The pepper transcription factor CaPF1 confers pathogen and
freezing tolerance in Arabidopsis. Plant Physiol, 2004, 136:
2862−2874
[7] Shin R, Park J M, An J M, Paek K H. Ectopic expression of Tsi1
in transgenic hot pepper plants enhances host resistance to viral,
bacterial, and oomycete pathogens. Mol Plant Microbe Interact,
2002, 15: 983−989
[8] Jung J, Won S Y, Suh S C, Kim H, Wing R, Jeong Y, Hwang I,
Kim M. The barley ERF-type transcription factor HvRAF con-
fers enhanced pathogen resistance and salt tolerance in Arabi-
dopsis. Planta, 2007, 225: 575−588
[9] Zhang G, Chen M, Chen X, Xu Z, Guan S, Li L C, Li A, Guo J,
Mao L, Ma Y. Phylogeny, gene structures, and expression pat-
terns of the ERF gene family in soybean (Glycine max L.). J Exp
Bot, 2008, 59: 4095−4107
[10] Wu L, Chen X, Ren H, Zhang Z, Zhang H, Wang J, Wang X C,
Huang R. ERF protein JERF1 that transcriptionally modulates
the expression of abscisic acid biosynthesis-related gene en-
hances the tolerance under salinity and cold in tobacco. Planta,
2007, 226: 815−825
[11] Wu L, Zhang Z, Zhang H, Wang X C, Huang R. Transcriptional
modulation of ethylene response factor protein JERF3 in the oxida-
tive stress response enhances tolerance of tobacco seedlings to salt,
drought, and freezing. Plant Physiol, 2008, 148: 1953−1963
[12] Tang W, Charles T M, Newton R J. Overexpression of the pepper
transcription factor CaPF1 in transgenic Virginia pine (Pinus vir-
giniana Mill.) confers multiple stress tolerance and enhances or-
gan growth. Plant Mol Biol, 2005, 59: 603−617
[13] Xu Z S, Xia L Q, Chen M, Zhang R Y, Li L C, Zhao Y X, Lu Y,
Ni Z Y, Liu L, Qiu Z G, Ma Y Z. Isolation and molecular cha-
racterization of the Triticum aestivum L. ethylene-responsive
factor 1 (TaERF1) that increases multiple stress tolerance. Plant
Mol Biol, 2007, 65: 719−732
[14] Klimczak L J, Collinge M A, Farini D, Giuliano G, Walker J C,
Cashmorea A R. Reconstitution of Arabidopsis casein kinase II
第 5期 邱志刚等: 小麦 ERF转录因子 W17互作蛋白的筛选和解析 809


recombinant subunits and phosphorylation of factor GBFl from
transcription. Plant Cell, 1995, 7: 105−115
[15] Zhao Y-X(赵云祥), Liu P(刘沛), Xu Z-S(徐兆师), Chen M(陈
明), Li L-C(李连城), Chen Y-F(陈耀锋), Xiong X-J(熊祥进),
Ma Y-Z(马有志). Analysis of specific binding and subcellular
localization of wheat ERF transcription factor W17. Sci Agric Sin
(中国农业科学), 2008, 7(6): 647−655 (in Chinese with English
abstract)
[16] Ohme-Takagi M, Shinshi H. Ethylene-inducible DNA binding
proteins that interact with an ethylene-responsive element. Plant
Cell, 1995, 7: 173−182
[17] Büttner M, Singh K B. Arabidopsis thaliana ethylene-responsive
element binding protein (AtEBP), an ethylene-inducible, GCC
box DNA-binding protein interacts with an ocs element binding
protein. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94: 5961−5966
[18] Gu Y Q, Yang C, Thara V K, Zhou J, Martin G B. Pti4 is in-
duced by ethylene and salicylic acid, and its product is phos-
phorylated by the Pto kinase. Plant Cell, 2000, 12: 771−785
[19] Oñate-Sánchez L, Singh K B. Identification of arabidopsis eth-
ylene-pesponsive element binding factors with distinct induction
kinetics after pathogen infection. Plant Physiol, 2002, 128:
1313−1322
[20] Berrocal-Lobo M, Molina A. Ethylene response factor 1 mediates
Arabidopsis resistance to the soilborne fungus Fusarium ox-
ysporum. Mol Plant Microbe Interact, 2004, 17: 763−770
[21] Lee J H, Kim D M, Lee J H, Kim J, Bang J W, Kim W T, Pai H
S. Functional characterization of NtCEF1, an AP2/EREBP-type
transcriptional activator highly expressed in tobacco callus.
Planta, 2005, 222: 211−224
[22] Hu Y, Zhao L, Chong K, Wang T. Overexpression of OsERF1, a
novel rice ERF gene, up-regulates ethylene-responsive genes ex-
pression besides affects growth and development in Arabidopsis.
J Plant Physiol, 2008, 165: 1717−1725
[23] Pré M, Atallah M, Champion A, De Vos M, Pieterse C M, Me-
melink J. The AP2/ERF domain transcription factor ORA59 in-
tegrates jasmonic acid and ethylene signals in plant defense.
Plant Physiol, 2008, 147: 1347−1357
[24] Zhang H, Yang Y, Zhang Z, Chen J, Wang X C, Huang R. Ex-
pression of the ethylene response factor gene TSRF1 enhances
abscisic acid responses during seedling development in tobacco.
Planta, 2008, 228: 777−787
[25] Xu P, Narasimhan M L, Samson T, Coca M A, Huh G H, Zhou J,
Martin G B, Hasegawa P M, Bressan R A. A nitrilase-like protein
interacts with GCC Box DNA-binding proteins involved in eth-
ylene and defense responses. Plant Physiol, 1998, 118: 867−874
[26] Koyama T, Okada T, Kitajima S, Ohme-Takagi M, Shinshi H,
Sato F. Isolation of tobacco ubiquitin-conjugating enzyme cDNA
in a yeast two-hybrid system with tobacco ERF3 as bait and its
characterization of specific interaction. J Exp Bot, 2003, 385:
1175−1181
[27] Picard D. Heat-shock protein 90, a chaperone for folding and
regulation. Cell Mol Life Sci, 2002, 59: 1640−1648
[28] Jackson S E, Queitsch C, Toft D. Hsp90: from structure to phe-
notype. Nat Struct Mol Biol, 2004, 11: 1152−1155
[29] Cao D, Froehlich J E, Zhang H, Cheng C L. The chlorate-
resistantand photomorphogenesis-defective mutant cr88 encodes
a chloroplast-targeted HSP90. Plant J, 2003, 33: 107−118
[30] Bhattarai K K, Li Q, LiuY, Dinesh-Kumar S P, Kaloshioan I. The
Mi-1-mediated pest resistance requires Hsp90 and Sgt1. Plant
Physiol, 2007, 144: 312−323
[31] Botër M, Amigues B, Peart J, Breuer C, Kadota Y, Cacais C,
Moore G, Kleanthous C, Ochsenbein F, Shirasu K, Guerois R.
Structural and functional analysis of SGT1 reveals that its inter-
action with HSP90 is required for the accumulation of Rx, an R
protein involved in plant immunity. Plant Cell, 2007, 19:
3791−3804
[32] Shirasu K. The HSP90-SGT1 chaperone complex for NLR im-
mune sensors. Annu Rev Plant Biol, 2009, 60: 139−164
[33] Hubert D A, Tornero P, Belkhadir Y, Krishna P, Takahashi A,
Shirasu K, Dangl J L. Cytosolic HSP90 associates with and
modulates the Arabidopsis RPM1 disease resistance protein.
EMBO J, 2003, 22: 5679−5689
[34] Takahashi A, Casais C, Ichimura K, Shirasu K. HSP90 interacts
with RAR1 and SGT1 and is essential for RPS2-mediated disease
resistance in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100:
11777−11782
[35] Liu Y, Burch-Smith T, Schiff M, Feng S, Dinesh-Kumar S P.
Molecular chaperone Hsp90 associates with resistance protein N
and its signaling proteins SGT1 and Rar1 to modulate an innate
immune response in plants. J Biol Chem, 2004, 279: 2101−2108
[36] Sangster T A, Queitsch C. The HSP90 chaperone complex an
emerging force in plant development and phenotypic plasticity.
Curr Opin Plant Biol, 2005, 8: 86−92
[37] Fisk D G, Walker M B, Barken A. Molecular cloning of the
maize gene crp1 reveals similarity between regulators of mito-
chondrial and chloroplast gene expression. EMBO J 1999, 18:
810 作 物 学 报 第 37卷

2621−2630
[38] Meierhoff K, Felder S, Nakamura T, Bechtold N, Schuster G.
HCF152, an Arabidopsis RNA binding pentatricopeptide repeat
protein involved in the processing of chloroplast psbB-psbT-
psbH-petB-petD RNAs. Plant Cell, 2003, 15: 1480−1495
[39] Nakamura T, Meierhoff K, Westhoff P, Schuster G. RNA-bind-
ing properties of HCF152, an Arabidopsis PPR protein involved
in the processing of chloroplast RNA. Eur J Biochem, 2003, 270:
4070−4081
[40] Manthey G M, McEwen J E. The product of the nuclear gene
PET309 is required for translation of mature mRNA and stability
or production of intron-containing RNAs derived from the mito-
chondrial COX1 locus of Saccharomyces cerevisiae. EMBO J,
1995, 14: 4031−4043
[41] Mencebo R, Zhou X, Shillinglaw W, Henzel W, Macdonald P M.
BSF binds specifically to the bicoid mRNA 3′ untranslated re-
gion and contributes to stabilization of bicoid mRNA. Mol Cell
Biol, 2001, 21: 3462−3471