全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(9): 1749−1754 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家重点基础研究发展计划 (973 计划 )前期项目 (2007CB116209), 河北省重点基础研究项目 (08965525D), 河北省自然科学基金
(C2007000476)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 肖凯, E-mail: xiaokai@hebau.edu.cn
Received(收稿日期): 2009-02-27; Accepted(接受日期): 2009-04-30.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01749
小麦应答低磷的钙依赖蛋白激酶基因 TaCPK1A和
TaCPK10的克隆和表达
路文静 2 李瑞娟 2 李小娟 2 郭程瑾 1 谷俊涛 2 肖 凯 1,*
1 河北农业大学农学院, 河北保定 071001; 2 河北农业大学生命科学学院, 河北保定 071001
摘 要: 采用构建富集磷胁迫特异表达基因 cDNA 差减文库、序列分析和 cDNA-AFLP 技术, 鉴定了 2 个应答低磷
胁迫的钙依赖蛋白激酶(CDPK)基因的表达序列标签。克隆、测序和比对结果表明, 上述基因分别为 TaCPK1A 和
TaCPK10。其 cDNA长度分别为 2 129 bp和 1 696 bp, 开放阅读框分别为 1 599 bp和 1 281 bp, 分别编码 532和 426
个氨基酸; 具有 CDPK 的典型结构特征。系统进化分析表明, 上述基因的核苷酸序列同源性低, 分别来自不同的祖
先。在对低磷胁迫的响应上, TaCPK1A在磷胁迫 1~24 h范围内根系内的表达水平不断增强, 叶内表达水平在 1 h内明
显被诱导, 以后保持稳定; TaCPK10在相应磷胁迫时间范围根叶内的表达水平均呈低—高—低变化, 在磷胁迫 1 h的
表达被诱导, 以后又逐渐降至胁迫前水平。TaCPK1A和 TaCPK10对氮、钾胁迫没有应答响应。结果表明, CDPK在介
导小麦低磷胁迫的信号转导中具有重要作用, 小麦中存在两种或多种 CDPK介导的磷酸化过程参与低磷信号的转导。
关键词: 小麦(Triticum aestivum L.); 钙依赖蛋白激酶; 克隆; 低磷胁迫; 基因表达
Cloning and Expression of Calcium-Dependent Protein Kinase Genes TaCPK1A
and TaCPK10 in Response to Deficient-Pi in Wheat
LU Wen-Jing2, LI Rui-Juan2, LI Xiao-Juan2, GUO Cheng-Jin1, GU Jun-Tao2, and XIAO Kai1,*
1 College of Agronomy, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China; 2 College of Life Science, Agricultural University of Hebei,
Baoding 071001, China
Abstract: Two expressed sequence tags (ESTs) of calcium-dependent protein kinase (CDPK) genes responding to deficient-Pi
were identified from wheat (Triticum aestivum L.) cultivar Shixin 828 by subtractive suppression cDNA library and cDNA-AFLP
approaches. The genes, TaCPK1A and TaCPK10, contained the conserved domains of plant CDPK, were 2 129 bp and 1 696 bp in
full length open reading frames of 1 599 bp and 1 281 bp, encoding 532 and 426 amino acids, respectively. Phylogenetic analysis
implied different ancestors of TaCPK1A and TaCPK10 because of their low identity of sequence. Under low-Pi condition, the
expression level of TaCPK1A in roots was strongly inducible and reached the highest at 24 h after treatment, but that in leaves was
induced in 1 h of treatment and maintained stably afterwards. The expression of TaCPK10 in roots and leaves both showed a pat-
tern of low–high–low with the peak at 1 h of treatment, and then decreased to the level before treatment. No responses of
TaCPK1A and TaCPK10 were observed to low-N and low-K stresses. Therefore, it is suggested that CDPK plays an important role
in mediating phosphate-starvation signal in wheat. There are at least two phosphorylation reaction pathways for transduction of
low-Pi signal, in which CDPKs are involved.
Keywords: Wheat (Triticum aestivum L.); Calcium-dependent protein kinase; Cloning; Low-Pi stress; Gene expression
钙不仅是植物必需的大量元素之一, 而且游离于植
物细胞质中的钙离子还是植物细胞信号转导中重要第二
信使 , 广泛介导了植物生长发育和对逆境响应的信号转
导过程。植物在正常生长发育条件下, 胞质中游离的 Ca2+
维持低水平的内稳态状况, 细胞内 Ca2+的分布表现严格
的区隔化特征。当植物或细胞感受到内部信号和外部环境
刺激时, 通过位于细胞壁、质膜和液泡等细胞器存储的钙
离子向胞质内转运, 导致细胞内的游离 Ca2+浓度发生短
暂而复杂的振荡变化 , 将信号以独特的方式向信号转导
系统的下游传递[1]。生物体中的 Ca2+信号在特定信号转导
1750 作 物 学 报 第 35卷

系统的进一步传递, 通过 Ca2+的受体蛋白、钙调素(CaM)
和钙依赖蛋白激酶 (calcium-dependent protein kinase,
CDPK)等协同完成[2]。其中, CDPK 广泛分布于植物、藻
类和一些原生生物中 , 是目前植物中研究较多的一类蛋
白激酶。其在有关植物种属 CDPK 基因的克隆和生物学
功能的研究已有较多报道[3-8]。
在普通小麦中已鉴定了 26个CDPK基因, 包括CPK1~
CPK20[3]、 CPK1A~CPK1D (GenBank 登录号分别为
DQ333375、DQ333374、DQ431850和 DQ431851)、CDPK1
(GenBank登录号为 AJ621356)[4]和一功能未知的 cDNA全
长插入克隆(基因登录号为 BT009467)。研究表明, CPK1~
CPK20 中的部分成员参与了对干旱、盐分胁迫、低温、
H2O2逆境等非生物逆境的响应和对脱落酸(ABA)、赤霉素
(GA)的应答 [3]。用离体叶片为试验材料的研究表明 ,
CDPK1 参与外源蔗糖诱导的信号转导途径的信号磷酸化
过程[4]。表明小麦中的 CDPK基因也较广泛参与了非生物
逆境和发育信号的调控过程。
作物遇到磷素供应不足时, 在形态学、生理和生化水
平上表现出明显的适应过程 , 在分子水平上是植株对低
磷逆境信号感受、信号在植株体内转导和下游相关响应基
因特异表达综合作用的结果[5]。CDPK参与低磷信号转导
的磷酸化过程 , 可能在低磷信号转导通路中具有重要作
用, 但迄今有关小麦 CDPK 基因和低磷信号转导关系的
研究还少见报道。本文对 CDPK EST 的基因克隆和应答
低磷胁迫进行了研究。
1 材料与方法
1.1 CDPK基因 EST克隆的鉴定
以磷高效小麦品种石新 828为材料, 建立富集 1、3、
6、12、24、48和 96 h各低磷处理(20 µmol L−1 Pi)时间点
混合样本特异表达基因的石新 828 根系 cDNA 差减文库
[10], 鉴定了 142个低磷处理诱导的特异表达基因, 通过对
文库中部分克隆测序和在 GenBank 的功能比对分析, 发
现一个克隆为 CDPK 基因 (克隆号为 P00-32), 采用
cDNA-AFLP 技术, 在低磷胁迫处理石新 828 的根系中获
得另一个 EST。
1.2 小麦 CDPK基因的克隆
依据 CPK1A (登录号为DQ333375)和 CPK10 (登录号
为 EU181189)的 cDNA 序列, 在低磷胁迫处理的石新 828
根系中, 采用RT-PCR技术, 克隆了上述基因的 cDNA序列。
用 TRIzol试剂(Invitrogen)提取低磷处理 3 h根系的总 RNA,
采用 AMV反转录酶(TaKaRa)进行转录本的反转录。
利用反转录产物为模板 , 以及基因特异性引物 , 扩
增 CPK1A 和 CPK10 的 cDNA。用于扩增 CPK1A 的正向
引物为 5′-GCTCGGCTGACTGGGTTGTAA-3′, 反向引物
为 5′-ATCCGTGCAGCAGCGAAAAA-3′; 用 于 扩 增
CPK10 的正向引物为 5′-GCTACACCTTCGCCGCAGTC-
3′, 反向引物为 5′-CAGCACGAAAGAAGAAGAAATAA-
3′。PCR程序为：94℃ 5 min; 94℃ 45 s, 53℃ 45 s, 72℃
2 min, 35个循环; 72℃延伸 10 min。对扩增产物克隆测序
后进行比对分析。
1.3 编码蛋白质特征分析
依据 ExPasy (http://www.expasy.org/)在线分析两个
基因的开放阅读框和编码氨基酸序列。通过 DNAStar 软
件分析得到分子量和等电点值, 依据 Martínez-Noël 等[4]的
方法鉴定 N-端可变区域、EF手型区域和潜在磷酸化位点。
1.4 同源蛋白的系统进化分析
以 cDNA 核苷酸序列为基础, 在 NCBI 网站(http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行 BLAST 同源查找, 得到其他
植物种属同源的 CDPK 基因序列。利用 DNAStar 软件建
立系统进化树。
1.5 低磷处理及基因表达的鉴定
以在低磷胁迫条件下表现为磷高效吸收和利用的磷
高效小麦品种石新 828为材料[10], 在 25℃下催芽, 选择发
芽整齐一致的种子, 摆放在与培养液面接触、孔径为 0.3
mm的不锈钢网上, 生长至三叶期, 在 1 L含磷 2 mmol L−1
的 MS 营养液中培养 12 株幼苗, 每 3 d 更换一次培养液,
气泵供气。自三叶期开始, 进行植株低磷(20 µmol L−1)处
理, 处理后 0 (对照)、1、3和 24 h取样(根和叶)。
采用 TRIzol (Invitrogen)试剂提取总 RNA。利用 AMV
反转录酶(TaKaRa)进行样本转录本的反转录。再以反转录
产物为模板, 用克隆的特异引物进行 PCR, 鉴定上述基因
在不同处理时间点的表达水平 , 各基因在相同时间点的
RT-PCR均为 3次重复。为鉴定反转录和 PCR的效率, 使
基因的转录本在对照和各处理时间点具有可比性 , 以组
成型表达基因 Tubulin的同步 RT-PCR作为内标。用于扩
增 Tubulin的正向引物为 5′-AGAACACTGTTGTAAGGCT
CAAC-3′, 反向引物为 5′-GAGCTTTACTGCCTCGAACA
TGG-3′, 20个扩增循环。
1.6 低氮和低钾处理
在进行小麦幼苗进行低磷处理的同时, 进行相同时
间点的氮、钾胁迫处理。将培养液的氮、钾由正常培养液
的 5 mmol L−1均降至 50 µmol L−1。其中, 氮源为硝酸盐和
铵盐各占一半 , 钾源为氯化钾。处理时间、取样方法及
RT-PCR方法同低磷胁迫处理。
2 结果与分析
2.1 响应低磷胁迫的小麦 CDPK基因的鉴定与克隆
本研究发现的两个 EST 克隆中, 一个特异表达基因
片段的序列与 GenBank 发布的 CPK1A (GenBank 登录号
为 DQ333375)一致(图 1), 另一个与已报道的小麦钙依赖
蛋白激酶 CPK10[3]相同(图 2), 因此将这两个 CDPKEST
对应的基因分别命名为 TaCPK1A 和 TaCPK10。RT-PCR
结果表明其大小分别为 1 721 bp和 1 419 bp (图 3)。克隆、
测序和比对结果表明二者在基因序列组成上分别与
GenBank发布的 CPK1A和已报道的 CPK10没有差异。

第 9期 路文静等: 小麦应答低磷的钙依赖蛋白激酶基因 TaCPK1A和 TaCPK10的克隆和表达 1751




图 1 以 cDNA-AFLP技术鉴定的 TaCPK1A cDNA片段
Fig. 1 cDNA fragment of TaCPK1A identified with cDNA-AFLP
1: 对照(2 mmol L−1 Pi); 2~4: 分别为 1、3和 24 h低磷(20 µmol L−1 Pi)
处理。箭头示 TaCPK1A cDNA片段。
1: control (2 mmol L−1 Pi); 2–4: 1, 3, and 24 h after deficient-Pi (20
µmol L−1) treatments, respectively. Arrow shows the cDNA fragment of
TaCPK1A.
2.2 小麦 TaCPK1A 和 TaCPK10 的编码蛋白质特征和系
统进化分析
TaCPK1A的开放阅读框为 1 599 bp, 编码 532个氨基
酸残基 , 编码蛋白的分子量为 59.4 kD, 等电点 5.52。
TaCPK10的 cDNA为开放阅读框为 1 281 bp, 编码 426个
氨基酸残基, 编码蛋白分子量为 48.2 kD, 等电点 6.84。
TaCPK1A和 TaCPK10 均含 1个 N-端可变区、4个 EF手
型基序(motif)和数量不同的磷酸化位点(图 4)。
系统进化分析表明, 依据 cDNA 序列的相似性程度
可分为 5 个亚组。其中 , TaCPK1A 与小麦 CPK1B
(DQ333374)、水稻 CDPK2 (X81394)、CDPK3 (AY271296)、
玉米CDPK (NM_001111836)、大麦CDPK cDNA (AK252858)
和短芒大麦 CDPK (DQ250026)归属于同一亚组。表明它
们的 CDPK 基因可能来自相同的祖先。TaCPK1A 与
TaCPK10 在核苷酸序列上的相似性较小(29.7%), 在进化
上两者来源于不同的祖先(图 5)。
2.3 TaCPK1A 和 TaCPK10 对磷胁迫和氮钾胁迫的应答
特征
在磷胁迫 0~24 h范围内, TaCPK1A在根系内的表达



图 2 cDNA差减文库获得的 TaCPK10 EST序列
Fig. 2 Expressed sequence tag (EST) of TaCPK10 identified from a subtractive cDNA library enriched differential expressed genes under
low-Pi condition



图 3 TaCPK1A和 TaCPK10基因的 RT-PCR鉴定
Fig. 3 Identification of TaCPK1A and TaCPK10 by RT-PCR
A: 磷胁迫处理 24 h根系总 RNA; B: TaCPK1A的 PCR扩增产物; C: TaCPK10的 PCR扩增产物。
A: total RNA from roots treated with 3 h of low-Pi; B: RT-PCR products of TaCPK1A; C: RT-PCR products of TaCPK10.
1752 作 物 学 报 第 35卷

水平随低磷胁迫时间的延长转录本数量不断增多; 其低
磷处理 1 h后叶片内转录本数量较对照明显增多, 以后至
24 h 在叶片中的表达水平保持相对稳定(图 6-A); 在相应
磷胁迫时间范围内, TaCPK10在根叶内的表达水平均呈低
-高-低变化, 表现为在磷胁迫 1 h 的表达水平明显高于对
照, 以后至 24 h 随磷胁迫时间的延长逐渐降低至胁迫前
水平(图 6-B)。这表明 CDPK在介导小麦低磷胁迫的信号
转导中具有重要作用, 且在小麦中存在两种或多种 CDPK
介导的磷酸化过程参与低磷信号的转导。在低氮条件下,
TaCPK1A和 TaCPK10在根叶中的表达水平与正常氮水平
相比没有变化 , 表明上述基因对生长介质中氮含量的变
化均不产生应答(图 6-C, D)。上述基因对介质中钾含量变
化的应答特征与对氮含量变化的应答特征相一致。
3 讨论
钙离子(Ca2+)是生物逆境和非生物逆境信号转导途
径中的广泛第二信使[5-7]。植株生育期间遭遇干旱、低温
和盐害等逆境时, 通常引发植物细胞中 Ca2+浓度振荡变
化。钙依赖蛋白激酶(CDPKs)通过感受上述逆境引发的
Ca2+信号, 将信号向下游进一步传递, 在介导植株非生物
逆境的信号转导中具有重要作用[8,11]。
迄今, 在模式植物拟南芥的基因组中已鉴定了 34 个
CDPK基因, 分布于所有 5条染色体上[12]; 在水稻和小麦
中, 分别鉴定出 29 个和 26 个 CDPK 家族成员[3,13]; 在马
铃薯[14]、葡萄[15]和烟草[16]中也鉴定了一些 CDPK 基因。
植株体内的 CDPK 基因以众多成员组成的家族形式存在,
通过各自的结构特征和功能 , 分别介导不同的内部生育
信号和外部逆境的信号转导过程[17-19]。个别基因在应答特
定非生物逆境中具有重要的作用[20-22]。转基因研究表明,
超表达水稻 CDPK基因 OsCDPK7和 OsCPK13, 通过增强
干旱、低温和盐分下游响应基因的表达, 具有明显增强转
基因植株抵御干旱、低温和盐分的能力[20-21]。在拟南芥中
超表达葡萄 CDPK基因 ACPK1, 使 ABA介导的信号转导
过程发生改变, 植株生物学产量得到明显改善[15]。
尽管有关小麦 CDPK 基因各成员可能介导的信号和调控
的下游基因通路尚不明确 , 但有证据表明 , 小麦不同的
CDPK 基因对非生物逆境和环境刺激存在着重要的应答
效应。如小麦 CPK3~CPK7、CPK12 和 CPK15 对低温信
号产生应答, CPK4、CPK9和 CPK18~CPK20对盐分胁迫
产生应答, CPK1、CPK6、CPK9和 CPK18对干旱产生应
答, CPK1、CPK2、CPK5、CPK7、CPK9、CPK10、CPK12
和 CPK18 对氧化逆境(H2O2)产生应答[3]。CDPK1 介导外
源蔗糖引发的植株体内信号转导过程[4]。研究表明, 相同
非生物逆境能引发不同的 CDPK 基因成员特异表达, 同



图 4 TaCPK1A(A)和 TaCPK10(B)的 cDNA序列和编码氨基酸序列
Fig. 4 cDNA sequences of TaCPK1A (A) and TaCPK10 (B) and their responding translated polypeptides
TaCPK1A和 TaCPK10的 N-端可变区和 4个 EF手型保守域分别用下画线标出。豆蔻酰基化基序用方框标出, 潜在磷酸化位点用星号标出。
Variable N- end domain in TaCPK1A and TaCPK10 and four conserved EF hand motifs close to the C-terminal are underlined. Myristoylation motif is
boxed. Potential Ser/Thr phosphorylation sites are marked with asterisks.

第 9期 路文静等: 小麦应答低磷的钙依赖蛋白激酶基因 TaCPK1A和 TaCPK10的克隆和表达 1753




图 5 小麦 TaCPK1A与其他植物种属同源基因及 TaCPK10的系统进化分析
Fig. 5 Phylogenetic tree analyses of TaCPK1A and other plant CDPK genes which are homologous with TaCPK1A and TaCPK10



图 6 TaCPK1A和 TaCPK10基因对低磷(A和 B)和低氮(C和 D)胁迫的应答特征
Fig. 6 Responding features of TaCPK1A and TaCPK10 to stresses of deficient-Pi (A and B) and deficient-N (C and D)
A, B: the lane of control treated with 2 mmol L−1 Pi, and other lanes treated with 20 µmol L−1 Pi; C, D: the lane of control treated with 5 mmol L−1 N,
and other lanes treated with 50 µmol L−1 N.

一 CDPK 基因也具有应答不同非生物逆境的特征, 暗示
CDPK介导的非生物逆境信号转导, 在小麦体内是一复杂
的生物学过程。
缺磷胁迫条件下, 植株在形态、生化和生理方面对低
磷胁迫产生明显的响应[22-25]。在分子水平上, 磷逆境条件
引发植株体内对低磷胁迫信号的感受、低磷信号在植株体
1754 作 物 学 报 第 35卷

内转导和启动下游相关应答基因表达等复杂的生物学过
程[9,26]。本研究表明, 在小麦种属的 CDPK基因家族成员
中 , 具有植物种属保守特征的两个小麦 CDPK 基因 ,
TaCDPK1A 和 TaCPK10, 对低磷胁迫逆境产生了明显的
应答 , 但在转录水平上应答低磷胁迫逆境的特征有所不
同。TaCPK1A 在一定低磷胁迫时间内表现为诱导增强效
应; 而 TaCPK10 表现为短期(1 h)明显诱导, 以后转录本
数量又逐渐下降, 最终基本恢复至正常供磷(2 mmol L−1
Pi)处理的水平。这表明小麦种属中的部分 CDPK成员, 以
两种或多种途径, 参与对低磷逆境信号的转导过程。有关
TaCPK1A 和 TaCPK10 介导低磷信号转导的分子机制, 如
上游作用蛋白和下游作用底物、调控的下游功能基因有待
进一步探讨。
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