全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(9): 1533−1539 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2007CB109201)和国家转基因新品种培育重大科技专项(2011ZX08012-002,
2011ZX08011-001)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 谢家建, E-mail: jjxie@ippcaas.cn; 彭于发, E-mail: yfpeng@ippcaas.cn
第一作者联系方式: E-mail: scqhengshui@126.com
Received(收稿日期): 2011-01-19; Accepted(接受日期): 2011-04-27; Published online(网络出版日期): 2011-06-28.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110628.1009.015.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01533
一种适合转基因棉CpTI和cry1A基因剂量测定的标准质粒的构建和应用
苏长青 1,2 谢家建 1,* 孙 爻 1 彭于发 1,*
1 植物病虫害生物学国家重点实验室 / 农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(北京) / 中国农业科学院植物保护研究所, 北
京 100193; 2 衡水学院生命科学系, 河北衡水 053000
摘 要: 在转基因检测领域, 标准质粒以容易获得、纯度高、成本低和稳定性好的优点逐渐被广泛应用, 适合同时检
测多个靶标基因的需求。本研究针对我国抗虫棉(Gossypium hirsutum L.)的主要外源基因类型, 构建含有豇豆胰蛋白
酶抑制剂基因(CpTI)、苏云金杆菌晶体杀虫蛋白基因(cry1A)和棉花内标准基因硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶基因
(Sad1)的多靶标质粒 pMD-CCS 作为标准物质, 建立了 CpTI 和 cry1A 基因的实时荧光定量 PCR 方法。测定了我国 9
个抗虫棉品种中的 CpTI和 cry1A基因剂量, 显示科棉 3号等 3个抗虫棉品种中 CpTI基因的平均剂量为 0.020~0.018
拷贝/基因组, cry1A基因的平均剂量为 1.377~2.136拷贝/基因组; 鄂杂棉 1号 F1等 6个抗虫棉品种中 cry1A基因的平
均剂量为 0.887~2.564拷贝/基因组, 定量结果的标准差(SD)范围在 0.001~0.149之间。结果说明, pMD-CCS适合作为
标准物质用于抗虫棉中 CpTI和 cry1A基因的定量测定。
关键词: 抗虫棉; CpTI基因; cry1A基因; 基因特异性实时 PCR; 标准质粒
Construction and Application of a Reference Plasmid Suitable for Determina-
tion of CpTI and cry1A Gene Dosages in Genetically Modified Cottons
SU Chang-Qing1,2, XIE Jia-Jian1,*, SUN Yao1, and PENG Yu-Fa1,*
1 State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests / Institute of Plant Protection, China Inspection Test Center for Environmental
Safety of Transgenic Crops, Ministry of Agriculture / Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2 Department of Life Sci-
ence, Hengshui College in Hebei, Hengshui 053000, China
Abstract: In transgenic detection field, a preferable reference material (RM) has been developing with the advantage of easy
availability, high purity, low cost and good stability, which is more suitable for detecting multiple target genes. In the present study,
we constructed a multi-target reference plasmid named pMD-CCS containing cowpea trypsin inhibitor (CpTI) and Bacillus thur-
ingiensis insecticidal crystal protein (cry1A) and cotton endogenous gene Stearoyl-acyl carrier protein desaturase (Sad1) se-
quences targeting the key exogenous gene types of the insect resistant cotton varieties (Gossypium hirsutum L.) in China. The
real-time quantitative PCR methods for CpTI and cry1A were established using pMD-CCS as the RM. The dosages of CpTI and
cry1A from nine insect resistant cotton varieties were determined. The average CpTI dosages were 0.020–0.018 copies/genome
and the average cry1A dosages were 1.377–2.136 copies/genome in three insect resistant cotton varieties including Kemian3. The
average cry1A dosages were 0.887–2.564 copies/genome in six ones including Ezamian1-F1. The standard deviations (SD) of the
quantitative measurement ranged from 0.001–0.149. The above results demonstrated that pMD-CCS could be used as the RM for
the quantitative measurement of CpTI and cry1A genes in insect resistant cotton varieties.
Keywords: Insect resistant cotton; CpTI gene; cry1A gene; Gene-specific real-time PCR; Reference plasmid
1534 作 物 学 报 第 37卷

转基因棉花是我国首个大面积商业化种植的转
基因作物, 在全球的种植面积仅次于转基因大豆和
玉米, 具耐除草剂和抗虫等主要性状[1]。我国的转基
因抗虫棉研究技术处于国际领先水平。Guo 等[2]利
用农杆菌介导法和花粉管通道法将Bt杀虫蛋白基因
cry1A 导入棉花获得具有自主知识产权的转基因抗
虫棉国抗系列。为了有效应对靶标害虫对抗虫棉的
适应并产生抗性的问题, Guo 等[3-4]又将豇豆胰蛋白
酶抑制基因 CpTI和 cry1A成功导入棉花育成转双价
基因(CpTI+cry1A)抗虫棉 SGK 系列。目前, 在我国
生产上应用的国产抗虫棉, 以国抗系列和 SGK系列
为主。除此之外, 美国孟山都公司研发的转 cry1A
单价抗虫棉品系 MON531(新棉 33B)在我国也有一
定的市场份额[5-6]。
随着转基因技术的迅速发展, 越来越多的转化
事件不断出现。特别是我国转基因抗虫棉品种繁多、
来源广泛, 许多品种背景不明, 且根据本实验室对
市场抗虫棉品种追踪研究, 尚存在种子混杂的现象,
因此非常有必要建立一种抗虫基因的高特异性、高
通量、快速定量的方法。现在实时荧光定量 PCR方
法为首选方法[7]。标准物质是建立定量方法的关键。
由于阳性植物标准品不容易大量获得, 制备又较困
难 , 成本也高 , 因此 , 标准质粒成为一种受欢迎的
替代品 , 它的优点是容易获得 , 纯度高 , 而且根据
需要可以将多个靶标序列构建到一个标准质粒中建
立多靶标标准分子, 经济高效, 已经成功应用于转
基因大豆、棉花和玉米等的定量检测[8-12]。
本研究根据我国抗虫棉的主要外源基因类型 ,
构建一种含有外源 CpTI、cry1A 基因和棉花内标准
基因 Sad1序列的标准质粒作为标准物质, 建立了基
于两个外源基因的实时荧光定量检测方法, 以期实
现对混合样品中 2 个外源基因剂量的测定, 为我国
抗虫棉的种子鉴别、谱系筛查等提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 供试材料和 DNA提取
转基因棉花材料购自江苏、甘肃和安徽省的种
子市场。经本实验室使用常规 PCR 进行 CpTI 和
cry1A 基因筛查, 选取 3 个含 cry1A 和 CpTI 基因的
棉花(Gossypium hirsutum L.)品种科棉 3号、苏杂棉
66和科棉 6号以及 6个转 cry1A基因抗虫棉品种鄂
杂棉 1号 F1、湘丰棉 3号、南农优 3号、升金棉 10
号、新陆早 33 和皖棉 13 作为研究材料。采用植物
基因组提取试剂盒提取棉花基因组 DNA。
1.2 主要试剂和仪器
rTaq DNA聚合酶、2×Taq Man Realtime PCR
Master mix、克隆载体 pMD20-T购自大连宝生物公
司(TaKaRa); 大肠杆菌(Escherichia coli)菌株 JM110
于本实验室保存。植物基因组提取试剂盒购自北京
天根生物技术公司, 质粒DNA提取试剂盒购自杭州
爱思进生物技术公司。荧光定量反应在 ABI PRISM
7500荧光定量 PCR仪(Applied Biosystems, USA)上
进行。
1.3 引物和探针设计
根据 CpTI (GenBank 登录号为 DQ417204)和
cry1A (GenBank登录号为 EU816953)基因序列使用
Primer Express 软件(ABI, 美国)设计 CpTI-F/CpTI-
R、CpCry-F/cry1A-R、CpTI-QF/CpTI-QR、cry1A-QF/
cry1A-QR4个引物对和 CpTI-QP、cry1A-QP两个荧
光探针。参考 Yang 等[13]设计 CrySad-F/Sad1-2R 和
cry1A-QF/cry1A-QR 引物对和荧光探针 Sad1-p。由
北京三博远志生物技术公司合成引物, 由上海英骏
生物技术公司合成探针, 5′端标记 FAM荧光基团, 3′
端标记 BHQ1荧光猝灭基团(表 1)。
1.4 标准质粒构建
采用重叠 PCR 方法经过 3 轮 PCR 扩增获得含
有 CpTI、cry1A基因序列和棉花内标基因 Sad1序列
的克隆片段。第 1 轮 PCR 使用 CpTI-F/CpTI-R,
CpCry-F/cry1A-R 和 CrySad-F/sad1-2R 引物对扩增
科棉 3号基因组 DNA分别获得 257、322和 128 bp
的扩增片段 cp、cry 和 sad; 第 2 轮 PCR 使用
CpTI-F/cry1A–R, 以 cp和 cry为模板获得 559 bp的
扩增连接片段 cp-cry; 第 3 轮 PCR 使用 CpTI-F/sad
1-2R以 cp-cry和 sad为模板获得 666 bp的 cp-cry-sad
连接片段。
扩增反应体系为 50 μL, 包含 2 μL 基因组
DNA、5 μL 10×PCR缓冲液、2.5 mmol L–1 dNTPs、
4 μL 10 μmol L–1上下游引物各 2 μL、5 U Taq聚合
酶 0.25 μL、纯水 34.75 μL。反应条件为 94℃变性 4 min;
进行 35次循环扩增反应(94℃变性 30 s, 55℃退火 30 s,
72℃延伸 30 s或 1 min), 最后 72℃延伸 7 min。
将重组片段回收、纯化后克隆到 pMD20-T载体
中, 通过测序验证克隆序列的正确性。提取鉴定好
的质粒 DNA, 用 0.8%凝胶电泳和分光光度计检测
完整性、浓度和纯度。根据质粒质量和分子量计算
出每微升质粒 DNA 的拷贝数。用纯水将质粒 DNA
第 9期 苏长青等: 一种适合转基因棉 CpTI和 cry1A基因剂量测定的标准质粒的构建和应用 1535


表 1 本研究使用的引物和探针
Table 1 Primers and probes in this study
目的
Objective
靶标序列
Target sequence
引物/探针
Primer/probe
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
扩增长度
Length (bp)
CpTI-F GATTTGAACCACCTCGGAAG CpTI
CpTI-R CTCATCATCTTCATCCCTGG
257
CpCry-F CCAGGGATGAAGATGATGAG GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC
cry1A
cry1A -R CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT
321
CrySad-F ACGACCTTACTAGGCTGATCG CCAAAGGAGGTGCCTGTTCA
标准质粒构建
Construction of standard plasmid
Sad1
sad1-2R TTGAGGTGAGTCAGAATGTTGTTC
128
sad1-1F CCAAAGGAGGTGCCTGTTCA
sad1-2R TTGAGGTGAGTCAGAATGTTGTTC
Sad1
sad1-p TCACCCACTCCATGCCGCCTCACA
107
CpTI-QF CTCAAGCGATGAACCTTCTGAGT
CpTI-QR CACCTGATATCTGTACAATGGCATT
CpTI
CpTI-QP TTCAGAACCATGCTGCGATTCATGCA
99
cry1A-QF CCGTGTACGTTCAAGCAGCTAA
cry1A-QR CCCACCTTTGCCCAAACA
基因特异性实时 PCR
Gene-specific real-time PCR
cry1A
cry1A -QP CTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACG
62

分别稀释到 5×106~5×102拷贝 μL–1。拷贝数=(质量/
分子量) ×6.0×1023。
1.5 转基因棉花中 CpTI 和 cry1A 基因剂量的测
定
1.5.1 CpTI 基因的测定 分别以 5 个浓度梯度
(107~103拷贝)的标准质粒作为模板, 应用棉花 Sad1
基因特异性定量引物 Sad1-1F/Sad1-2R 和探针
Sad1-p 以及 CpTI 基因特异性定量引物 CpTI-QF/
CpTI-QR和探针 CpTI-QP建立基于 Sad1和 CpTI两
个靶标序列的实时荧光定量 PCR标准曲线。应用建
立的 2个标准曲线, 分别以科棉 3号、苏杂棉 66和
科棉 6 号基因组 DNA 为模板, 测定 3 个样品 DNA
中的 Sad1基因和 CpTI基因拷贝数。
考虑到采用的棉花内标基因 Sad1 是两个拷贝
(单倍体基因组), 而陆地棉基因组是四倍体 [14], 故
Sad1 基因总的拷贝数是 8。外源基因剂量 copies/
genome = (样品外源基因拷贝数×8)/(样品 Sad1基因
拷贝数)
1.5.2 cry1A基因的测定 应用棉花 Sad1基因特
异性定量引物 Sad1-1F/Sad1-2R 和探针 Sad1-p 以及
cry1A 基因特异性定量引物 cry1A-QF/cry1A-QR 和
荧光探针 cry1A-QP 建立基于 Sad1 基因和 cry1A 基
因的 2 个定量标准曲线。然后应用建立的标准曲线
对所有 9个含 cry1A基因的棉花基因组 DNA剂量进
行测定。标准曲线建立、基因拷贝数测定和基因剂
量计算与 CpTI基因相同。
1.5.3 定量条件 反应体系为 20 μL, 包括 2 μL
模板(质粒 DNA 或棉花基因组 DNA), 50×Rox Ref-
erence Dye 0.4 μL, 2×Taq Man Realtime PCR Master
mix 10 μL, 10 μmol L–1上下游引物各 2 μL, 10 μmol
L–1荧光探针 1 μL, 纯水 4.6 μL。反应的程序为 95 ℃
5 s, 1个循环; 95 5 s, 60 30 s, 45℃ ℃ 个循环; 在 60℃
时收集荧光信号。
2 结果与分析
2.1 CpTI、cry1A和 Sad 1多靶标标准质粒的构
建
通过重叠 PCR成功构建了含有 CpTI、cry1A和
Sad 1 3个靶标序列的标准质粒 pMD-CCS。重组片
段序列和标准质粒图谱见图 1。
2.2 CpTI、cry1A基因特异性定量方法的建立
以 107~103拷贝的标准质粒 pMD-CCS为模板建
1536 作 物 学 报 第 37卷


图 1 标准质粒 pMD-CCS的插入核苷酸序列及结构
Fig. 1 Nucleotide sequence and construction of the reference plasmid pMD-CCS
小写字母表示 CpTI序列; 大写字母表示 cry1A序列; 斜体表示 Sad1序列。
Lowercase letters indicate CpTI sequence; capital letters indicate cry1A sequence; italic letters indicate Sad1 sequence.


立了基于 Sad 1、CpTI和 cry1A 3个靶标序列的标准
曲线。棉花内标准基因 Sad1 作为定量的内参照。3
个标准曲线的相关系数(R2)分别为 0.9963、0.9974
和 0.9965, 表明起始模板拷贝数和荧光阈值(Ct)值
之间具有良好的线性关系。PCR 扩增效率(E)分别为
1.0797、1.0584和 1.0286, 均接近 1 (图 2)。目前, 国
际上关于转基因定量方法的相关要求是满足–3.1≥
slope≥–3.6; R2≥0.98; 120%≥E≥80%[15], 本研究建
立的 3个基因的标准曲线均完全符合这个要求, 可以
用于转基因棉花中外源CpTI和cry1A基因的定量检测。
2.3 CpTI和 cry1A基因剂量的测定
应用建立的 3 个标准曲线对我国 3 个含 CpTI
和 cry1A 基因的抗虫棉(科棉 3 号、苏杂棉 66 和科
棉 6 号)和 6 个含 cry1A 基因的抗虫棉(鄂杂棉 1 号
F1、湘丰棉 3号、南农优 3号、升金棉 10号、新陆
早 33和皖棉 13)测定的结果如表 2和表 3所示。其
中, 科棉 3号等 3个抗虫棉样品中 cry1A基因的平均
剂量分别为 1.377、2.136和 2.070拷贝/基因组, CpTI
基因的平均剂量分别为 0.020、0.016 和 0.018 拷贝/
基因组, 鄂杂棉 1 号 F1等 6 个抗虫棉样品中 cry1A
基因的平均剂量在 0.887~2.564 拷贝/基因组之间,
含量最高的是湘丰棉 3 号, 含量最低的是南农优 3
号。对上述定量结果进行统计分析的标准差(SD)范
围在 0.001~0.149 之间, 测定结果之间的偏差较小,
说明该方法可以可靠地用于 2 个靶标基因的定量测
定。
3 讨论
研究表明, 外源基因的拷贝数与其表达量和遗
传稳定性有着密切的关系, 外源基因低拷贝整合可
以高水平表达, 高拷贝可以导致外源基因低水平表
达甚至基因沉默[16-17], 因此确定外源基因拷贝数对
转基因作物的选择和应用至关重要。确定外源基因
拷贝数的传统方法是 Southern 杂交[18], 虽然这种方
第 9期 苏长青等: 一种适合转基因棉 CpTI和 cry1A基因剂量测定的标准质粒的构建和应用 1537



图 2 pMD-CCS作为标准物质的基因特异性定量方法的扩增曲
线和标准曲线
Fig. 2 Amplification plots and standard curves of the
gene-specific quantitative PCR assays using pMD-CCS as the
RM
A: Sad1基因; B: CpTI基因; C: cry1A基因。
A: Sad1 gene; B: cry1A gene; C: CpTI gene.

法比较直观, 但是成本高、费时、费力, 需要大量基
因组 DNA。而实时荧光定量 PCR 技术实现了在整
个 PCR扩增过程中对扩增产物的实时监测, 具特异
强, 重复性好, 灵敏度高、高通量等优点, 被广泛应
用于各个领域, 包括基因拷贝数的测定以及基因表
达的定量分析等[19-22]。其中, Yang等[21]应用实时荧
光定量 PCR 方法以转化载体 pCAMBIA 1301 质粒
DNA作为标准, 测定了转基因水稻植株中 β-葡萄糖
苷酸酶 (GUS)和潮霉素 (HPT)基因拷贝数 , 并与
Southern 杂交检测结果比较, 证实两种方法的结果
是一致的。
CpTI和 cry1A基因是我国抗虫棉的 2个主要的
抗虫基因类型。从基因水平分析抗虫棉品种是鉴定
其质量的一个重要内容。而我国转基因棉花育种单
位众多, 水平参差不齐, 在一定程度上存在基因混
杂、品种不纯等现象。通过分析抗虫基因在品种中
的平均整合数量是从整体上评价该品种抗虫质量的
一种有效方法。Yang等 [ 9 ]建立了我国抗虫棉品系
SGK321 基于 CpTI 和 cry1Ac 两个外源基因的定性
PCR 方法, 但并没有对我国其他棉花品种进行定性
和定量分析。考虑到我国转基因棉花品种中可能含
有多个转化事件, 而且单粒种子间还存在纯合或杂
合等不纯的现象, 因此很难通过 Southern 杂交来测
定目的基因在基因组中的平均拷贝数。与此相似 ,
转基因产品生产、销售过程, 需要标识转基因含量。
转基因含量一般以标准质粒或纯合材料的 DNA 为
标准建立的定量 PCR方法来测定的[23-25]。随着转基
因品种的不断增多, 同时检测多靶标的标准质粒分
子应用越来越多[9-10]。本研究成功构建了含有 CpTI
和 cry1A两个靶标序列和 Sad1内标准基因序列的标
准质粒 pMD-CCS, 建立了能对混合样品 DNA 中
CpTI和 cry1A基因剂量(拷贝数/基因组)准确定量的
实时荧光定量 PCR方法, 5个浓度梯度(107~103拷贝)
之间的相关系数接近 1, PCR扩增效率也接近 1, 说
明在此浓度区间定量具有良好的线性关系。和基因
组 DNA 作为标准物质比较[24-25], 相关系数和 PCR
扩增效率值均接近。从对我国 9 种转基因棉花的定
量检测结果看, cry1A基因剂量在 1~2拷贝/基因组左
右 , 说明 cry1A 比较稳定地整合到棉花基因组上 ,
但品种间还存在一定差异。而检测的几个品种中
CpTI 基因的剂量较低, 推测可能是由于这几个品种
中仅含有少量携带 CpTI基因的种子。我们进一步对
其中一个品种进行单粒种子的检测, 通过 CpTI基因
常规定性 PCR检测表明, 在随机抽取的 30粒种子中
仅有 1 粒检测为阳性, 这也证实我们的推断, 表明
我们建立的定量检测方法是可靠的。
4 结论
以构建的含有 cry1A基因、CpTI基因和棉花内
标准 Sad1 基因的重组质粒为标准物质建立了
Taqman 实时荧光定量 PCR 方法, 实现了对棉花样
品中 cry1A和 CpTI基因剂量的高通量、快速和低成
本的测定, 在我国转基因棉花的目的基因分析中具
有一定的应用价值。


1538 作 物 学 报 第 37卷

表 2 9个抗虫棉样品中 cry1A基因剂量的测定
Table 2 Quantification of the cry1A dosages in nine insect resistant cotton samples
样品名称
Sample name
Sad1 cry1A 基因剂量(拷贝数/基因组)
Dosage (copies/genome)
平均值
Average value
SD
1701900 286333 1.346
1772030 286751 1.295
科棉 3号
Kemian 3
1693110 315544 1.491
1.377 0.103
702702 180964 2.060
721412 183916 2.040
苏杂棉 66
Suzamian 66
675920 194929 2.307
2.136 0.149
665244 174346 2.097
664879 176000 2.118
科棉 6号
Kemian 6
709695 176994 1.995
2.070 0.066
293064 52655 1.437
285715 56873 1.592
鄂杂棉 1号 F1
Ezamian 1-F1
303068 63677 1.681
1.570 0.089
318537 98526 2.474
323735 106705 2.637
湘丰棉 3号
Xiangfengmian 3
331622 107027 2.582
2.564 0.083
76214 9047 0.950
80821 8799 0.871
南农优 3号
Nannongyou 3
78439 8232 0.840
0.887 0.057
426655 103986 1.950
433960 106082 1.956
升金棉 10号
Shengjinmian 10
454515 107308 1.889
1.932 0.037
113109 16115 1.140
112203 15485 1.104
新陆早 33
Xinluzao 33
114104 13945 0.978
1.074 0.085
176808 27965 1.265
182097 27106 1.191
皖棉 13
Wanmian 13
169046 29004 1.373
1.276 0.092

表 3 3个抗虫棉样品中 CpTI基因剂量的测定
Table 3 Quantification of the CpTI dosages in three insect resistant cotton samples
样品名称
Sample name
Sad1 CpTI 基因剂量(拷贝数/基因组)
Dosage (copies/genome)
平均值
Average value
SD
1701900 4189 0.020
1772030 3950 0.018
科棉 3号
Kemian 3
1693110 4323 0.020
0.020 0.001
702702 1424 0.016
721412 1375 0.015
苏杂棉 66
Suzamian 66
675920 1412 0.017
0.016 0.001
665244 1488 0.018
664879 1610 0.019
科棉 6号
Kemian 6
709695 1403 0.016
0.018 0.002

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