全 文 ：Vol. 30 , No. 1
pp. 6～10 　Jan. , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 1 期
2004 年 1 月 　6～10 页
转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花中抗虫基因及其抗虫性的遗传稳定性
刘　志1 　郭旺珍1 　朱协飞1 　朱　祯2 　张天真1 , Ξ
(1 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 ,江苏南京 210095 ; 2中国科学院遗传发育研究所 ,北京 100101)
摘 　要 　采用 PCR 和 PCR2Southern 跟踪检测 , Bt 和 GNA 两个抗虫基因在转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花 TL1 的 3 个连续
世代均稳定存在 ,完全连锁遗传 ;室内棉铃虫生物测定表明 ,该转基因植株的 3 个世代都高抗棉铃虫 ,各世代之间抗性水
平一致 ,没有显著性差异 ;温室蚜虫抗性试验显示 3 个世代均对蚜虫具有较好的抑制作用 ,且抑制效果相当。因而 ,两个
抗虫基因在转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花 TL1 中能稳定地遗传和表达。
关键词 　转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花 ;抗虫基因 ;抗虫性 ;遗传和表达 ;稳定性
中图分类号 : S562
Stable Inheritance and Expression of Bt and GNA Resistance Genes in Transgenic
Cotton Line
LIU Zhi1 , GUO Wang2Zhen1 , ZHU Xie2Fei1 , ZHU Zhen2 , ZHANG Tian2Zhen1 3
(1 National Key Laboratory of Crop Genetics & Germplasm Enhancement , Nanjing Agricultural University , Nanjing 210095 , Jiangsu ; 2 Genetics and Developmental
Biology Institute , Chinese Academy of Sciences , Beijing 100101 , China)
Abstract 　Elite cotton cultivar Sumian16 was transformed with p7RPSBK2mGNA2npt Ⅱcontaining Bt [ CryIA ( c) ] , Ga2
lanthus nivalis agglutinin ( GNA) resistance genes and npt Ⅱselection gene via the pollen tube pathway method , and two
fertile transgenic Bt + GNA plants were obtained. The integration and expression of the Bt and GNA genes were confirmed
by Southern blotting and insect bioassays. In the present study , we found that the Bt and GNA genes were co2segregated
and stably inherited in TL1 transgenic Bt + GNA cotton line monitored by PCR and PCR2Southern analyses for three succes2
sive generations. Bollworm bioassays in the laboratory showed no statistical difference in resistant level among the three gen2
erations of the transgenic line which showed high resistance against bollworm larvae ( Helicoverpa armigera) , and all the
plants during the seedling stage had approximately inhibition effect on the development of aphid populations identified by
aphid bioassays in the greenhouse.
Key words 　Transgenic Bt + GNA cotton line ; Resistance genes ; Insect resistance ; Inheritance and expression ; Stability
　　外源基因在转基因植物中遗传和表达的稳定
性 ,直接关系到转基因材料的应用前景。一般来说 ,
无论采用哪种遗传转化方法获得的转基因植物 ,整
合到植物基因组中的外源基因与常规杂交育种转育
目标基因一样 ,能稳定地通过有性繁殖过程遗传给
后代 ,并能进行稳定的表达[1 ,2 ] 。Fearing 等[1 ]定量研
究了转 Bt ( Bacillus thuringiensis) 基因玉米中毒蛋白
的表达量 ,结果表明 CryIA ( b) 基因在转基因植株的
连续世代之间稳定表达 ;Maqbool 等[3 ] 通过 Western
blot 分析表明 ,在转 cry1Ac + cry2A + GNA ( Galanthus
Navies Agglutinin)三价基因的水稻中 ,这 3 个抗虫基
因表现为单个显性基因的遗传方式 ,一起遗传给下
一代并都能稳定地表达。采用棉铃虫室内生物测定
方法对转 Bt + CpTI (Cowpea Trypsin Inhibior) 双价抗
虫基因棉花 4 个连续世代的棉铃虫抗性进行了检
测 ,结果表明 4 个世代在棉花的不同生育时期都对
棉铃虫具有较高的抗性 ,且各世代抗性水平相近 ,可
见该转基因抗虫棉对棉铃虫的抗性能在各世代之间Ξ基金项目 :国家 863 计划项目资助 (2001AA212021) 。
作者简介 :刘志 (1974 - ) ,男 ,博士。研究方向 :植物分子育种。3 通讯作者 :张天真。
Received(收稿日期) :2002208209 ,Accepted (接受日期) : 2003201224.

稳定地遗传和表达[4 ] 。我们已经通过花粉管通道法
获得了高抗棉铃虫并对棉蚜有较好抑制效果的转
Bt + GNA 双价基因抗虫棉花 ,而且它们中的抗虫基
因及其对棉铃虫的抗性均表现为单个显性基因的经
典Mendel 遗传方式 (另文发表) 。本研究以其中的
转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花植株 TL1 及其 3 个
连续世代为材料 ,研究了抗虫基因的遗传和表达的
稳定性情况 ,为该新型多价转基因抗虫棉花的育种
利用提供理论和实践上的指导。
1 　材料与方法
1. 1 　材料
1. 1. 1 　植物材料
　　转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花 TL1 当代植株
(T0 ,温室保存) 及其自交一代中鉴定出的抗卡那霉
素和棉铃虫的植株 ( T1 ) 、自交二代中纯合的抗虫株
系 (T2 )和自交 3 代纯合抗虫株系 (T3 ) 。
转 Bt 基因抗虫棉花稳定纯合品系“山西 942
24”[5 ]为抗虫对照 ,常规推广品种“苏棉 16”(转 Bt +
GNA 双价基因抗虫棉花的受体亲本)为感虫对照。
1. 1. 2 　生物测试的昆虫
试验中所使用的棉铃虫幼虫是由江苏农业科学
院植物保护研究所束春娥研究员提供 ,是对 Bt 毒蛋
白敏感的棉铃虫品系。
接种用的蚜虫为棉蚜 ( Aphis gossypii Glover) 。温
室蚜虫抗性试验使用的棉蚜 ,采自在温室中盆栽的
对蚜虫敏感的品种苏棉 12 和苏棉 16 上自然发生的
蚜虫。
1. 1. 3 　生化试剂
酶和常规化学试剂购自上海 Sangon 公司 , PCR
引物也由该公司合成 ;α232 P dCTP 购自北京亚辉医
药生物工程公司 ;探针标记试剂盒是 Promega 公司
产品。
1. 2 　方法
1. 2. 1 　棉花叶片 DNA 的提取及 PCR、PCR2Southern
分析
棉花叶片 DNA 的提取和纯化 :取 1 g 幼嫩的棉
花叶片 , 参照 Paterson 等[6 ] 的 CTAB 法提取和纯化
DNA。
PCR 检测 :取 50～100 ng 待测棉株的 DNA 作模
板 ,用 Bt 和 GNA 基因的特异性引物进行 PCR 扩增。
Bt 基因扩增引物序列 :正向引物 5′2GGGCCCGCT2
GAATCCAACTGGAGAGGC23′, 反向引物 5′2CCATA2
CAACTGCTTGAGTAACCCAGAAGTTG23′; GNA 基因扩
增 引 物 序 列 : 正 向 引 物 5′2CAAAATGGCTAAG2
GCAAGTC23′, 反 向 引 物 5′2CGGTCATTACTTT2
GCCGTCA 23′。PCR 反应条件 : 95 ℃预变性 2 min ;
94 ℃30 s , 57 ℃90 s , 72 ℃90 s 共 30 循环 ;72 ℃最后
延伸 10 min。1. 4 %琼脂凝胶电泳 ,EB 染色 ,UV 检测。
PCR2Southern 分析 :以表达载体质粒 DNA 为模
板 ,用 Bt 和 GNA 基因的 PCR 扩增产物回收、纯化后
作探针 ,按 Promega 公司 Prime2a2gene ○R Labeling Sys2
tem 上的方法进行同位素探针的标记 ,Southern blot
参照 Sambrook 等[7 ]的方法进行。
1. 2. 2 　棉铃虫和蚜虫的生物测试
棉铃虫生物测试 :2001 年在南京农业大学江浦
农场试验基地种植转 Bt + GNA 双价基因棉花 TL1
的 T1 、T2 和 T3 代植株和山西 94224、苏棉 16 各 50
株 ,分别在棉花苗期 (5 月下旬) 、蕾期 (6 月中旬) 、开
花期 (7 月中旬) 和结铃期 (8 月中旬) 测定棉株主茎
嫩叶 (倒数第 2 或者第 3 片平展叶)对棉铃虫初孵幼
虫的抗性 ,每材料测定 15 株。按 Tang 等[5 ] 的方法
进行棉铃虫的生物测定。
温室蚜虫生物测定 :2002 年 2 月 28 日同时播种
山西 94224、苏棉 16 和 TL1 的 T0 收获的自交种 ,抗
虫性纯合的 T2 、T3 代株系种子。出苗后待子叶展平
时 ,分别移栽 10 株棉苗于 5 个花盆中 ,每个花盆 2
株 ,而 TL1 的 T0 自交种在出现真叶后先用卡那霉素
沾叶法鉴定[8 ] ,拔除感卡那霉素的棉苗后再移栽。
接蚜虫时拔除另一株棉株 ,每盆只留 1 株。4 月 6
日 (棉苗均有 4～5 片真叶) 进行转基因棉花不同世
代对蚜虫的抗性测定试验 ,每株接 5 头 1～2 龄若
蚜 ,每材料 5 重复 ,每隔 1 天统计每株棉株上的蚜虫
数量 ,直到接种后 15 d。以最后 1 天的蚜虫数 ,按下
列公式统计对蚜虫的抑制率 : [ (非转基因植株上的
蚜虫数量 - 转基因棉花植株上蚜虫的数量)Π非转基
因植株上的蚜虫数量 ] ×100 %。
2 　结果与分析
2. 1 　转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花中抗虫基因
的遗传稳定性
分别用 Bt 和 GNA 基因的引物对转 Bt + GNA 双
价基因抗虫棉花的基因组 DNA 进行 PCR 扩增 ,在 4
个连续世代均能扩增出分别为 938 bp 和 484 bp 的
目的基因特异片段 (图 1) ;以 Bt 和 GNA 基因特异片
段为探针的 PCR - Southern 结果进一步表明 (图 2) ,
7　1 期 刘 　志等 :转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花中抗虫基因及其抗虫性的遗传稳定性 　　　

Bt 和 GNA 基因都存在于转 Bt + GNA 双价基因抗虫
棉花 TL1 的 4 个连续世代植株基因组中。可见 ,外
源抗虫基因 Bt 和 GNA 基因能够在转基因棉花的不
同世代稳定地遗传。
2. 2 　转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花不同世代抗
虫性的遗传稳定性
2. 2. 1 　转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花不同世代对
棉铃虫的抗性表现
转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花 TL1 的 T1 、T2 、
T3 三个不同世代在苗期、蕾期、开花期和结铃期的
棉铃虫抗性检测结果表明 : TL1 的 3 个连续世代在
棉花的不同生长发育时期对棉铃虫都有较高的抗
性 ,它们在相同生育期的棉铃虫死亡率 (图 3) 、叶片
危害级别 (图 4) 都相当 ,没有显著性差异 ( P >
0105) ,而且在 5 d 后棉铃虫幼虫均没有发育成 3 龄
幼虫 ;但对照苏棉 16 号在苗期、蕾期、开花期和结铃
期的棉铃虫死亡率分别仅为 1412 %、714 %、912 %、
1114 % ,叶片危害级别都在 3 级以上 ,3 龄幼虫在存
活幼虫中所占的比例分别高达 83148 %、7213 %、
81167 %和 78145 %。这说明转 Bt + GNA 双价基因
抗虫棉花 TL1 的 3 个连续世代都表现出对棉铃虫的
抗性 ,而且各世代的抗性水平相近 ,即 TL1 对棉铃虫
的抗性在不同世代间能够稳定地遗传。
2. 2. 2 　转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花不同世代对
蚜虫的抑制效果
温室在棉花苗期 (4～5片真叶期) 进行的蚜虫
图 1 转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花 TL1 不同世代的外源抗虫基因 PCR分析结果
Fig. 1 PCR analyses of the resistance genes in successive generations in transgenic Bt + GNA cotton
A : Bt gene ; B : GNA gene
1 ,2 ,4 and 5 standing for T0 ,T1 ,T2 ,T3 transgenic cotton , respectively ; 3 , 6 and M for Sumian 16 , expression vector and DNA ladder
图 2 转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花 TL1 不同世代目的基因的 PCR2southern 结果
Fig. 2 PCR2Southern analyses of the resistance genes in successive generations in transgenic Bt + GNA cotton
A : Bt 基因特异探针 ; B : GNA 基因特异探针
1 ,2 ,3 ,4 ,5 , and 6 standing for Sumian16 , T0 ,T1 ,T2 ,T3 and expression vector , respectively
8 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

图 3 转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花不同世代对棉铃虫的抗性表现(棉铃虫死亡率)
Fig. 3 Resistance of transgenic Bt + GNA cotton in successive generations to boll worm larva ( percentage of mortality)
图 4 转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花不同世代对棉铃虫的抗性表现(叶片危害级别)
Fig. 4 Resistance of tansgenic Bt + GNA cotton in successive generations to boll worm larva ( leaf damage index)
图 5 转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花 TL1 不同世代在苗期对蚜虫的抑制效果
Fig. 5 Aphid population on the transgenic Bt + GNA cotton plants in successive generations
抗性试验结果表明 (图 5) ,转 Bt + GNA 双价基因抗
虫棉花 TL1 的 T1 、T2 和 T3 三个连续世代植株对棉
蚜虫口密度具有明显的抑制效果。接蚜虫 14 d 后 ,
统计结果表明 TL1 的 T1 、T2 和 T3 植株能抑制蚜口
密度分别平均为 47. 99 %、50. 31 %和 48. 46 % ,各世
代之间的对蚜虫的抑制效果相似 ,没有显著差异。
从棉株上的蚜虫数量增长动态来看 ,TL1 的 T1 、T2 和
T3 的植株上的蚜虫群体数量与对照材料山西 94224
9　1 期 刘 　志等 :转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花中抗虫基因及其抗虫性的遗传稳定性 　　　

和苏棉 16 在接种 6 d 后才开始表现出差异 ,增长速
度比对照明显要慢 ,但不同世代之间的蚜虫群体增
长动态一致。接种 14 d 后试验完成时 ,TL1 的 T1 、T2
和 T3 植株平均受蚜虫危害级别均为 Ⅱ级 ;而山西
94224 和苏棉 16 棉株上危害最严重的叶片卷曲呈瓢
形 ,少数呈球形 ,平均危害级别为 Ⅲ级。可见 ,转 Bt
+ GNA 双价基因抗虫棉花 TL1 的 3 个连续世代都对
蚜虫具有明显的抑制效果 ,而且各世代的抗性水平
相近 ,即 TL1 对蚜虫的抗性在不同世代间能够稳定
地遗传。
3 　讨论
转基因在受体基因组中的遗传和表达受到外源
基因整合的位点数、拷贝数、位置等多种因素的影
响[9～11 ] 。在不同的世代之间 ,外源基因的遗传和表
达特性的变化将毋庸置疑地影响了转基因植物的使
用价值。本研究中通过对转 Bt + GNA 双价基因抗
虫棉花 TL1 的 T0 、T1 、T2 和 T3 四个连续世代的目的
基因 PCR 检测和 PCR2Southern 分析 ,证明了整合到
棉花基因组中的外源抗虫基因能稳定地遗传 ;室内
棉铃虫和温室蚜虫抗性的生物测定结果表明 ,各世
代对棉铃虫具有很强的毒杀作用并对蚜虫有较好的
抑制效果 ,抗虫基因在各世代植株的基因组中也没
有发生表达上的明显变化 ,而且各世代中含有抗虫
基因的植株也有 npt Ⅱ基因 (结果未列出) ,同时对
棉铃虫、蚜虫和卡那霉素有抗性。这说明外源基因
在转 Bt + GNA 双价基因抗虫棉花 TL1 中稳定地遗
传和表达 ,为该新型多价转基因抗虫棉花的育种利
用提供了理论基础。对多种转基因植物研究表明 ,
由于外源基因发生丢失、基因重排、基因沉默等原因
造成外源基因的遗传和表达的不稳定性现
象[1 ,12～14 ] 。Scott 等[15 ] 曾报道转基因白三叶草中的
转基因在后代出现不规则的遗传和不稳定地表达情
况。Webb 等[2 ]比较全面地研究了在 uidA 基因单个
和多个位点插入、独立分离的转基因小角莲藕株系
中 GUS 在后代的遗传和表达 ,结果表明转基因的拷
贝数及转基因植株分别用作父或母本等情况都影响
GUS 在后代的传递和表达。在转基因植物的育种
中 ,我们期望选择转基因能在后代高水平且一致性
表达和稳定传递的转基因株系加以利用 ,然而受多
种因素的影响可能会导致外源基因遗传和表达的不
稳定性。因此 ,在利用转基因材料时 ,不但要及时采
用分子检测的方法跟踪外源基因在传递或转育中的
存在与否 ,还要检测外源基因在不同发育阶段、组织
及后代的表达情况。
References
[1 ] Fearing P L ,Brown D ,Vlachos D ,Meghji M , Privalle L. Quantitative
analysis of CryIA ( b) expression in Bt maize plants , tissue , and silage
and stability of expression over successive generations. Molecular Breed2
ing , 1997 ,3 :169 —176
[2 ] Webb KJ , Humphreys M O , Skot L , Gibbs M , Gatehuose J . inherit2
ance and expression of transgenes in T2 and T3 generations of Lotus cor2
niculatus transformed using Agrobacterium tumefaciens . Euphytica ,
1999 ,108 :169 —179
[3 ] Maqbool S B ,Riazuddin S ,Loc N T ,Gatehouse A M R , Gatehouse J A ,
Christou P. Expression of multiple insecticidal genes confers broad resis2
tance against a range of different rice pests. Molecular Breeding ,2001 ,
7 :85 —93
[4 ] Yuan X2L (袁小玲) , Tang C2M(唐灿明) , Zhang T2Z(张天真) . Ge2
netic stability of transgenic Bt + CpTI cotton and its resistance to Heli2
coverpa armigera in later developmental stage. Acta Agronomica Sinica
(作物学报) , 2002 ,28 (2) :179 —183
[5 ] Tang C M , Sun J , Zhu X F , Guo W Z , Zhang T Z , Shen J L , Gao C
F , Zhou WJ , Chen Z X , Guo S D. Inheritance of resistance to Helicov2
erpa armigera of 3 kinds of transgenic Bt strains available in upland cot2
ton in China. Chinese Science Bulletin , 2000 ,45 (4) :363 —367
[ 6 ] Paterson A H , Brubaker CL , Wendel J F. A rapid method for extraction
of cotton ( Gossypium spp . ) genomic DNA suitable for RFLP and PCR
analysis. Plant Mol Biol Rep , 1993 , 11 :122 —127
[7 ] Sambrook J , Friston E F , Maniatis T. Molecular Cloning : a Laboratory
Mannual . New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1989. 474 —
491
[8 ] Sun J (孙敬) , Tang C2M(唐灿明) , Yuan X2L (袁小玲) , Zhu X2F
(朱协飞) , Zhang T2Z(张天真) . Selection technique for transgenic Bt
cotton using Kanamycin as an indirect identification marker. Acta Gossy2
pii Sinica (棉花学报) , 2000 ,12 (5) :270 —276
[9 ] Finnegan J , McElroy D. Transgene inactivation : plant fight back. BioΠ
tech , 1994 ,12 :883 —888
[10 ] Ulian E C ,Magill J M ,Smith R H. Expression and inheritance pattern
of two foreign genes in petunia. Theor Apple Genet ,1994 ,88 :433 —440
[11 ] Iglesias V A , Moscone E A , Papp I. molecular and cytogenetics , anal2
yses of stably and unstably expressed transgenic loci in tobacco. Plant
Cell , 1997 , 9 :1251 —1264
[12 ] Budar F , Thia TL , Van M M , Hernalsteens J P. Agrobacterium2medi2
ated gene transfer results mainly in transgenic plants transmitting T2
DNA as a single Mendelian factor. Genetics , 1986 , 114 :303 —313
[13 ] Cherdshewasart W , Gharti2Chhetri G B ,Saul M W ,Jacobs M ,Negrutiu
I. Expression instability and genetic disorders in transgenic Nicotiana
plumbaginifolia L. plants. Transgenic Research ,1993 ,2 :307 —320
[14 ] Zeng J2Z(曾君祉) , Wu Y2Q(吴有强) , Wang D2J (王东江) , Zhang
J (张健) , Ma Z2R (马铮嵘) , Zhou Z2Y(周志强) . Discussion in
transformation mechanism and inheritance of transgenic plants progeny
by pollen tube pathway (or vector) . Chinese Science Bulletin (科学通
报) , 1998 ,43 (6) :561 —566
[15 ] Scott A , Woodfield D R , Allan A , Maher D , White D W R. Inherit2
ance and expression of transgenes in white clover. Agronomy Society of
New Zealand Special Publication No 11ΠGrassland Research and Prac2
tice Series , 1996 , 6 :131 —135
01 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷