全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(12): 21362144 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由中央高校基本科研业务费专项资金(XDJK2009C109)和国家自然科学基金项目(30971849)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 朱利泉, E-mail: zhuliquan@swu.edu.cn, Tel: 023-68250794
第一作者联系方式: E-mail: ykun0827@163.com, ykun0827@gmail.com, Tel: 023-68250794 ** 共同第一作者
Received(收稿日期): 2011-04-23; Accepted(接受日期): 2011-07-25; Published online(网络出版日期): 2011-09-29.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110929.1551.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.02136
甘蓝自交不亲和信号转导元件 ARC1与 EXO70A1的相互作用
杨 昆 1 张贺翠 1,** Richard CONVERSE2 朱利泉 1,* 杨永军 1 薛丽琰 1
罗 兵 1 常登龙 1 高启国 3 王小佳 3
1 西南大学农学与生物科技学院, 重庆 400716; 2 Department of Biology, University of Cincinnati, Cincinnati OH 45267-0524; 3 西南大学
重庆市蔬菜重点实验室, 重庆 400716
摘 要: 从甘蓝型油菜与羽衣甘蓝柱头中克隆出 ARC1与 EXO70A1基因的编码区, 序列分析显示推导的甘蓝型油菜
ARC1比羽衣甘蓝 ARC1少编码 2个氨基酸, ARC1蛋白在羽衣甘蓝与甘蓝型油菜中存在 45个氨基酸的差异, 其序列
相似度与一致性分别达到 95.9%和 93.9%; 推导的 EXO70A1 在 2种植物中仅有 6个氨基酸的差异, 其序列相似度与
一致性分别达到 99.4%和 98.9%; EXO70A1蛋白在种内和物种间都保持着高度的保守性, 其保守的程度高于 ARC1。
应用酵母双杂交系统检测 2种蛋白质的相互作用, 发现在二倍体酵母细胞中, 全长的 ARC1与 EXO70A1之间存在较
强的相互作用, 能激活 4个报告基因(ADE2、HIS3、AUR1-C和 MEL1)的表达; 去除 C-端(包括臂重复区) 316个氨基
酸残基后的 ARC1N与 EXO70A1之间表现出较弱的相互作用, 只能激活 3个报告基因(ADE2、AUR1-C和 MEL1)的表
达, 表明 ARC1的臂重复区可能并不位于 ARC1与 EXO70A1的互作界面的核心区段, ARC1的 N-端结构域对 ARC1
与 EXO70A1 互作起关键作用 ; 同时发现不同 ARC1-EXO70A1 组合的互作强度相当 , 其可能原因是 ARC1 和
EXO70A1在甘蓝与甘蓝型油菜中存在的这些序列差异并未影响 ARC1-EXO70A1互作界面的构象。
关键词: 自交不亲和; 信号元件; 蛋白质相互作用; 酵母双杂交
Interaction between Two Self-incompatible Signal Elements, EXO70A1 and
ARC1
YANG Kun1, ZHANG He-Cui1,, Richard CONVERSE2, ZHU Li-Quan1,*, YANG Yong-Jun1, XUE Li-Yan1,
LUO Bing1, CHANG Deng-Long, GAO Qi-Guo3, and WANG Xiao-Jia3
1 College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2 Department of Biology, University of Cincinnati,
Cincinnati OH 45267-0524, USA; 3 Key Laboratory in Olericulture of Chongqing, Southwest University, Chongqing 400716, China
Abstract: ARC1 and EXO70A1 are important signal elements of self-incompatibility in Brassica. To identify the interaction of
ARC1-EXO70A1 during the course of SI, we cloned the coding sequences of ARC1 and EXO70A1 from Brassica napus L. and
Brassica oleracea L. var. acephala. Sequence analysis showed that ARC1 consisted of 663 amino acids in Brassica oleracea and
661 amino acids in Brassica napus, and there existed 45 amino acids difference between them. Sequence alignment showed that
similarity positions and identity positions reached 95.9% and 93.9% between BoARC1 and BnARC1, whereas there existed only
six-amino-acid difference between BoEXO70A1 and BnEXO70A1. The Similarity positions and identity positions reached 99.4%
and 98.9% between BoEXO70A1 and BnEXO70A1 respectively. The homology of EXO70A1 was higher than that of ARC1.
Yeast two-hybrid results indicated that the strong interaction existed between ARC1 and EXO70A1, and it could activate the ex-
pression of four reporter genes (ADE2, HIS3, AUR1-C, and MEL1) in diploid yeasts. However, low interaction existed between
EXO70A1 and ARC1N with 316 amino acids deleted from C-terminal, and it only activated the expression of three reporter genes
(ADE2, AUR1-C, and MEL1). This provides an insight that the interface of interaction between ARC1 and EXO70A1 may not
consist of the domains of arm repeats in ARC1. N-terminal domains of ARC1 play an essential role in the interaction of
ARC1-EXO70A1. The influences of the differences in amino-acid composition between BoARC1 and BnARC1 on the interaction
of ARC1-EXO70A1 could not be detected by means of yeast two-hybrid system, which probably resulted from that the binding
interface between ARC1 and EXO70A1 was not altered by sequence difference of two proteins in two Brassica species.
第 12期 杨 昆等: 甘蓝自交不亲和信号转导元件 ARC1-EXO70A1的相互作用 2137


Keywords: Self-incompatibility; Signal element; Protein interaction; Yeast two-hybrid
芸薹属植物表现孢子体自交不亲和性 (sporo-
phytic self-incompatibility, SSI), 其柱头能特异性地
阻止自花花粉(self pollen)的萌发[1-4]。当自花花粉落
在柱头上时, 花粉乳突细胞中 S 位点富含半胱氨酸
蛋白(S-locus cystein-rich protein, SCR)以单倍型特异
性方式与柱头乳突细胞质膜上的 S 位点受体激酶
(S-locus receptor kinase, SRK)的胞外域结合, 导致
SRK 的构象改变, 引发类硫氧还蛋白 (thioredoxin-
like protein, THL)脱离 SRK [5-6]。同时, SRK的激酶
域发生自体磷酸化反应, 激活的 SRK-SRK寡聚体与
M-位点蛋白激酶(M-locus protein kinase, MLPK)之
间发生某种瞬间的相互作用[7-10], 将 SI 信号传递到
柱头乳突细胞的胞内 , 引发 ARC1 (ARM repeat
containing 1)的磷酸化作用与细胞质定位[11]。随后,
活化的 ARC1 与胞质中一潜在的靶蛋白结合, 在泛
素活化酶(Ub-activation enzymes, E1)与泛素接合酶
(Ub-conjugating enzymes, E2)的共同协助下, 促使该
靶蛋白经“泛素化-蛋白酶体路径”而降解; 继而引发
一系列的级联反应, 使得自体花粉的萌发与花粉管
的生长被抑制[12-13]。
最近, Samuel 等[14]从油菜柱头中分离出 EXO
70A1, 敲除掉该基因后, 油菜柱头的花粉萌发受到
抑制, 作者认为 EXO70A1 很可能是上述级联反应
中ARC1的一种下游底物分子, 并假设 EXO70A1被
降解后引发了花粉萌发的抑制。基于此, 我们从羽衣
甘蓝(Brassica oleracea L. var. acephala, 简写为 Bo)
及甘蓝型油菜(Brassica napus L., 简写为 Bn)中克隆
出ARC1与 EXO70A1的编码基因, 应用酵母双杂交
技术对 BoARC1-BoEXO70A1、BnARC1-BnEXO70A1
及 BnEXO70A1-BoEXO70A1 之间的相互作用进行
检测和深入分析, 以期为ARC1催化 EXO70A1降解
前的分子识别过程提供直接证据, 进而为阐明自交
不亲和信号转导的分子作用机理提供新内容。
1 材料与方法
1.1 试验材料
自交不亲和羽衣甘蓝 2003a1与甘蓝型油菜中油
821 由西南大学农学与生物科技学院油菜研究室提
供。克隆载体 PMD19T 由 TaKaRa 公司(大连)提供;
X-a-Gal (简写为 X)、Aureobasidin A (简写为 AbA)、
缺陷性培养基、pGBKT7 和 pGADT7 均购自于
Clontech 公司; 酵母双杂交系统选择 Clontech 公司
的Matchmaker Gold Systems, DMSO购自美国 Sigma
公司。限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶购自于
TaKaRa公司(大连); dNTPs、TransScript RT反转录
试剂盒和 TransTaq HiFi DNA 聚合酶与 DL2000
DNA Marker由 TransGen公司(北京)提供; 引物合成
和序列测定由北京华大基因公司完成。
1.2 重组“猎物(activation domain, AD)”载体的
构建和鉴定
EXO70A1 的引物设计依据拟南芥数据库中的
EXO70A1 基因序列与 pGADT7 载体序列, FEXO
70A1 为 5-TCCCCCGGGGGATATGGCCGTCGATA
GCCGAAT-3(下画实线部分为添加的限制性内切酶
Sma I酶切位点, 下画虚线部分为保护碱基), REXO
70A1 为 5-AGCTCGAGCTCGTTACCGTCGTGGTT
CATTCATAGACT-3(下画实线部分为添加的限制性
内切酶 Sac I酶切位点, 下画虚线部分为保护碱基)。
收集开花前 1~2 d 的羽衣甘蓝与甘蓝型油菜的
花蕾, 提取总 RNA。以 TransScript RT 反转录试剂
盒合成 cDNA 第一条链; 再以 cDNA 为模板扩增
EXO70A1。通过 TA克隆将纯化后的 EXO70A1连接
至 pMD19T 载体, 重组质粒转化感受态细胞 DH5α,
于 LB 培养基培养过夜后, 挑取阳性克隆并 PCR 鉴
定。分别抽提质粒 PMD19T-EXO70A1 与 pGADT7,
然后选用 Sac I和 Sma I对 2种质粒进行双酶切, 选
用 T4连接酶构建新的重组质粒 pGADT7-EXO70A1,
再次转化至感受态 DH5α, 涂布于 LB抗 Kan+的平板
上, 37℃培养过夜。用 pGADT7 通用 T7 测序引物
(5-TAATACGACTCACTATAGGGC-3)和 3激活域
测序引物 (5-AGATGGTGCACGATGCACAG-3)菌
落 PCR 后, 取阳性克隆送北京华大基因公司测序鉴
定。最后, 按照 Clontech公司 Matchmaker Gold系统
的操作说明 , 将正确的克隆子转化至感受态 Y187
细胞, 于 SD/–Leu培养基检测筛选, 并于 SD/–Leu/X
培养基上进行自激活检测。
1.3 重组“诱饵(binding domain, BD)”载体转化
酵母细胞 Y2HGold
应用 Primer premier 6.0设计相应的RT-PCR引物,
同时在上下游引物的 5端分别插入 EcoR I和 Sal I酶
切位点。引物为: ARC1F: CCGGAATTCCCGATGGC
CACTGATTCAGCAATGTTCGCAT, ARC1R1: ACGC
2138 作 物 学 报 第 37卷

GTCGACGTTATCTCTGTGTTTTCTGGTCGCAC,
ARC1R2: ACGCGTCGACGCCAAAGCGTTGTCAA
GTGTC TCA (引物所带下画线序列分别表示 EcoR I
和 Sal I酶切位点, 添加虚线下画线的部分为保护碱
基部分)。
收集羽衣甘蓝与甘蓝型油菜开花前 1 d的花蕾,
提取总 RNA, 以反转录的 cDNA 为模板, 分别用相
应的引物组合 ARC1F:ARC1R1 和 ARC1F:ARC1R2
扩增 ARC1及 ARC1N片段。RT-PCR反应参数为 94℃
预变性 4 min; 再 94℃变性 60 s、58℃退火 45 s、72℃
延伸 90 s, 30个循环; 于 72℃反应 10 min后终止。
PCR 产物经胶回收试剂盒回收纯化后, 通过 TA 克
隆连接至 pMD19T 载体; 重组载体转化感受态细胞
DH5α, LB培养基培养过夜, 挑取阳性克隆并经 PCR
鉴定后 , 分别抽提质粒 pMD19T-ARC1、pMD19T-
ARC1N与 pGBKT7; 然后将重组质粒与 pGBKT7 经
EcoR I和 Sal I双酶切, T4连接酶重新构建重组载体
pGBKT7-ARC1 和 pGBKT7-ARC1N。将连接产物转
化感受态大肠杆菌 DH5α, 铺于 LB 抗 Kan+的平板上,
37℃培养过夜。筛选阳性重组子, 进行菌液 PCR 和
酶切鉴定, 并将含有插入目的片段的阳性克隆送华
大基因公司测序。选取正确的克隆子 pGBKT7-ARC1
和 pGBKT7-ARC1N 以备转化感受态的酵母细胞
Y2HGold。
1.4 pGBKT7-ARC1和 pGBKT7-ARC1N对酵母
Y2HGold毒性的检测
参照 Clontech公司 Matchmaker Gold系统的操
作说明, 利用 LiAc 法制备感受态酵母菌 Y2HGold
和酵母菌 Y187。pGBKT7-ARC1和 pGBKT7-ARC1N
转化 Y2HGold 酵母感受态细胞, 将已转化成功的酵
母Y2HGold [pGBKT7-ARC1]和Y2HGold [pGBKT7-
ARC1N]分别涂布于 SD/–Trp 固体培养基, 30℃倒置
培养 3~5 d, 观测二者菌斑的生长情况 , 若酵母
Y2HGold [pGBKT7-ARC1]的菌斑明显小于酵母
Y2HGold [pGBKT7]的菌斑, 说明 pGBKT7-ARC1对
酵母 Y2HGold可能有毒性; 反之, 说明没有毒性。
1.5 自身转录激活活性鉴定
参考 Clontech公司 Matchmaker Gold酵母双杂
交系统的操作说明。依据菌斑形态和颜色分析
ARC1N 融合蛋白自身激活作用, 将上述已鉴定包含
阳性克隆的酵母株 Y2HGold 分别涂在 SD/–Trp、SD/
–Trp/X、SD/–Leu/–Trp和 SD/–Trp/X/AbA平板培养基
上, 30℃培养 3~4 d, 观察酵母生长情况以及菌落的
颜色变化。同时设立阴性对照{Y2HGold [pGBKT7-
Lam] × Y187 [pGADT7-T]和阳性对照 {Y2HGold
[pGBKT7-53] × Y187 [pGADT7-T]}。
1.6 ARC1(ARC1N)与 EXO70A1 之间相互作用
检测
分别挑取 SD/–Trp平板上的 Y2HGold [pGBKT7-
ARC1]和 Y2HGold [pGBKT7-ARC1N]菌落及 SD/
–Leu 平板上的 Y187 [pGADT7-EXO70A1]菌落, 按
照Y2HGold × Y187原则两两交配, 然后把交配后的
酵母接种于 2×YPDA液体培养基中, 于 30℃振荡培
养 18~20 h 后, 在显微镜下检测 Y2HGold 与 Y187
交配后是否形成融合细胞 ; 同时培养阴性对照菌
{Y2HGold [pGBKT7-Lam] × Y187 [pGADT7-T]}和阳
性对照菌{Y2HGold [pGBKT7-p53] × Y187 [pGADT7-
T]}。将融合型酵母菌液分别涂布至 SD/–Trp/–Leu
(即 DDO培养基)和 SD/–Trp/–Leu/X/AbA (即 DDO/X/
AbA)等平板上, 30℃培养 3~5 d后, 将 DDO/X/AbA平
板上的蓝色克隆接种至 SD/–Trp/–Leu/–Ade/–His/X/
AbA(即QDO/X/AbA)平板, 30℃培养3~5 d, 观察菌落。
2 结果与分析
2.1 重组“诱饵”质粒 pGBKT7-ARC1与 pGBKT7-
ARC1N的鉴定
以羽衣甘蓝 2003a1和甘蓝型油菜开花前 1 d的
柱头 cDNA 为模板, 扩增相应的 ARC1 和 ARC1N片
段, 经 1% (W/V)琼脂糖凝胶电泳检测, BoARC1 与
BoARC1N 的目的核酸序列大小分别为 2 115 bp、
1 064 bp, BnARC1与 BnARC1N目的核酸序列大小分
别为 2 109 bp、1 058 bp (图 1)。提取筛选的阳性克
隆质粒, 分别经 EcoR I和 Sal I双酶切, 电泳检测得
到与羽衣甘蓝和甘蓝型油菜的 ARC1 与 ARC1N大致
相同的片段 (未附图 )。DNA 测序结果分析表明 ,
pGBKT7-ARC1 与 pGBKT7-ARC1N 载体中包含
ARC1 和 ARC1N的编码序列, 其插入位点和阅读框正
确, 序列完全一致。
2.2 重组“猎物”质粒 pGADT7-EXO70A1的鉴定
以羽衣甘蓝及甘蓝型油菜开花前 1~2 d 的花柱
cDNA 为模板, PCR扩增后经 1% (W/V)琼脂糖凝胶
电泳检测, 目的片段大小皆为 1 942 bp (图 1)。提取
筛选的阳性克隆质粒 DNA, 分别经 Sma I和 Sac I双
酶切, 电泳检测得到与 EXO70A1长度大致相同的片
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图 1 ARC1、ARC1N与 EXO70A1编码框的电泳
Fig. 1 Electrophoretic patterns of RT-PCR products of ARC1,
ARC1N, and EXO70A1
M: DL2000 DNA分子量标记; 1: 羽衣甘蓝 ARC1编码序列, 长度
为 2 115 bp; 2: 甘蓝型油菜 ARC1编码序列, 长度为 2 109 bp; 3:
羽衣甘蓝 ARC1N编码序列, 长度为 1 064 bp; 4: 甘蓝型油菜
ARC1N编码序列, 长度为 1 058 bp; 5: 羽衣甘蓝 EXO70A1编码序
列, 长度为 1 942 bp; 6: 甘蓝型油菜 EXO70A1编码序列, 长度为
1 942 bp。1~6中的序列均包含两端添加的限制性内切酶切位点
与保护碱基。
M: DL2000 DNA marker; 1, cDNA of Brassica oleracea’s ARC1; 2:
cDNA of Brassica napus’s ARC1; 3: cDNA of Brassica oleracea’s
ARC1N; 4: cDNA of Brassica oleracea’s ARC1N; 5: cDNA of Bras-
sica oleracea’s EXO70A1; 6: cDNA of Brassica napus’s EXO70A1.

段。DNA测序结果分析表明, pGBKT7-EXO70A1载
体中包含 EXO70A1的 CDS (coding sequence), 其插
入位点和阅读框正确, 序列完全一致。
2.3 重组质粒的毒性及自激活检测分析
2.3.1 重组“诱饵”质粒 pGBKT7-ARC1与 pGBKT7-
ARC1N的毒性及自激活检测 Y2HGold [pGBKT7-
ARC1]和 Y2HGold [pGBKT7]转化株在缺陷型
SD/–Trp平板上, 30℃培养 3 d后, 出现生长状态良
好的白色克隆, 菌斑大小、密度均无明显差异; 而未
转化重组质粒的 Y2HGold酵母菌株在 SD/–Trp缺陷
性培养基上不生长。由于 pGBKT7 质粒上有 TRP1
缺陷筛选基因, SD/–Trp平板上 Y2HGold [pGBKT7-
ARC1]菌落生长良好 , 表明“诱饵”质粒 pGBKT7-
ARC1在 Y2HGold中成功表达且无毒性作用。此外,
Y2HGold [pGBKT7-ARC1]在缺陷型 SD/–Trp平板上
呈白色菌落; 在 SD/–Trp/X 平板上无明显的蓝色菌
落生成; 在 SD/–Trp/X/AbA 平板上没有菌落产生。
这表明融合蛋白“结合域-ARC1”与“结合域-ARC1N”
在酵母细胞中均未激活报告基因 AUR1-C 和 MEL1,
无自身的转录激活作用。同时发现阳性对照有明显
的蓝色克隆菌落出现, 而阴性对照无克隆菌落产生
(表 1)。
2.3.2 重组“猎物”质粒 pGADT7-EXO70A1 的毒性
及自激活检测 将空载 pGADT7 和重组质粒
pGADT7-EXO70A1 分别转化酵母细胞 Y187, 在
SD/–Leu 平板上均得到生长状态良好的白色菌落 ,
而未转化重组质粒的 Y187 酵母菌株在 SD/–Leu 缺
陷性培养基上不生长。由于 pGADT7 载体上具有
LEU2 缺陷筛选基因 , 由此表明重组表达质粒
pGADT7-EXO70A1成功转化且对宿主细胞 Y187无
毒性。此外, 酵母细胞 Y187 [pGADT7-EXO70A1]
在 SD/–Leu 平板上呈现生长状态良好的白色菌斑;
而在 SD/–Leu/X 平板上产生的菌落没有出现蓝色。
因此可说明 EXO70A1 对酵母的生长未产生毒性 ,
融合蛋白“激活域-EXO70A1”在酵母细胞中没有激
活报告基因MEL1, 即目标基因无自激活作用(表 2)。
2.4 EXO70A1与 ARC1之间相互作用检测分析
DDO培养基是缺少 Leu与 Trp的 SD培养基, 4
个实验组{Y2HGold [pGBKT7-BoARC1] × Y187

表 1 重组诱饵载体自激活及毒性检测
Table 1 Test on autoactivation of recombinant bait vectors and their toxicity effect in transformed yeast strains
类别
Type
SD/–Trp SD/–Trp/X SD/–Trp/AbA DDO DDO/X/AbA MEL1 AUR1-C
pGBKT7-ARC1 + + – – / White No
pGBKT7-ARC1N + + – – / White No
Positive control / / / + + Blue Yes
Negative control / / / + – / No
＋: 生长; –: 不生长; /: 未转平板或不存在现象。+: growth; –: no growth; /: absence.

表 2 重组猎物载体自激活检测
Table 2 Test on autoactivation of recombinant prey vectors in transformed yeast strains
类别
Type
SD/–Leu SD/–Leu/X DDO DDO/X/AbA MEL1
pGADT7-EXO70A1 + + – / White
Positive control / / + + Blue
Negative control / / + – /
＋: 生长; –: 不生长; /: 未转平板或不存在现象。+: growth; –: no growth; /: absence.
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[pGADT7-BoEXO70A1]、Y2HGold [pGBKT7-Bo
ARC1N] × Y187 [pGADT7-BoEXO70A1]、Y2HGold
[pGBKT7-BnARC1] × Y187 [pGADT7-BnEXO70A1]
和 Y2HGold [pGBKT7-BnARC1N] × Y187 [pGADT7-
BnEXO70A1]}在 DDO 平板上均能产生正常的菌落,
表明双杂交重组表达质粒已成功转入融合的二倍体
酵母菌中, pGADT7 和 pGBKT7 携带的 2 种基因
(LEU2与 TRP1)得到表达。同时选用 ARC1、ARC1N
和 EXO70A1相应的引物组合对 DDO平板上的菌落,
进行酵母菌落 PCR 检测后, 发现在同一菌落中同时
包含 EXO70A1与 ARC1或 ARC1N (未附图), 进一步
验证了重组质粒 pGADT7-EXO70A1 与 pGBKT7-
ARC1 或 pGBKT7-ARC1N 成功转入二倍体酵母细
胞。再次运用缺陷性培养基检验后, 发现 4个实验
组 Y2HGold [pGBKT7-ARC1] × Y187 [pGADT7-
EXO70A1]、Y2HGold [pGBKT7-ARC1N] × Y187
[pGADT7-EXO70A1]都能在 DDO/AbA 平板上长出
明显的白色菌落(图 5), 由此表明这 4个实验组激活
了报告基因 AUR1-C (图 2-A)。为更进一步检测相互
作用的可能性, 排除假阳性和假阴性的出现; 我们
将 DDO/AbA平板上的酵母菌株转接到 QDO/X/AbA
平板上, 5 d后 Y2HGold [pGBKT7-ARC1] × Y187
[pGADT7-EXO70A1]有新的蓝色菌斑出现, 由此可
表明报告基因 HIS3、ADE2、AUR1-C和 MEL1同时
被激活, 然而 Y2HGold [pGBKT7-ARC1N] × Y187
[pGADT7-EXO70A1]的 2 个实验组并没有新的菌斑
出现(图 2-C)。当我们将 Y2HGold [pGBKT7-ARC1N]
× Y187 [pGADT7-EXO70A1]从二缺培养基 DDO/
AbA转接至 2种三缺培养基, 3~5日后发现在培养基
DDO/–Ade/X/AbA上长出新的蓝色菌斑(图 2-B), 但
是却不能在 DDO/–His/X/AbA 的培养基上生长, 这
意味着实验组 Y2HGold [pGBKT7-ARC1N] × Y187
[pGADT7-EXO70A1]的报告基因 ADE2、AUR1-C和
MEL1 能够同时被激活, 而报告基因 HIS3 没有被激
活。当运用酵母双杂交技术检测甘蓝型油菜 ARC1
与羽衣甘蓝 EXO70A1 相互作用时, 得到相同的实
验结果(表 3)。由此说明 ARC1-EXO70A1 之间能够
发生较强的相互作用, 在羽衣甘蓝 ARC1 与甘蓝型

表 3 酵母中 ARC1和 EXO70A1的相互作用
Table 3 Interactions between ARC1 and EXO70A1 detected by yeast two-hybrid system
No. 酵母菌株
Yeast strain [plasmid]
培养基
Medium
菌落
Colony
菌落颜色
Color of colonies
1 Y187 [pGADT7-EXO70A1] SD/–Leu + White
2 Y187 [pGADT7-EXO70A1] DDO – /
3 Y2HGold [pGBKT7-ARC1] SD/–Trp + White
4 Y2HGold [pGBKT7-ARC1] SD/–Trp/X + White
5 Y2HGold [pGBKT7-ARC1] SD/–Trp/AbA – /
6 Y2HGold [pGBKT7-ARC1] DDO – /
7 Y2HGold [pGBKT7-ARC1N] SD/–Trp + White
8 Y2HGold [pGBKT7-ARC1N] SD/–Trp/X + White
9 Y2HGold [pGBKT7-ARC1N] SD/–Trp/AbA – /
10 Y2HGold [pGBKT7-ARC1N] DDO – /
11 Y2Hgold [pGBKT7-ARC1] × Y187 [pGADT7-EXO70A1] DDO/AbA + White
12 Y2Hgold [pGBKT7-ARC1] × Y187 [pGADT7-EXO70A1] DDO/–Ade/X/AbA + Blue
13 Y2Hgold [pGBKT7-ARC1] × Y187 [pGADT7-EXO70A1] DDO/–His/X/AbA + Blue
14 Y2Hgold [pGBKT7-ARC1] × Y187 [pGADT7-EXO70A1] QDO/–His/X/AbA + Blue
15 Y2Hgold [pGBKT7-ARC1N] × Y187 [pGADT7-EXO70A1] DDO/AbA + White
16 Y2Hgold [pGBKT7-ARC1N] × Y187 [pGADT7-EXO70A1] DDO/–Ade/X/AbA + Blue
17 Y2Hgold [pGBKT7-ARC1N] × Y187 [pGADT7-EXO70A1] DDO/–His/X/AbA – /
18 Y2Hgold [pGBKT7-ARC1N] × Y187 [pGADT7-EXO70A1] QDO/X/AbA – /
19 Y2Hgold [pGBKT7-53] × Y187 [pGADT7-T] QDO/X/AbA + Blue
20 Y2HGold [pGBKT7-lam] × Y187 [pGADT7-T] QDO/X/AbA – /
＋: 生长; –: 不生长; /: 未转平板或不存在现象。ARC1代表 BoARC1和 BnARC1; EXO70A1代表 BoEXO70A1和 BnEXO70A;
ARC1N代表 BoARC1N和 BnARC1N.
+: growth; –: no growth; /: absence. ARC1 represents BoARC1 and BnARC1; EXO70A1 represents BoEXO70A1 and BnEXO70A;
ARC1N represents BoARC1N and BnARC1N.
第 12期 杨 昆等: 甘蓝自交不亲和信号转导元件 ARC1-EXO70A1的相互作用 2141




图 2 融合酵母中 EXO70A1与 ARC1之间相互作用
Fig. 2 Analysis of the interaction between ARC1 and EXO70A1 in yeast
A: 融合酵母在 DDO培养基上的检测实验; A1~A4: Y2HGold [pGBKT7-ARC1] ×Y187 [pGADT7-EXO70A1]; A5~A8: Y2HGold
[pGBKT7-ARC1N] ×Y187 [pGADT7-EXO70A1]。B: 融合酵母在 DDO/–Ade/X/AbA培养基上的检测实验; B1~B4: Y2HGold [pGBKT7-ARC1]
×Y187 [pGADT7-EXO70A1]; B5~B8: Y2HGold [pGBKT7-ARC1N] ×Y187 [pGADT7-EXO70A1]。C: 融合酵母在 QDO/X/AbA培养基上的检测
实验; C1和C6: Y2HGold [pGBKT7-ARC1N] ×Y187 [pGADT7-EXO70A1]; C2和C5为Y2HGold [pGBKT7-ARC1] ×Y187 [pGADT7-EXO70A1];
C3: 阴性对照 Y2HGold [pGBKT7-lam] ×Y187 [pGADT7-T]; C4: 阳性对照 Y2HGold [pGBKT7-53] ×Y187 [pGADT7-T]。
A: yeasts live on DDO plate; A1–A4: yeasts with ARC1 and EXO70A1 co-transformed; A5–A8: yeasts with ARC1N and EXO70A1
co-transformed. B: yeasts live on DDO/–Ade/X/AbA plate; B1–B4: yeasts with ARC1 N and EXO70A1 co-transformed; B5–B8: yeasts with
ARC1and EXO70A1 co-transformed. C: yeasts live on the QDA/X/AbA plate; C1 and C6: yeasts with ARC1N and EXO70A1 co-transformed;
C2 and C5: yeasts with ARC1N and EXO70A1 co-transformed; C3: negative control; C4: positive control.

油菜 ARC1 存在氨基酸的差异并不影响它与 EXO
70A1 之间的相互作用; 而臂重复区被删除的 ARC1N
与 EXO70A1之间的相互作用可能相对较弱。
2.5 EXO70A1与 ARC1的序列分析
经序列测定发现羽衣甘蓝、甘蓝型油菜与拟南
芥的 EXO70A1基因的编码区由 1 917 bp构成, 编码
638个氨基酸; 运用Vector NTI Advance 11对推导的
3种蛋白质序列比对后, 发现它们之间存在 99.1%的
相似度和 77.7%的一致性。甘蓝 EXO70A1与拟南芥
EXO70A1 (GenBank: NM_120434)之间只有 34个氨
基酸的差异(图 3), 其序列一致性达到 94.7%, 而其
相似性则高达 97.3%; EXO70A1 在同属的甘蓝与甘
蓝型油菜中只有 6个氨基酸的差异(图 3), 其序列一
致性达到 98.9%, 而其相似度则高达 99.4%; Blast搜
索分析发现 EXO70A1 蛋白的 271~627 氨基酸酸残
基构成的肽段与 EXO70 exocyst complex 的亚单位
高度同源。
甘蓝与甘蓝型型油菜的 ARC1 基因不包含密码
子, 其 CDS分别由 1 992 bp和 1 986 bp组成, 经推
导, 它们分别编码 663个和 661个氨基酸, 少编码的
2 个氨基酸残基位于甘蓝型油菜 ARC1 的 N-端。运
用 Vector NTI Advance比对显示, ARC1在甘蓝与甘
蓝型油菜中的相似度和一致性分别高达 95.2%和
92.9%, 二者存在 45 个氨基酸残基的差异(图 4), 其



图 3 3种 EXO70A1蛋白的序列比对
Fig. 3 Alignment of EXO70A1 from three kinds of plant
2142 作 物 学 报 第 37卷



图 4 2种 ARC1蛋白质与 AtPUB17的序列比对
Fig. 4 Protein sequence comparison between BoARC1, BnARC1, and AtPUB17

中 29处为理化性质差异较大的氨基酸, 17个差异大
的氨基酸位于 ARC1的 N-端(包含 U-box); U-box (肽
段 283~347)存在 5个氨基酸的差异(表 4)。ARC1在
物种间的保守性低于 EXO70A1。Blast 搜索与
SMART 结构域分析发现, BoARC1、BnARC1 与
AtPUB17、OsSPL11及 NtACRE276拥有相似的结构
域结构与组成[15-16], 都包含 2 个重要的结构域即 U-
box和 C-端的臂重复区(图 5)。当我们将甘蓝型油菜
和羽衣甘蓝的ARC1与拟南芥的AtPUB17 (GenBank:
NP_174228)进行蛋白质序列比对后, 发现它们在同

表 4 羽衣甘蓝 ARC1与甘蓝型油菜 ARC1的 U-box区的氨基
酸组成的差异
Table 4 Differences in amino acid composition of U-box of
ARC1 between Brassica oleracea ARC1 and Brassica napus
位置
Position
Brassica oleracea Brassica napus
292 Ile Leu
300 Val Ile
309 Ser Thr
298 Val –
337 Pro Ser
–: 缺失。–: deletion.



图 5 ARC1及 ARC1N的结构域结构与组成
Fig. 5 Domain compositions and organization of ARC1 and
ARC1N
U: U-box domain; UND: U-box N-terminal domain;
ARM: armadillo repeat.
源区段的相似度和一致性分别为 93.4%与 54.8%。
ARC1 蛋白的 N-端包含 5 个连续的臂重复区, 而
ARC1N蛋白由 347个氨基酸构成, 其编码框由 1 041
bp 构成, 比全长的甘蓝 ARC1 少编码 316 个氨基酸,
为去掉 C-端臂重复区的 ARC1蛋白(图 5)。
将 2 种推导的蛋白质(ARC1 和 EXO70A1)在羽
衣甘蓝与甘蓝型油菜中所存在的序列差异, 结合酵
母双杂交的结果一起分析发现, 两种推导的蛋白质
在一级结构上的差异并未对 ARC1-EXO70A1 的互
作产生明显的影响; 这表明 2 种蛋白质的编码基因
在序列上的差异可能并未引起 ARC1-EXO70A1 发
生互作所需的蛋白质互补界面的改变。
3 讨论
蛋白质间的相互作用存在于生命体生长发育的
每个环节, 这些环节相互协作形成一个个交互的网
络, 构成了生命活动的基础。芸薹属植物自交不亲
和反应过程更是依赖于多种信号元件之间的相互作
用, 研究自交不亲和信号转导途径中蛋白质间相互
作用有助于了解高等植物抵制自交授粉以发挥杂交
优势的本质, 如雌蕊柱头与花粉粒相互识别的过程,
离不开柱头乳突细胞的 SRK的胞外域与花粉粒表面
的 SCR之间依照“受体-配体”方式的结合; THL抑制
SRK 的活性, 离不开 THL 与 SRK 胞内激酶域之间
的相互作用; SRK将获取的 SI信号传递至细胞的内
部, 同样需要其激酶域与下游的信号元件 ARC1 之
间的互作[11,17-19]。随着生命科学的发展, 在研究蛋白
质间的互作方面出现很多技术 , 如双分子荧光互
第 12期 杨 昆等: 甘蓝自交不亲和信号转导元件 ARC1-EXO70A1的相互作用 2143


补、GST Pulldown、CoIP和 Western杂交技术。酵
母双杂交也是一种被用作研究蛋白质互作的有效技
术, 它率先被 Fields引入[20], 此后, 该技术不断得到
完善。文中选用 Clontech 公司的 Gold 系统(Match-
maker Gold Systems), 该系统包含 2种单倍型酵母菌
株 Y2HGold和 Y187; 酵母菌 Y2HGold 中有受 3个
不同的启动子控制的 4个报告基因(AUR1-C、HIS3、
ADE2、MEL1), 酵母菌Y187中有 2个报告基因MEL1、
lacZ; 通过 4个报告基因的激活检测, 完成蛋白质互作
的研究, 能够提供真实可信的实验结果。
在芸薹属自交不亲和反应的信号通路中, ARC1
是雌性决定因子 SRK 的直接作用蛋白, 它在芸薹属
植物的柱头中特异性表达。Stone 等[11]和 Mazzurco
等[18]研究发现当自交不亲和反应发生时, ARC1 的
C-端结构域与 SRK 的激酶域发生相互作用导致
ARC1因磷酸化而被激活, 5个连续的臂重复区(ARM)
正好占据了 ARC1 C-端结构域的绝大多数区域, 因
此可以推定与 SRK的胞内激酶域互作的关键结构域
为臂重复区。EXO70A1 是一新发现的 SI 信号元件,
在自交不亲和通路中位于 ARC1的下游。Samuel等[14]
首先发现删除 EXO70A1 基因的花柱直接抑制柱头
表面花粉的萌发与花粉管的伸长 , 并据此认为
EXO70A1很可能是 SSI反应中 ARC1的一个下游底
物分子, 自交不亲和反应发生时, 柱头 EXO70A1的
降解引发柱头乳突细胞对花粉萌发的抑制。我们运
用酵母双杂交技术对 ARC1-EXO70A1 之间相互作
用的深入检测发现, 同时转化ARC1-EXO70A1的酵
母在加入 AbA 及 X-α-gal 的四缺 SD 培养基中能够
健康成长, 证明它能够同时激活除 LEU与 TRP之外
的 4 种报告基因(AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1)的
表达, 表明ARC1与 EXO70A1之间存在较强的相互
作用 ; ARC1N 为包含臂重复区的 C-端被删除的
ARC1 蛋白, 比羽衣甘蓝的全长 ARC1 蛋白少编码
316个氨基酸。酵母双杂交实验发现, ARC1N-EXO70
A1之间的互作强度较弱, 二者共转化的酵母细胞中
只激活除了 LEU与 TRP之外的 3种报告基因(AUR1-
C、ADE2、MEL1)的表达。因此可以认为与 EXO70A1
发生直接作用的区域主要是 ARC1 的 N-端结构域,
同时也证实了 Stone等[11]关于“芸薹属自交不亲和反
应的信号通路中, 在 ARC1 的下游有一潜在的底物,
发生 SSI 反应时, 该底物可能与 ARC1 的 N-端发生
相互作用”的推测。U-box结构域在真菌、植物与动
物中高度保守, 并且在发挥 E3泛素连接酶的 U-box
蛋白中不可缺少[21-22]。在 EXO70A1 未被发现以前,
Stone等[11]通过删除U-box或U-box区的保守脯氨酸,
均发现 ARC1 的泛素连接酶的活性丧失。因此可以
推测在 ARC1与 EXO70A1相互作用时, U-box是不
可缺少的结构域, 或者说, 与 EXO70A1发生直接作
用的核心区段应该是位于 ARC1中包含 U-box的 N-
端结构域, 这与前述 SRK 的胞内激酶域发生互作的
C-端臂重复区有所区别。
根据 Samuel等[14]的推测, ARC1催化 EXO70A1
泛素化反应。因此 , ARC1 的活性中心必然存有
EXO70A1的结合结构域和催化结构域, 其中结合结
构域决定 ARC1 与 EXO70A1 之间相互识别的特异
性, 相互识别的特异性越高, 结合结构域的保守性
就越高。进一步分析发现, 推导的 2种蛋白质(ARC1
和 EXO70A1)的序列在羽衣甘蓝及甘蓝型油菜中存
在诸多差异; 酵母双杂交系统检测发现两蛋白的序
列差异对互作并未产生影响, 其原因可能是发生变
异的氨基酸残基未能改变 ARC1 与 EXO70A1 之间
互作的互补界面, 或一些变异氨基酸残基对互补界
面构象的改变被另一些变异氨基酸残基对构象的改
变所补偿或抵消。
4 结论
两种芸薹属植物 ARC1 与 EXO70A1 之间的互
作证明了 ARC1 N-端结构域在其中的主要作用, 虽
然推导的 ARC1 蛋白的氨基酸残基在甘蓝型油菜和
羽衣甘蓝之间存在着差异, 但ARC1与 EXO70A1之
间的互作情况在这 2个物种内却是相似的。这表明, 尽
管同种蛋白质的氨基酸序列在漫长的进化过程中发
生了特定程度的变异, 但是发生相互作用的蛋白质之
间互作的核心界面在空间构象上存在较高的保守性。
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