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A Novel Quick Method for Detecting Target DNA Binding Sites of Protein

一种新的快速鉴定蛋白与靶DNA结合位点的方法



全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(12): 2167−2172 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育的重大专项(2008ZX08002-002, 2008ZX08002-005)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 陈明, E-mail: chenming@mail.caas.net.cn, Tel: 010-82108789
第一作者联系方式: E-mail: zhu326ming@163.com, Tel: 010-82108750
Received(收稿日期): 2011-04-18; Accepted(接受日期): 2011-07-25; Published online(网络出版日期): 2011-09-29.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110929.1551.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.02167
一种新的快速鉴定蛋白与靶 DNA结合位点的方法
朱 明 1,2 魏 伟 2,3 陈 明 2,* 张宪省 1 徐兆师 2 李连城 2 马有志 2
1 山东农业大学生命科学学院, 山东泰安 271018; 2 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 农业部作物遗传育种重点开放
实验室 / 中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081; 3 内蒙古农业大学农学院, 内蒙古呼和浩特 010018
摘 要: DREB 转录因子在植物逆境胁迫响应中起非常重要的作用, 对植物的生长发育起重要的调控作用。传统的
DNA酶 I足迹法应用同位素标记 DNA, 采用序列胶分离 DNase I酶切片段, 操作较复杂, 分辨率较低, 不适用于高通
量的样品检测。为阐明植物体内 DREB 转录因子的调控机制 , 本研究利用改进的 DNA 酶 I 足迹法(DNase I
foot-printing)结合凝胶阻滞法(electrophoretic mobility shift assay, EMSA), 选用荧光色素代替同位素标记, 毛细管电
泳技术代替序列胶检测 DNase I酶切片段, 判定 GmMYB1蛋白与 GmDREB3启动子 DNA结合的区域。采用限制性
内切酶酶切 GmDREB3启动子 DNA验证以上结果。同时, 在判定的 GmMYB1结合区域的基础上, 选择可能的 DNA
结合元件与 GmMYB1 进行 EMSA试验, 证明 GmMYB1 可以与相应元件结合。该方法比传统的 DNA酶 I 足迹法快
速、简便、准确并可靠, 作为一种高通量的鉴定方法可用于大规模鉴定蛋白质的 DNA结合位点。
关键词: DNA酶 I足迹法; EMSA; 毛细管电泳; 蛋白与 DNA互作
A Novel Quick Method for Detecting Target DNA Binding Sites of Protein
ZHU Ming1, 2, WEI Wei2, 3, CHEN Ming2, *, ZHANG Xian-Sheng1, XU Zhao-Shi2, LI Lian-Cheng2, and MA
You-Zhi2
1 College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China; 2 National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic
Improvement / Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding of Ministry of Agriculture / Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricul-
tural Sciences, Beijing 100081, China; 3 Agriculture College, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
Abstract: DREB (dehydration-responsive element-binding protein) transcription factors play important roles in the stress re-
sponse and regulation of plants growth and development. In traditional DNase I Foot printing, DNA probes is labeled with isotope
and then performed polyacrylamide gel electrophoresis to separate digested labeled-DNA fragments, which takes various steps,
with low differentiation rate and to detect fewer samples. To explore the mechanism of transcriptional regulation of DREB3 in
soybean, we used an improved DNase I Foot-printing method combining with EMSA (electrophoretic mobility shift assay) to
identify binding region of proteins and to find out the core element in binding site. In this research, DNA was labeled using fluo-
rescence instead of isotope and automated capillary electrophoresis polyacrylamide gel electrophoresis was replaced to detect
digested DNA fragments. Finally, DNA binding site of GmMYB1 with GmDREB3 promoter was identified rapidly via the modi-
fied DNase I Foot printing. On the other hand, restriction enzyme was used to validate this result. To further confirm binding ele-
ment in GmDREB3 promoter, we used a putative DNA binding element of GmMYB1 to complete EMSA, indicating that
GmMYB1 can bind target DNA element in vitro. In short, compared with classic DNase I Foot printing, the modified method is
more rapid, accurate and reliable, which will be advantageous as a high throughout method to largely identification of interaction
between protein and target DNA sites in the future.
Keywords: DNase I foot-printing; Electrophoretic mobility shift assay (EMSA); Capillary electrophoresis; Interaction between
protein and DNA
转录因子是植物体内重要的调控蛋白, 它通过
与目标 DNA序列结合激活或抑制下游基因的表达。
例如, 转录因子 SP1 和 SP3 可以结合转录调控区的
GC box, 调控下游基因, 在细胞增殖、分化、衰老和
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凋亡等过程中起重要的作用[1-2]。Ap-1属亮氨酸拉链
转录因子, 与其识别序列结合, 在纤维化基质特别
是胶原蛋白转录激活中发挥重要的调控作用[3]。分
析转录因子和 DNA 的相互作用是研究生物转录水
平调控机制的重要内容[4]。通常, 研究 DNA和转录
因子相互作用的方法主要有 DNA 酶 I 足迹法[5-6]、
凝胶阻滞实验(EMSA)[7]、甲基化干扰实验[8]、酵母
单杂交实验[9]和体内足迹实验[10]。DNA 酶 I 足迹法
是体外验证转录因子与 DNA 特定序列结合非常有
效的方法[11-12]。该技术不仅能反映蛋白特异性识别、
结合的 DNA 序列, 有时也可用于定量足迹法, 通过
测定结合后的聚合物的聚合和解离的速率来评价结
合力的大小[13-14]。其原理为 DNA某一区段与转录因
子特异结合后, 免受 DNase I 切割, 放射性自显影,
出现一个空白的区域, 就是DNA与转录因子结合的
区域。传统的 DNA酶 I足迹法需要经过同位素标记
探针, 蛋白与探针混合, 聚丙烯酰胺测序胶电泳分
离酶切片段 , 压片过夜 , 同位素检测 , 磷屏图像分
析等 , 操作较复杂 , 而且测序胶的分辨率较低 , 不
适用于大规模检测转录因子与 DNA结合区域。
来自大豆的 DREB3 转录因子调控抗逆相关的
基因表达, 在植物响应低温、干旱和高盐等胁迫的过
程中起着非常重要的作用[15]。GmMYB1蛋白是我们利
用酵母单杂交技术筛选到的可识别并与 GmDREB3基
因启动子DNA结合的转录因子, 本研究为了确定转
录因子 GmMYB1与 GmDREB3启动子 DNA的结合
序列, 对传统的 DNA 酶 I 足迹技术进行了改良, 采
用荧光(FAM)代替放射性同位素标记 DNA, 5′端标
记 FAM荧光的DNA片段可以很容易被测序仪(ABI)
3730XL 检测到[16], 改进的 DNA 酶 I 足迹技术省略
了聚丙烯酰胺测序胶电泳分离酶切片段, 压片过夜,
同位素检测, 磷屏图像分析等操作, 简便快速地确
定了GmMYB1与GmDREB3启动子DNA特异序列结
合的位点。实验结果证明, 改良后 DNA酶 I足迹技
术可准确快速高效检测转录因子与 DNA 的结合位
点。本研究通过对 GmMYB1 与 GmDREB3 启动子
DNA 结合的分析, 以期为转录因子和 DNA 的互作
研究提供一定的方法参考。
1 材料与方法
1.1 蛋白的诱导纯化
利用原核诱导表达技术[17], 摸索蛋白 GmMYB1
的最适表达条件, 即 0.4 mmol L–1 IPTG, 15℃低温诱
导过夜, 按蛋白纯化试剂盒(康为世纪公司)说明书
(Ni-Agarose凝胶纯化试剂盒, 货号 CW0010)纯化上
清液中表达的蛋白。
1.2 DNA片段的获得
实验中使用的 DNA片段、荧光引物由北京奥科
生物公司合成。改进的 DNA 酶 I 的足迹试验中的
D562片段来源于 GmDREB3启动子, EMSA实验中
使用的探针来源于 GmDREB3启动子 424~562 bp中
预测的可能的蛋白结合元件核心序列。DNA片段退
火条件是 : 100 μL 反应体系中含 Primer1 10 μL,
Primer2 10 μL, 10×buffer 10 μL, H2O 70 μL, 100 , 10 ℃
min自然冷却。采用寡核苷酸纯化试剂盒(北京天根生
物公司)纯化 DNA片段。DNA酶 I足迹法使用荧光引
物的 5′端由羧基荧光素(FAM)标记。以大豆 GmDREB3
启动子质粒为模板, Prime STAR HS高保真聚合酶扩
增 562 bp的 D562片段, 采用 PCR扩增产物纯化试剂
盒(北京天根生物公司)纯化 PCR 产物, 得到 5′端标记
FAM荧光的 D562片段。
1.3 改进的 DNA酶 I足迹法实验
参照 DNA酶 I足迹法的原理和方法[18], 改进和
优化传统的足迹实验方法, 减少时间、样品损失和程
序复杂性, 确定合适的蛋白与探针的比例为 100∶1~
1 000∶1, 此比例随 DNA和蛋白浓度的不同而变化。
DNase I的量为1 μL (约60~80 U)稀释1 000 ~10 000倍,
取 1~10 μL消化 D562片段。将 5′端荧光标记(FAM)
的探针 D562 与蛋白 GmMYB1 低温孵育, 在 Mg2+
催化条件下[19], DNase I 随机切割 D562 片段, 产生
5′端标记荧光的片段, 采用酚/氯仿抽提, 乙醇沉淀
进行纯化, 测序仪鉴别片段大小和丰度。根据 DNA
片段分布的区域判断 D562片段被 GmMYB1蛋白保
护的区域。本实验使用中国农业科学院重大工程楼
开放实验室的测序仪 3730XL (Applied Biosystems),
内标为 ROX500。
1.4 凝胶迁移率实验(EMSA)
参考分子克隆实验指南及 Fried和 Crothers的方
法[20-21], 采用 DNA 5′末端标记试剂盒(TaKaRa, 大
连)对目的片段进行 32P 标记, 将蛋白与不同的探针
以质量比 5 000~10 000∶1混合, 冰浴 0.5 h, 非变性
聚丙烯酰胺凝胶电泳, 溴酚蓝到达 2/3 位置时停止
电泳, 显示放射性自显影观察结果。
2 结果与分析
2.1 采用改进的 DNA酶 I足迹法检测 GmMYB1
与 GmDREB3启动子 DNA结合区域
首先将纯化后的 GmMYB1 蛋白(图 1)与 D562
片段(图 2)低温孵育, DNase I 随机消化, 酚/氯仿抽
第 12期 朱 明等: 一种新的快速鉴定蛋白与靶 DNA结合位点的方法 2169




图 1 纯化的 GmMYB1蛋白
Fig. 1 Purification of GmMYB1 protein
M: 蛋白 marker; 1: 纯化的 GmMYB1蛋白; 横线所示为目标蛋白。
M: protein marker; 1: purified GmMYB1; Line shows the target
protein.



图 2 GmDREB3启动子部分序列
Fig. 2 Partial sequence of GmDREB3 promoter
序列中斜体表示预测的蛋白与 DNA的结合位点, 粗体表示预测
的核心序列。
Italic and bold letters represent the putative sites of protein binding
with DNA and core element, respectively.

提, 乙醇沉淀, 获得纯化后的荧光 DNA 片段, 经测
序仪 3730XL (Applied Biosystems)分析, 结果表明,
未加保护蛋白GmMYB1的对照(图 3-A), 靶DNA被
均匀酶切成一系列大小不一的片段, 且片段的丰度
大体相同。在添加 GmMYB1蛋白后(图 3-B), 424~562
bp处未出现酶切后的片段, 说明此蛋白结合靶DNA,
保护了靶 DNA 片段的后半部分(424~562 bp)免遭
DNase I的切割, 初步证明 GmMYB1蛋白与靶 DNA
可以结合, 它们的结合区域在 424~562 bp区间。
2.2 用限制性内切酶验证以上结果
在荧光标记的 D562片段上选择 Xba I酶切位点
(位置大约在 463 bp 处)进行单酶切验证发现, 未添
加 GmMYB1蛋白(图 3-C)的对照, 靶 DNA上的 Xba
I酶切位点处出现了一个丰度很高的片段, 说明 Xba
I位点被酶切开; 添加 GmMYB1蛋白(图 3-D)后, 靶
DNA上的 Xba I位点没有被酶切开, Xba I酶切位点
处于保护状态, GmMYB1蛋白与靶DNA结合保护了
Xba I酶切位点不被酶切。这一结果验证了 GmMYB1
蛋白结合在 424~562 bp区域, 保护了DNA片段免遭
Xba I的酶切, 验证了改进的DNA酶 I足迹法测定结
果的可靠性。
2.3 用 EMSA方法进一步确定GmMYB1蛋白结
合的 DNA元件
在确定的GmMYB1蛋白与GmDREB3启动子结
合区域(424~562 bp)预测可能的结合元件, 采用 32P
标记该 DNA 结合元件后(表 1)与 GmMYB1 蛋白在
冰浴中结合, 非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳, 放射
性自显影完成 EMSA试验(图 4)。结果表明, GmMYB1
蛋白可与正常 DNA探针(表 1, MYB4)结合, 在突变
DNA 核心元件的前一部分 (表 1, mMYB3)和突变
DNA 核心元件的后一部分(表 1, mMYB2), 它们的
结合活性均减弱 ; 当 DNA 核心元件全突变(表 1,
mMYB1)时, DNA探针就丧失了与蛋白的结合活性。
表明此蛋白可与DNA探针在体外结合, 这一结果确
定了 GmMYB1 蛋白与 DNA 结合的元件, 同时验证
了改进的 DNA酶 I足迹法准确可靠。
3 讨论
DNA 酶 I 足迹法是鉴别蛋白和 DNA 特定序列
相互作用的传统方法, 它与 EMSA 方法联用, 可以
鉴定转录因子结合的启动子元件。目前广泛使用的
传统DNA酶 I足迹法需要使用同位素标记DNA, 费
时费力, 而且一般的研究机构不具备同位素的实验
条件 , 并且采用序列胶分析酶切片段分辨率不高 ,
实验条件难以摸索[22]。本实验采用 ABI 3730XL 测
序仪改进的 DNA 酶 I 足迹方法去验证 DNA 和蛋白
的互作关系, 以荧光标记取代同位素标记, 省时省
力, 并使不具备使用同位素条件的实验室也可以进
行 DNA酶 I足迹实验, 采用毛细管电泳的方法代替
序列胶的使用, 可以节约人力及物力, 使实验更加
简便易行。3730XL测序仪(Applied Biosystems)具有
强大的片段分析功能。实验中, DNA 片段的 5′端添
加了 FAM 荧光, 由于酶切后 DNA 分子大小不同,
在毛细管中电泳的迁移率不一致, 所以收集荧光信
号时可以凭借电泳的迁移率分辨出不同大小的片段,
再与荧光内标比较, 就可以准确地得出酶切后荧光
DNA分子从携带荧光的 5′端到酶切位点间的片段大
小, 这种方法不仅省时省力, 而且准确可靠。
改进的 DNA酶 I足迹法分析使用的是 96孔板,
2170 作 物 学 报 第 37卷



图 3 DNase I酶切后的 DNA片段经测序仪(3730XL)分析后的丰度图
Fig. 3 Abundance distribution of DNA digested by DNase I analyzed with 3730XL
A: 未加 GmMYB1蛋白保护的 DNA片段经 DNase I酶切后片段丰度图; B: 添加 GmMYB1蛋白保护的 DNA片段经 DNase I酶切后片
段丰度图; C: 未加 GmMYB1蛋白保护的 DNA片段经 Xba I酶切后片段丰度图; D: 添加 GmMYB1蛋白保护的 DNA片段经 Xba I酶
切后片段丰度图。
A: abundance distribution of the fragment digested by DNase I without protection of the GmMYB1; B:abundance distribution of the fragment
digested by DNase I with protection of the GmMYB1; C: abundance distribution of the fragment digested by Xba I without protection of the
GmMYB1; D: abundance distribution of the fragment digested by Xba I with protection of the GmMYB1.

表 1 GmMYB1蛋白的 EMSA分析所用探针
Table 1 Sequence of probe EMSA assay of GmMYB1 protein
探针名称
Probe name
探针序列
Probe sequence (5′−3′)
MYB4 TTTGTTGAAATTCTTAAATTTG
mMYB3 TCCTTTGAAATTCTTAAATTTG
mMYB2 TTTGCCTAAATTCTTAAATTTG
mMYB1 TAAAAAAAAATTCTTAAATTTG
序列中的斜体表示核心序列, 粗体表示突变碱基。
Italic and bold letters represent core sequence and mutated
bases, respectively.

一次可以同时进行 96个样品的处理, 可以对多个样
品进行平行处理, 高通量地分析蛋白质与DNA的结
合。样品反应时间依据片段大小不同而不同, 一般
500 bp片段需要 40~60 min, 改进后的足迹法从准备
到处理完成所需时间大约 3~4 h, 传统的足迹法需要
1~3 d 左右, 并且改进后的足迹法可以根据结果, 当
天进行条件的修改、调整。因此, 改进的 DNA 酶 I
足迹法具备高通量分析的条件, 有利于被用于大规
模分析蛋白质与DNA的结合区域, 可大幅度提高实


图 4 GmMYB1蛋白的 EMSA分析及所用探针
Fig. 4 Sequence of probe and the result of EMSA assay of
GmMYB1 protein
1: 蛋白+全突变探针; 2: 蛋白+后半部分突变探针; 3: 蛋白+前
半部分突变探针; 4: 蛋白+正常探针; 5: 自由探针。
1: protein+probe (full mutant); 2: protein+probe (partial mutant);
3: protein+probe (partial mutant); 4: protein+probe (wild type);
5: free probe.

验的效率。
改进的 DNA酶 I足迹法的反应体系中需要纯化
后的蛋白、DNA和 DNase I, 并且它们的使用量在一
第 12期 朱 明等: 一种新的快速鉴定蛋白与靶 DNA结合位点的方法 2171


定的比例范围内, 蛋白需要经过一次或多次纯化才
能达到所需要的纯度。一般情况下 , 蛋白相对于
DNA 是超量的(摩尔数之比在 100~1 000∶1), 反应
中使用的荧光引物一般 18~25 bp, Tm在 55~60 ,℃ 50%
GC, DNA片段一般 200~500 bp, 目标位点距离荧光
标记处至少 30 bp, 且尽量不靠近末端, 以免不被蛋
白或 DNase I识别。所用的 DNA片段必须经过纯化,
除去较小的片段、盐离子等杂质; DNase I消化的时
间随蛋白稳定性的变化而变化 , 时间越长 , 蛋白的
稳定性越低, 蛋白与 DNA 的结合越不稳定, 所以
DNase I 消化的时间不宜过长, 室温下一般 30~60 s;
冰浴下, 可适当延长时间, 本实验采用冰浴下, DNase I
消化处理 15 min; DNase I的浓度也需要根据实验经
验来确定, 不同的 DNA 片段或者同一 DNA 片段不
同制备时间所需的 DNase I 的浓度都可能有变化,
但是通常一般在 50 ng mL–1和 500 ng mL–1之间变动,
调整DNase I处理的温度和时间比调整DNase I的浓
度要更容易一些[23]。金属离子的存在对 DNase I 的
起作用是必需的[24], DNase I需要Ca2+和Mg2+参与才
能水解双链 DNA, Ca2+可以稳定 DNase I的结构, 附
近的 Mg2+可以催化 DNase I的水解功能[19], 所以试
验中一般会添加一定浓度的MgCl2/CaCl2, 本实验中
采用的浓度为 1.0~2.5 mmol L−1。通常 EMSA使用的
DNA 片段大于 20 bp, 核心序列距离片段末端至少
4 bp。直接合成的 DNA片段, 可以提高对于低亲和
力结合蛋白的检测[20]。
4 结论
改进的 DNA酶 I足迹法采用荧光色素代替同位
素标记, 毛细管电泳技术代替序列胶检测 DNase I
酶切片段, 快速、简便地判定了 GmMYB1 蛋白与
GmDREB3启动子 DNA结合的区域, 结果准确可靠,
作为一种高通量的鉴定方法可用于大规模鉴定蛋白
质的 DNA结合位点。
References
[1] Xue L-X(薛丽香), Weng M(翁默), Wu J-F(吴军峰), Zhang
Z-Y(张宗玉), Tong T-J(童坦君). Mechanism of transcription
regulation mediated by Sp1 and Sp3. Chin J Biochem Mol Biol
(中国生物化学与分子生物学报), 2006, 22(2): 106–110 (in
Chinese with English abstract)
[2] Verrecchia F, Rossert J, Mauviel A. Blocking sp1 transcription
factor broadly inhibits extracellular matrix gene expression in
vitro and in vivo: implications for the treatment of tissue fibrosis.
J Invest Dermatol, 2001, 116: 755–763
[3] Vergeer W P, Sogo J M, Pretorius P J, de Vries W N. Interaction
of Ap1, Ap2, and Sp1 with the regulatory regions of the human
pro-alpha1 (I) collagen gene. Arch Biochem Biophys, 2000, 377:
69–79
[4] Galas D J, Schmitz A. DNase footprinting: a simple method for
the detection of protein-DNA binding specificity. Nucl Acids Res,
1978, 5: 3157–3170
[5] Blanchette M, Schwikowski B, Tompa M. Algorithms for phy-
logenetic footprinting. J Comput Biol, 2002, 9: 211–223
[6] Rippe R A, Brenner D A, Tugores A. Techniques to measure nu-
cleic acid-protein binding and specificity: nuclear extract prepa-
rations, DNase I Footprinting, and mobility shift assays. Methods
Mol Biol, 2001, 160: 459–479
[7] Bannister A, Kouzarides T. Basic peptides enhance protein-DNA
interaction in vitro. Nucl Acids Res, 1992, 20: 3523
[8] Ochoa A, Brunel F, Mendelzon D, Cohen G N, Zakin M M. Dif-
ferent liver nuclear proteins bind to similar DNA sequences in the
5′ flanking regions of three hepatic genes. Nucl Acids Res, 1989,
17: 119–133
[9] Li J J, Herskowitz I. Isolation of ORC6, a component of the yeast
origin recognition complex by a one-hybrid system. Science,
1993, 262: 1870–1873
[10] Wang C-G(王成刚), Mo Z-H(莫志宏). Progress in methods to
study on the interactions between proteins and nucleic acids.
Chin Bull Life Sci (生命科学), 2006, 18(2): 195–198 (in Chinese
with English abstract)
[11] Galas D J, Schmitz A. DNase footprinting: a simple method for
the detection of protein-DNA binding specificity. Nucl Acids Res,
1978, 5: 3157–3170
[12] Bailly C, Kluza J, Martin C, Ellis T, Waring M J. DNase I foot-
printing of small molecule binding sites on DNA. Methods Mol
Biol, 2005, 288: 319–342
[13] Cardew A S, Fox K R. DNase I footprinting. Methods Mol Biol,
2010, 613: 153–172
[14] Hampshire A J, Rusling D A, Broughton-Head V J, Fox K R.
Footprinting: a method for determining the sequence selectivity,
affinity and kinetics of DNA binding ligands. Methods, 2007, 42:
128–140
[15] Chen M, Xu Z, Xia L, Li L, Cheng X, Dong J, Wang Q, Ma Y.
Cold-induced modulation and functional analyses of the
DRE-binding transcription factor gene, GmDREB3, in soybean
(Glycine max L.). J Exp Bot, 2009, 60: 121–135
[16] Zianni M, Tessanne K, Merighi M, Laguna R, Tabita F R. Identi-
fication of the DNA bases of a DNase I footprint by the use of
dye primer sequencing on an automated capillary DNA analysis
instrument. J Biomolec Tech, 2006, 17: 103–113
[17] Structural Genomics Consortium, China Structural Genomics
Consortium, Northeast Structural Genomics Consortium. Protein
production and purification. Nat Methods, 2008, 5: 135–146
[18] Connaghan-Jones K D, Moody A D, Bain D L. Quantitative
DNase footprint titration: a tool for analyzing the energetics of
protein-DNA interactions. Nat Protocols, 2008, 3: 900–914
2172 作 物 学 报 第 37卷

[19] Gueroult M, Picot D, Abi-Ghanem J, Hartmann B, Baaden M.
How cations can assist DNase I in DNA binding and hydrolysis.
Plos Comput Biol, 2010, 6: 1–11
[20] Sambrook J, Russell D. Molecular Cloning: a Laboratory Manual.
3rd edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,
2001. pp 1322–1336
[21] Fried M G, Crothers D M. Kinetics and mechanism in the reac-
tion of gene regulatory proteins with DNA. J Mol Biol, 1984, 172:
263–282
[22] Ellis T, Evans D A, Martin C R, Hartley J A. A 96-well DNase I
footprinting screen for drug-DNA interactions. Nucl Acids Res,
2007, 35: 1362–4962
[23] Sandaltzopoulos R, Becker P B. Solid-phase DNase I footprinting:
quick and versatile. Nucl Acids Res, 1994, 22: 1511–1512
[24] Pan C Q, Ulmer J S, Herzka A, Lazarus R A. Mutational analysis
of human DNase I at the DNA binding interface: implications for
DNA recognition, catalysis, and metal ion dependence. Protein
Sci, 1998, 7: 628–636