全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(2): 362368 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET-06-0106)，国家高技术研究发展计划(863计划)重大专项(2009AA101104)，教育部长江学
者和创新团队发展计划和高等学校学科创新引智计划(111-2-03)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 华金平, E-mail: jinping_hua@cau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: xgj15@163.com
Received(收稿日期): 2010-06-23; Accepted(接受日期): 2010-09-27.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00362
陆地棉两个同源基因 GhBlind的克隆与表达分析
熊冠军 1 徐 芹 1 华金平 1, 2, *
1 中国农业大学农学与生物技术学院, 北京 100193; 2中国农业大学 / 作物基因组学与遗传改良农业部重点开放实验室 / 杂种优势研
究与利用教育部重点实验室 / 作物遗传改良北京市重点实验室, 北京 100193
摘 要: Blind同源基因对植物株型调控起着重要作用。本研究用同源克隆策略, 在陆地棉(Gossypium hirsutum L.)腋
芽部位 cDNA中克隆出 2个 Blind同源基因 GhBlind1 (GenBank登录号为 HQ115643)和 GhBlind2 (登录号为 HQ115644)。
GhBlind1和 GhBlind2均由 3个外显子和 2个内含子组成, 分别编码 359个和 262个氨基酸残基。组织特异性表达分
析表明, GhBlind1 在腋芽部位和茎尖分生组织部位优势表达, 在根、叶、茎尖、幼嫩纤维表达, 而在茎部不表达;
GhBlind2 在腋芽部位以及根、茎、叶片、茎尖表达, 而在幼嫩纤维不表达。通过重组 PCR 技术, 构建表达载体
pSuper-gus-b1和 pSuper-gus-b2; 应用根癌农杆菌 EHA105介导转化棉花胚性愈伤组织进行瞬时表达分析。将棉花胚
性愈伤组织共培养 4 d后, 2个表达载体转化的胚性愈伤组织中均能检测到 GUS活性, 但 pSuper-gus-b2表达活性强
于 pSuper-gus-b1。对 Blind同源蛋白的保守结构域比对发现, GhBlind1和 GhBlind2与 Blind同源蛋白的一致性分别
达 94%和 91%。以Blind同源蛋白作为外参, 结合NCBI已公开的 23个棉花MYB蛋白构建系统发生树, 发现GhBlind1
和 GhBlind2与棉花大多数 MYB蛋白遗传距离较远, 和 Blind同源蛋白组成一个较小的分支。
关键词: 棉花; Blind; 同源克隆; 表达分析
Isolation and Expression Analysis of Two GhBlind Homologs in Upland Cotton
(Gossypium hirsutum L.)
XIONG Guan-Jun1, XU Qin1, and HUA Jin-Ping1,2,*
1 College of Agronomy & Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 2 Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and
Genome of Ministry of Agriculture / Key Laboratory of Crop Heterosis and Utilization of Ministry of Education / Beijing Key Laboratory of Crop
Genetic Improvement, China Agricultural University, Beijing 100193, China
Abstract: In higher plants, Blind homologs play an important role in plant architectures. Two Blind orthologs, GhBlind1 and
GhBlind2, were isolated from cDNA of the shoot apex of upland cotton (Gossypium hirsutum L.) by homologous cloning strategy.
GenBank accession number is HQ115643 for GhBlind1, and HQ115644 for GhBlind2. Similar to other Blind homologs, GhBlind1
and GhBlind2 were consisted of three exons and two introns, and encoded 359 and 262 amino acids, respectively. Based on the
RT-PCR analysis, it was found that GhBlind1 expressed in root, leaf, and tender fiber, and predominantly in shoot apical meristem
(SAM) and shoot apex, but not in stem; while GhBlind2 expressed in root, stem, leaf, SAM and shoot apex, but not in tender fiber.
Using recombinant PCR technology, expression vectors pSuper-gus-b1 and pSuper-gus-b2 were constructed and used for Agro-
bacterium-mediated transient expression by transformation of embryogenic callus of upland cotton cv. Coker 201. Histochemical
assays of GUS activity showed that after co-cultivation of embryogenic callus for four days, positive events were more obvious in
pSuper-gus-b2 than in pSuper-gus-b1. The alignments between GhBlind1, GhBlind2 and the domain of Blind homologs showed
the identities of 94% and 91%, respectively. The results of phylogenetic tree showed that GhBlind1 and GhBlind2 were geneti-
cally divergent from most of the other R2R3-MYB members in Gossypium hirsutum L. We speculated that GhBlind1 and
GhBlind2 are probably related with the development of lateral branch in upland cotton.
Keywords: Upland cotton; Blind; Homologous isolation; Expression profile
第 1期 熊冠军等: 陆地棉两个同源基因 GhBlind的克隆与表达分析 363


植物体内 MYB 蛋白组成了一个非常庞大的转录因
子家族。MYB 转录因子在植物体内具有广泛的生物学功
能, 几乎参与了植物发育与代谢的各个方面[1], 主要参与
特异表皮细胞的形成 , 植物苯丙烷类等次生代谢途径的
调节和调控植物对激素和环境信号的反应。
高等植物的绝大多数 MYB 蛋白属于 R2R3-MYB 亚
族[2]。该家族蛋白有高度的氨基酸保守性, 尤其是其独特
的平均分布且高度保守的色氨酸残基结构[3]。在空间结构
上, MYB 转录因子形成螺旋-转角-螺旋结构, 含 R1、R2
和R3等 3种亚结构。植物中R2R3-MYB基因数目众多, 目
前在杨树上发现了 192 个[1], 拟南芥有 126 个[4], 水稻有
84个[5], 玉米中至少有 80 个[6]。由于 R2R3-MYB 基因家
族控制众多的植物特异代谢过程, 推测 R2R3-MYB 家族
对植物进化起着重要作用[1,3]。
Blind基因属于R2R3-MYB基因家族, Blind同源基因
的功能主要表现在控制腋芽分生组织的形成。Schmitz
等[7]研究番茄 blind 突变体克隆出 Blind 基因。blind 突变
体在营养生长阶段不能产生腋芽分生组织 , 从而表现出
较少的腋芽。这种性状同拟南芥 rax (regulators of axillary
meristems)突变体的表型一致。拟南芥 Rax 基因是 Blind
同源基因, 目前共发现 Rax1、Rax2和 Rax3等基因, 且功
能有部分冗余[8]。Blind 同源蛋白在 N 端有 118 个氨基酸
高度保守[7-8]。因此, 从腋芽 cDNA 中可以克隆控制植株
形态的基因 [9]。基于同源克隆策略 , 本研究从棉花腋芽
cDNA中克隆出Blind两个同源基因GhBlind1和GhBlind2,
对其组织特异性表达和瞬时表达进行研究 , 并分析其进
化关系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
陆地棉(Gossypium hirsutum L.)品系 Z2, 短果枝, 株
型 紧 凑 , 选 自 08C8421, 系 谱 为 {DES-HAF16×(DES-
HAF227×[(沪 369×苘麻)F3]F2}F7, 引自湖北省农业科学院
经济作物研究所。
1.2 DNA和 RNA的提取
取苗期幼嫩新鲜叶片采用 CTAB法提取 DNA。分别
取三叶一心幼苗叶片、根、茎、茎尖鲜样; 进入开花期后,
取腋芽和开花后 3 d的幼嫩棉纤维组织鲜样, 参照张玉刚
等[10]的方法, 分别提取 RNA, 放入–70℃冰箱保存备用。
1.3 3-RACE (rapid-amplification of cDNA ends)
参照 Invitrogen 公司 3-RACE 试剂盒说明书设计接
头引物 3P、NP和 PP(表 1)。用接头引物 PP代替 Oligod(T)
引物, 参照 Promega公司说明书, 利用 Promega反转录酶
(M-MLV)合成 cDNA第一条链。RACE分 2轮 PCR, 均采
用 Touchdown PCR 方法扩增目标片段。其中第一轮扩增
产物稀释 50倍后作为第二轮的模板。
1.4 筛选文库
参照王志成等[11]的方法筛选 cDNA文库。采用 96孔
板法筛选阳性克隆。根据 TaKaRa生物公司 SMART cDNA
Library Construction Kit (Cat. No.634901)说明书构建陆地
棉“中 G5”苗期茎部 cDNA文库[12]。
1.5 引物设计及合成
利用软件 Primer Premier 5.0 设计引物(表 1)。用
DNAMAN 检测引物, 引物由上海生工生物工程技术服务
有限公司合成。
1.6 序列分析
应用软件 DNAStar 拼接序列, ClustalX 比对序列 ,
Blastn和 GeneDoc 2.7.0分析基因结构。
1.7 瞬时表达载体的构建
用引物 gus1、b1gus1和 b2gus1分别扩增质粒 PBI121
载体的 gus 基因, 质粒 PMD18-T-b1 的 GhBlind1 编码框
cDNA序列, 质粒 PMD18-T-b2的 GhBlind2编码框 cDNA
序列。DNA聚合酶为购自天根生化科技(北京)有限公司的
pfu DNA polymerase。分别将回收的 2个目标基因 cDNA
片段和回收的 gus基因混合作为模板, 不加引物进行 9个
循环的 PCR。然后吸取 5 μL作为模板, 分别加引物 gus1F
和 b1gus1R, gus1F 和 b2gus1R, 在正常 PCR 体系中扩增
21个循环。以 Pst Ι和 Kpn Ι双酶切 PCR产物和 Super1300
表达载体 , 连接并转化到大肠杆菌 DH5α, 分别命名为
pSuper-gus-b1和 pSuper-gus-b2。
1.8 根癌农杆菌 EHA105 介导的棉花胚性愈伤瞬时表达
以及 GUS染色
将构建好的载体质粒转化根癌农杆菌 EHA105。参照
鲁秀敏[13]的方法转化陆地棉珂字 201胚性愈伤组织。参照
Jefferson等[14]的方法, 进行组织化学染色。
1.9 MEGA 4.0构建系统发生树
基于已经公布的棉花 23 个 unigene 的蛋白序列和拟
南芥 AtRax1、AtRax2、AtRax3、番茄 SlBlind、Blind 同
源蛋白保守结构域 DOMAIN以及本研究克隆的 GhBlind1
和 GhBlind2, 用 Neighbor-Joining (NJ)方法构建系统发生
树, Bootstrap值为 1000。
2 结果与分析
2.1 GhBlind1和 GhBlind2完整序列的获得
将 NCBI中 Blind同源蛋白的 118个氨基酸保守结构
域[7-8]比对棉花 EST, 选择 DW491290.1和 DW519123.1分
别作为 Blind的同源基因 GhBlind1和 GhBlind2的 EST序
列, 它们和 Blind同源蛋白一致性高达 92%和 86%。利用
引物 bl3和 blb1分别扩增公布的 EST序列(表 1), 连接至
PMD18-T 并测序。将 EST 序列比对 Blind 同源蛋白, 发
现 GhBlind1 序列已经完全包含了 N 端序列, 而 GhBlind2
只包含了 N端部分序列。
通过 RACE (rapid-amplification of cDNA ends)方法
获得 GhBlind1 和 GhBlind2 基因 3端完整序列。对于
GhBlind1 基因, 以特异引物 BGSP3 和 BGSP2 分别和
cDNA 接头的 2 个巢式引物 3P 与 NP 组合 2 轮扩增腋芽
364 作 物 学 报 第 37卷

表 1 本试验所用到的引物序列
Table 1 Primers Used in the experiment
引物名称
Primer
name
引物序列
Primer sequence (5→3)
说明
Explanation

3P GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG 3RACE接头引物
The adaptor for 3RACE
Actin(F) ATTGTGAGCAACTGGGATGA
Actin (R) GAGTGTGGCAGGGGTAGATG
RT-PCR内标
Internal check for RT-PCR
b1gus1(F) ACTAGTGGATCCCCGCGGATGGGTCGAGCTCCTTGCTGTGA
b1gus1(R) GGGGTACCCCATATCTTTGTCTCTTGCTAC
扩增 GhBlind1编码框构建表达载体 pSuper-gus-b1
Amplifying the CDS of GhBlind1 for pSuper-gus-b1
b2gus1(F) ACTAGTGGATCCCCGCGGATGGGAAGAGCTCCTTGTTGT
b2gus1(R) GGGGTACCCCAAACACCCGAATTGTCA
扩增 GhBlind2编码框构建表达载体 pSuper-gus-b2
Amplifying the CDS of GhBlind2 for pSuper-gus-b2
BB2 GCTGGATCAGTTCTCCAATCACAG GhBlind2第二轮 RACE特异引物
Gene-specific primer for the second RACE of GhBlind2
BB3 CATGGTTCCTCATAGCTATTCCTCG GhBlind2第一轮 RACE特异引物
Gene-specific primer for the first RACE of GhBlind2
BGSP2 CAACTGCCTGGAAGAACTGATAATG GhBlind1第二轮 RACE特异引物
Gene-specific primer for the second RACE of GhBlind1
BGSP3 CATTAAGCATGGTGGATTCTCTGAG GhBlind1第一轮 RACE特异引物
Gene-specific primer for the first RACE of GhBlind1
bl3(F) GGTCACCTGAAGAAGATGCT
bl3(R) GCTAAGTTACTCAAACCCTGA
扩增 GhBlind1的 EST序列
Amplifying the EST of GhBlind1
blb1(F) AAGCATTGGTAGCAGGTG
blb1(R) GCTGGTTAGTTCCCTCTAT
扩增 GhBlind2的 EST序列
Amplifying the EST of GhBlind2
blb4(F) AGCAGCTCTTGTTTTCT
blb4(R) AAACACCCGAATTGTCA
扩增 GhBlind2基因全长
Amplifying the GhBlind2
blq2(F) TTCCTTTGCCTTGAAGA
blq2(R) ATATCTTTGTCTCTTGCTAC
扩增 GhBlind1基因全长
Amplifying the GhBlind2
gus1(F) AACTGCAGAACCAATGCATTGGCAGTCCCTTATGTTACGTCCTG
gus1(R) CCGCGGGGATCCACTAGTTTGTTTGCCTCCCTGCTGCGG
扩增 gus基因构建 GUS融合基因
Amplifying the CDS of gus for GUS gene fusion system
NP CGCTACGTAACGGCATGACAGTG 3RACE接头巢氏引物
The nested primer of adaptor for 3RACE
P1 CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT cDNA文库 5接头引物
5 adaptor primer in cDNA library
PP GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18 反转录合成 cDNA的引物
Inverse transcription for cDNA

cDNA, 获得一条长 855 bp 特异条带 (图 1)。同样地 ,
GhBlind2 基因特异引物 BB3 和 BB2 分别组合 3P 与 NP
进行 2轮 PCR, 获得一条 550 bp特异条带(图 1)。测序后
与已知 EST序列拼接。比对 Blind同源蛋白分析全序列发
现 , GhBlind1 序列已经包含了完整的 CDS (coding se-
quence), 而 GhBlind2基因的 5端不完整。
筛选 cDNA文库获得 GhBlind2基因的 5端序列。以
GhBlind2 基因特异引物 blb1 筛选中 G5 苗期茎部 cDNA
文库[12]。筛选三轮后, blb1在茎 cDNA克隆中扩增的非特
异带非常少(图 2)。选择扩增效果较好的阳性克隆, 利用
cDNA文库 3接头引物 P1和 blb1R组合扩增 GhBlind2的
5序列。回收扩增产物, 连接至 PMD18-T, 测序发现, 一
段 825 bp的序列能够和已知的 GhBlind2部分序列进行拼
接, 该序列已经包含了 GhBlind2 基因完整的 CDS。至此
获得了 2个基因的 DNA和 cDNA序列。
进一步分析了 GhBlind1 和 GhBlind2 的基因结构。
GhBlind1编码框的 DNA和 cDNA序列长度分别为 1 398
bp和 1 080 bp, 编码 359个氨基酸残基。GhBlind2对应的
长度分别为 1 017 bp和 789 bp, 编码 262个氨基酸残基。
2个基因都是由 3个外显子和 2个内含子组成。其中 2个
内含子都分布在保守结构域内部 , 且第一个内含子出现
在编码区的 136个碱基之后, 第二个内含子出现在 266个
第 1期 熊冠军等: 陆地棉两个同源基因 GhBlind的克隆与表达分析 365


碱基之后 , 但内含子序列并不保守。这和目前所克隆的
Blind同源基因的结构完全一致(图 3)。



图 1 3 RACE获得的 GhBlind1和 GhBlind2 3序列
Fig. 1 3 end sequences of GhBlind1 and GhBlind2 obtained by
3 RACE
A和 B分别为 GhBlind1的第一轮和第二轮 RACE; C和 D分别为
GhBlind2的第一轮和第二轮 RACE。
A and B: the first and the second RACE of GhBlind1; C and D: the first
and the second RACE of GhBlind2.
M1: D2000 plus marker; M2: D2000 marker.
利用软件 SubLoc v1.0 对蛋白亚细胞定位进行预测,
结果表明, GhBlind1和 GhBlind2均位于细胞核内(可信度
均为 91%)。这与 Blind 行使转录因子功能的结果一致。
尽管 GhBlind1 和 GhBlind2极可能是同源基因, 但蛋白序
列只是在 N 端保守。比较 GhBlind1、GhBlind2、番茄
SlBlind (GenBank登录号为 AAL69334)、拟南芥 AtRAX1
(登录号为 NP_197691.1)、 AtRAX2 (登录号为 NP_
181226.1)、AtRAX3 (登录号为 NP_190538.1)、AtMYB87
(登录号为 NP_195492.2)、水稻 OsBlind (登录号为 EAY
91994.1)、高粱 SbBlind (登录号为 XP_002446179.1)、杨
树 PtBlind (登录号为 XP_002322912.1)、葡萄 VvBlind (登
录号为 XP_002266801.1)以及 Blind 同源蛋白的保守结
构域 DOMAIN[7-8], 发现它们同源性非常高 (图 4)。将
GhBlind1 和 GhBlind2 比对 Blind 同源蛋白的 118 个氨基
酸结构域, 一致性分别达到了 94%和 91%。结合它们的基
因结构, 我们推测 GhBlind1 和 GhBlind2 极可能是 Blind
的同源基因。



图 2 特异引物 blb1筛选文库以及利用引物 P1和 blb1R组合扩增 GhBlind2的 5序列
Fig. 2 Screening cDNA library using gene-specific primer blb1 and obtaining the 5 end sequence of GhBlind2 by amplifying screened cDNA
clones with combined primers P1 and blb1R
A、B和Ｃ分别为 blb1引物第一轮, 第二轮, 第三轮筛选文库的结果; Ｄ为引物 P1和 blb1R组合扩增 cDNA阳性克隆。
A, B, and C: the cDNA library was screened in the first, second and third cycles; D: the screened cDNA clones were amplified with combined primers
P1 and blb1R. M1: D2000 marker, M2: D2000 plus marker.



图 3 Blind同源基因结构
Fig. 3 Exon-intron structures of the Blind homologs
细线代表 DNA水平结构, 折线表示内含子, 粗线表示转录产物, 方
框表示编码区, 其中阴影部分表示保守结构域。各种图形长度大致
代表了相应区域的序列长度。
The DNA structure of homolog genes. The transcription regions are
illustrated by the bold line, the coding regions are shown by boxes, and
the conserved domains shown in gray. The length of all shapes ap-
proximately stands for length of the corresponding regions except the
introns because of the diversity.

2.2 组织特异性表达和瞬时表达
对棉花腋芽、叶片、根、茎、SAM 以及纤维 cDNA
进行 RT-PCR。发现 GhBlind1在根、叶片、腋芽、茎尖分
生组织和幼嫩纤维中有所表达 , 而且在腋芽和茎尖优势
表达, 但在茎部位不表达; GhBlind2在根、叶片、腋芽、
茎尖分生组织和茎部表达, 且表达量差异不大, 而在幼嫩
纤维不表达(图 5)。
对质粒 PMD18-T-b1、PMD18-T-b2和 PBI121分别进
行 PCR获得 1 124、956和 1 858 bp的条带。构建的 gus-b1
和 gus-b2融合基因全长分别为 2 964 bp和 2 796 bp (图 6)。
连接至 Super1300 载体构建成载体 pSuper-gus-b1 和
pSuper-gus-b2。
在陆地棉珂字 201胚性愈伤组织中 pSuper-gus-b2表
达活性强于 pSuper-gus-b1。由根癌农杆菌 EHA105 介导
pSuper-gus-b1 和 pSuper-gus-b2 转化棉花胚性愈伤组织。
将侵染棉花珂字 201 胚性愈伤组织共培养 4 d, 经组织化
学染色 1 d后, 在 pSuper-gus-b2转化的胚性愈伤组织中能
检测到 GUS活性, 但是 pSuper-gus-b1却在染色 4 d后才
能在显微镜下检测到 GUS活性。
2.3 棉花 MYB蛋白系统发生树分析
NCBI目前公布了棉花 R2R3-MYB共 23个 Unigene。
它们大多参与棉纤维发育过程。结合 GhBlind1、GhBlind2、
番茄 SlBlind、拟南芥 AtRax1、AtRax2、AtRax3 及它们
的保守结构域 DOMAIN, 利用蛋白序列构建系统发生树
366 作 物 学 报 第 37卷



图 4 部分 Blind蛋白保守结构域氨基酸序列比对
Fig. 4 Amino acid alignment of GhBlind with Blind proteins from Arabidopsis, rice, poplar, sorghum, tomato, grape, and cotton



图 5 GhBlind1和 GhBlind2 的 RT-PCR结果
Fig. 5 RT-PCR of GhBlind1 and GhBlind2
R: 根; L: 叶; Lb: 腋芽; SAM: 茎尖分生组织; St: 茎; F: 幼嫩纤维。
R: root; L: leaf; Lb: lateral bud; SAM: shoot apical meristem; St: stem;
F: tender fiber.

(图 7)。这些 R2R3-MYB蛋白可分为 3个主要的分支, 其
中 GhBlind1和 GhBlind2与目前公布的棉花大多数 R2R3-
MYB蛋白距离较远, 但与番茄 SlBlind、拟南芥 AtRax1、
AtRax2、AtRax3及它们的保守结构域 DOMAIN共同组成一
个分支。棉花 2个 GhBlind同源蛋白分化时间较长。在一定
程度上, 进化树反映了功能的相关性[15]。
3 讨论
控制植物侧枝发育的基因在高等植物中非常保
守[16-17]。Blind 基因是研究较早的调控植物侧枝发育的一
类基因。本研究基于同源克隆的策略, 从棉花腋芽 cDNA
部位克隆 2 个 Blind 同源基因, 以期研究调控棉花侧枝发
育相关的基因, 从而调控棉花株型结构。对于基因组大,
尚未完成基因组测序的物种, 采用同源克隆的方法研究重



图 6 载体 pSuper-gus-b1和 pSuper-gus-b2
Fig. 6 Vector construction of pSuper-gus-b1 and pSuper-gus-b2
A、B和 C: 扩增质粒 PMD18-T-b1、PMD18-T-b2和 PBI121获得的目标片段; D和 E: 融合基因 gus-b1和 gus-b2; F和 G: pSuper-gus-b1和
pSuper-gus-b2双酶切; M1为 D2000 plus marker; M2为 1 kb ladder。
A, B, and C: amplifying product of plasmid PMD18-T-b1, PMD18-T-b2 and PBI121; D, E: the fusion gene gus-b1 and gus-b2; F, G: the recombination
plasmids pSuper-gus-b1 and pSuper-gus-b2 verified by double digestion; M1: D2000 plus marker; M2: 1 kb ladder.
第 1期 熊冠军等: 陆地棉两个同源基因 GhBlind的克隆与表达分析 367




图 7 棉花 R2R3-MYB 蛋白进化树分析
Fig. 7 Phylogenetic tree analysis of the R2R3-MYB from Gossypium hirsutum and Blind homologs from other plants
进化树表明棉花 R2R3-MYB成员和其他 Blind蛋白的关系。分支长度代表它们之间的亲缘关系, 即氨基酸的差异数。
The phylogenetic tree showed the relationship between the members of the R2R3-MYB in cotton and other Blind homologs. The length of each branch
indicated the different number of amino acids in respective sequence.

要功能基因是一种可行的方法。本研究利用 Blind 同源蛋
白的保守结构域, 比对 NCBI 高相似度的 EST 序列, 获得
棉花 2条候选的 EST。尽管这 2条 EST和 Blind保守蛋白
序列一致性比较高(分别为 92%和 86%), 但在保守结构域
的 DNA水平上, 却很难发现有如此高的一致性的序列。
GhBlind1和 GhBlind2都具备 3个外显子和 2个内含
子结构, 其中 2 个内含子都位于保守结构域内部, 且第一
个内含子出现在编码区的 136个碱基之后, 第二个内含子
出现在 266个碱基之后。这种保守结构在 NCBI公布的所
有 Blind同源基因中无一例外地表现出来。从系统发生树
的分支长度可以看出, Blind同源蛋白分化时间较长。尽管
不同的物种都经历了漫长的进化过程 , 但这种基因结构
都在选择过程中保留了下来, 推测 Blind 同源基因的内含
子可能影响基因功能, 也可能与调控相关。
GhBlind1 和 GhBlind2 极有可能是 Blind 的同源蛋
白[18]。GhBlind1蛋白和 GhBlind2蛋白分别由 359个和 262
个氨基酸组成。GhBlind1 和 GhBlind2 与 Blind 同源蛋白
保守结构域的一致性分别达到了 94%和 91%。拟南芥中
和 Blind蛋白相似度在 76%以上且在腋芽部位表达的基因
全部被证实为 Blind的同源基因[8]。结合瞬时表达的结果,
GhBlind1和 GhBlind2极有可能在棉花中表达。因此推测
GhBlind1和 GhBlind2可能调控棉花侧枝的发育。
R2R3-MYB基因对植物的进化起着重要作用。它的功
能覆盖了植物生长发育的多个方面。因此, 将 R2R3-MYB
基因的表达模式和进化关系结合起来 , 更有助于研究其
功能。目前已公布的棉花 R2R3-MYB基因大多是与棉纤维
发育相关, 尤其是 GaMYB2[19]。GhBlind1 和 GhBlind2 在
腋芽部位表达量高, 而在纤维不表达或者表达量很低。这
说明二者的功能与已经公布的棉花大多数 R2R3-MYB 基
因可能有较大差异。从进化树的关系我们也印证了这一
点。进化树分支的远近不仅反映了亲缘关系的远近, 在一
定程度上, 还反映了功能的相关性。
References
[1] Wilkins O, Nahal H, Foong J, Provart N J, Campbell M M. Ex-
pansion and diversification of the populus R2R3-MYB family of
transcription factors. Plant Physiol, 2009, 149: 981–993
[2] Kranz H D, Denekamp M, Greco R, Jin H, Leyva A, Meissner R,
Petroni K, Urzainqui A, Bevan M, Martin C, Smeekens S, Tonelli
C, Paz-Ares J, Weisshaar B. Towards functional characterisation
of the members of the R2R3-MYB gene family from Arabidopsis
thaliana. Plant J, 2001, 16: 263–276
368 作 物 学 报 第 37卷

[3] Jin H, Martin C. Multifunctionality and diversity within the plant
MYB-gene family. Plant Mol Biol, 1999, 41: 577–585
[4] Stracke R, Werber M, Weisshaar B. The R2R3-MYB gene family
in Arabidopsis thaliana. Curr Opin Plant Biol, 2001, 4: 447–456
[5] Jiang C, Gu X, Peterson T. Identification of conserved gene
structures and carboxy-terminal motifs in the Myb gene family of
Arabidopsis and Oryza sativa L. ssp. indica. Genome Biol, 2004,
5: R46.1R46.11
[6] Rabinowicz P D, Braun E L, Wolfe A D, Bowen B, Grotewold E.
Maize R2R3 Myb genes: sequence analysis reveals amplification
in the higher plants. Genetics, 1999, 153: 427–444
[7] Schmitz G, Tillmann E, Carriero F, Fiore C, Cellini F, Theres K.
The tomato Blind gene encodes a MYB transcription factor that
controls the formation of lateral meristems. Proc Natl Acad Sci
USA, 2002, 99: 1064–1069
[8] Muller D, Schmitz G, Theres K. Blind Homologous R2R3 Myb
genes control the pattern of lateral meristem initiation in Arabi-
dopsis. Plant Cell, 2006, 18: 586–597
[9] Liang D, Wong C E, Singh M B, Beveridge C A, Phipson B,
Smyth G K, Bhalla P L. Molecular dissection of the pea shoot
apical meristem. J Exp Bot, 2009, 60: 4201–4213
[10] Zhang Y-G(张玉刚), Cheng J-H(成建红), Han Z-H(韩振海), Xu
X-F(许雪峰), Li T-Z(李天忠). Comparison of methods for total
RNA isolation from Malus Xiaojinensis and cDNA LD-PCR am-
plification. Biotechnol Bull (生物技术通报), 2005, (4): 50–53 (in
Chinese with English abstract)
[11] Wang Z-C(王志成), Jiang J-X(蒋建雄), Zhong J(钟军), Yi
Z-L(易自力), Liu Q-B(刘清波). Rapid isolation of full-length
cDNA sequence from Gossypium hirsutum fiber cDNA library by
PCR. J Hunan Agric Univ (湖南农业大学学报), 2005, 31(3):
272–275 (in Chinese with English abstract)
[12] Guo X-Y(郭晓燕). Screening of the Differentially Expressed
Genes under Salt Stress in Cotton by Microarray and Construc-
tion of the Full Length cDNA Library. MS Dissertation of China
Agricultural University, 2010 (in Chinese with English abstract)
[13] Lu X-M(鲁秀敏 ). Development of an Efficient Agrobacte-
rium-Mediated Transformation System of Cotton Embryogenic
Cultures and Generation of Transgenic Cotton with AFP-SPCEMA
Genes. MS Dissertation of Southwest Agricultural University,
2003 (in Chinese with English abstract)
[14] Jefferson R A, Burgess S M, Hirsh D. β-Glucuronidase from Es-
cherichia coli as a gene-fusion marker. Proc Natl Acad Sci USA,
1986, 83: 8447–8451
[15] Khuri S, Bakker F T, Dunwell J M. Phylogeny, function, and
evolution of the cupins, a structurally conserved, functionally di-
verse superfamily of proteins. Mol Biol Evol, 2001, 18: 593–605
[16] Schmitz G, Theres K. Genetic control of branching in Arabidop-
sis and tomato. Curr Opin Plant Biol, 1999, 2: 51–55
[17] Wang Y, Li J. Genes controlling plant architecture. Curr Opin
Biotech, 2006, 17: 123–129
[18] Marcotte E M, Pellegrini M, Thompson M J, Yeates T O,
Eisenberg D. A combined algorithm for genome-wide prediction
of protein function. Nature, 1999, 402: 83–86
[19] Wang S, Wang J, Yu N, Li C, Luo B, Gou J, Wang L, Chen X.
Control of plant trichome development by a cotton fiber MYB
gene. Plant Cell, 2004, 16: 2323–2334