全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(3): 412−417 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30170501)，国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2003AA207051)，国家转基因生物新品种培育重大专项
(2008ZX08005-003)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 王坤波, E-mail: wkbcri@cricaas.com.cn
第一作者联系方式: E-mail: pengrhay@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2008-10-13; Accepted(接受日期): 2009-01-06.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00412
适用于棉花荧光原位杂交的 DNA纤维高效制备技术
彭仁海 1,2 宋国立 1 刘 方 1 黎绍惠 1 王春英 1 张香娣 1 王玉红 1
王坤波 1,*
1 中国农业科学院棉花研究所 / 农业部棉花遗传改良重点实验室, 河南安阳 455000; 2 安阳工学院生物与食品工程学院, 河南安阳
455000
摘 要: 棉花富含酚类和多糖等高分子次生化合物, 细胞质浓厚, 且染色体形态小、数目多、制片困难, 至今还未见
棉花 DNA纤维制备方面的报道。本研究用“刀切引流法”, 在含有 Triton X-100和 PVP40的冰冷细胞核提取缓冲液
中, 用锋利的刀片切割发育一周的棉花黄化子叶以释放棉花细胞核, 所得细胞核干净完整杂质少, 不需要研磨和巯
基乙醇等处理, 方便快捷无毒害, 成功率达到 100%。细胞核在室温下经温和碱裂解去除染色质上的蛋白质后, 以前
端导引裂解液铺展载玻片, 即“引流法”拉伸制备 DNA 纤维, 避免了液体表面张力的影响, 消除了因载玻片推抹用
力不均而导致的 DNA 纤维堆积和断裂, 所制备的 DNA 纤维平直完整、伸展程度均匀、背景清晰。用基因组和 45S
rDNA分别标记探针进行杂交, 结果表明所制备的棉花 DNA纤维适用于荧光原位杂交。本研究探索出一套简单、高
效、快捷、无毒害的适宜于棉花荧光原位杂交的 DNA纤维制备技术, 必将为棉花基因组研究和全基因组序列的最终
完成提供强有力的技术支持。
关键词: 棉花; 荧光原位杂交; DNA纤维; 高效制备
An Efficient Method of Cotton DNA Fibers Preparation for FISH
PENG Ren-Hai1,2, SONG Guo-Li1, LIU Fang1, LI Shao-Hui1, WANG Chun-Ying1, ZHANG Xiang-Di1,
WANG Yu-Hong1 and WANG Kun-Bo1,*
1 Key Laboratory of Cotton Genetic Improvement, Ministry of Agriculture / Cotton Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Anyang 455000, China; 2 College of Biology and Food Technology, Anyang Institute of Technology, Anyang 455000, China
Abstract: Fluorescence in situ hybridization (FISH) has become the most important technique applied in molecular cytogenetics,
especially in developing physical maps in plants. As a key technique, FISH on cotton DNA fibers stretched has not been reported
yet, possibly owning to the difficulty in their DNA fiber preparation as well as the existence of thick cytoplasm and hard cell walls.
Here we present a method of highly efficient preparation of stretched DNA fibers in cotton. Cotton cotyledons germinated in dark
moisture chamber for one week were chopped with a sharp sterile scalpel in a Petri dish that contained ice-cold nucleus isolation
buffer (MgSO4 10 mmol L−1, KCl 5 mmol L−1, HEPES 0.5 mmol L−1, DTT 1 mg mL−1, Triton X-100 0.25%, PVP40 2%) followed
by sequential filtration through 100, 50, and 30 μm nylon meshes. Nuclei were obtained by centrifuging the filtrates at 16 000× g
for 1 min. Mixture of nucleus lysis buffer(0.5% SDS, 5 mmol L-1 EDTA, 100 mmol L−1 Tris, pH 7.0) and nuclei was incubated on
the slide for 9 min, DNA fibers obtained by dragging and stretching with a clean slide edge from the end to another end on the
liquid surface. After incubated at 60℃ overnight, the slides were pretreated with DNase-free RNase and then rinsed in 2×SSC.
The probes and DNA fibers were denatured separately, and hybridization mixture was incubated on the slide overnight, followed
by post-hybridization rinses in 2×SSC, 1×4T. The slides were blocked with 5% BSA and covered with antibody for 1h. After
rinsed with 1×TNT the slides were counterstained with 4’,6-diamidino-2-phenylin-dole (DAPI) and followed by rinsing in 1×PBS.
After mounting the slides with Vectashield mounting medium the hybridization signals were observed under a fluorescence mi-
croscope. Images were captured by a charge-coupled device (CCD) system and brought together to make the plate using Adobe
Photoshop 7.0 software. The results indicated that it was easier to release nuclei from cells in nucleus isolation buffer by chopping
cotyledon, and slowly and smoothly dragging the nuclei solution with a slide edge from the end to another end on slide treated
第 3期 彭仁海等: 适用于棉花荧光原位杂交的 DNA纤维高效制备技术 413


with poly-L-lysine. Highly stretched and intact DNA fibers were obtained. This method is very simple and rapid, which takes only
30 min to finish the entire process, and it is also safe because poisonous mercaptoethanol is replaced by dithiothreitol. The linear
or near-linear stretches of beads on-a-string signals with cotton genomic DNA and 45S rDNA as probes showed that the DNA
fibers were suitable for FISH.
Keywords: Cotton; FISH; DNA fibers; Efficient preparation
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,
FISH)是一种非放射性原位杂交技术 , 因其具有直
观、安全可靠、灵敏度高、可放大信号、定量或非
定量分析等优点, 在高度或中度重复 DNA 序列的鉴
定、低或单拷贝 DNA 序列及遗传标记的物理定位、
异源染色质和非整倍体的鉴定、染色体物理图的构
建、比较基因组研究、物种进化、转基因检测等方
面得到广泛的应用。其中 DNA纤维荧光原位杂交技
术(DNA fiber-FISH)具有分辨率高、直观、准确等特
点而成为基因组测序中不可替代的技术[1]。主要用
于分析重叠克隆群[2]、检测染色体重排[3]、判断基因
间距离和基因长度[4]、估算 gap 的大小、测量 DNA
位点的大小 [5-7]并最终加速图位克隆 [8]。然而 , 自
Fransz等[9]从番茄和拟南芥中制备出 DNA纤维进行
荧光原位杂交后, 该技术只在很少几种植物中得到
应用 [10-13], 主要是植物有细胞壁, 而且多含有次生
代谢物质, 植物的 DNA纤维制备技术还很不成熟。棉
花基因组研究发展很快, 包括基因组测序已进入实
质性程序[14-16]。所以, 探索棉花 DNA纤维的荧光原
位杂交技术, 对于棉花分子细胞遗传学和基因组学
等方面的研究均有重要意义。
棉花富含酚类和多糖等高分子次生化合物, 细
胞质浓厚, 且染色体形态小、数目多, 制片更加困
难, 致使棉花 FISH研究滞后于水稻、玉米和小麦等作
物[17-22]。近年来的棉花荧光原位杂交研究主要集中
于有丝分裂中期染色体和减数分裂染色体[23-32], 至
今还未见棉花 DNA纤维制备方面的报道。本研究借
鉴 Li 等[33]制备水稻等植物 DNA 纤维技术, 结合棉
花的特性, 探索出一套高效的适宜于棉花荧光原位
杂交的DNA纤维制备方法, 为棉花基因组学研究和
全基因组测序提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
二倍体的亚洲棉品种石系亚 1 号, 来自中国农业
科学院棉花研究所。45S rDNA 探针由美国 Cornell
大学的戴丝兰和吴瑞博士提供。实验试剂 HEPES购
自 Amresco公司, DTT购自 Bio Basic Inc., Triton X-
100、SDS购自 Sigma公司, DAPI购自 Roche公司,
EDTA购自 Solarbio, Tris购自 Bio Basic Inc, 其他均
为国产分析纯试剂。
1.2 黄化子叶的准备
细沙经水煮消毒后晾至紧握成团和松手即散的
程度。棉花种子经约 37℃的温水中浸种 12~24 h, 播
种于细沙中, 30℃恒温暗室培养 2~3 d后即长出幼嫩
黄化的子叶来。
1.3 细胞核的提取
取 2 g发育 1周的幼嫩黄化子叶, 立即置冰上直
径 5 cm 的培养皿中, 加 12.5 mL 细胞核提取液
(MgSO4 10 mmol L−1, KCl 5 mmol L−1, HEPES 0.5
mmol L−1, DTT 1 mg mL−1, Triton X-100 0.25%,
PVP40 2%), 用消毒无菌的锋利刀片将子叶切成细小
颗粒制成悬浮液, 分别以孔径为 170、100、50和 30
μm 的尼龙膜过滤(所有操作需在冰上完成)。4℃下
离心(16 000×g) 40 s, 除去上清液, 将沉淀物悬浮在
125 μL的细胞核贮存液中(MgSO4 10 mmol L−1, KCl
5 mmol L−1, HEPES 0.5 mmol L−1, DTT 1 mg mL−1),
取其 1 μL用 DAPI染色, 在荧光显微镜下检查细胞
核的浓度, 理想的浓度为每毫升 5×106个细胞核。细
胞核悬浮液可在 50%的甘油中–20℃保存数月。
1.4 DNA纤维的制备
载玻片在 5 mol L-1HCl中煮沸 2~3 h, 经双蒸水
冲洗后空气干燥, 再经过滤的 1×10-6 g mL−1的多聚
赖氨酸(MW=30 000)浸没过夜, 冲洗干净, 备用。取
1 μL 细胞核悬浮液, 置经多聚赖氨酸处理的载玻片
A 的一端, 用枪头轻轻均匀地往返涂使悬浮液成平
行于载玻片短边的一条线, 空气中室温下晾约 3~5
min至半干。在其上覆盖 30 μL 细胞核裂解液(0.5%
SDS, 5 mmol L−1 EDTA, 100 mmol L−1 Tris, pH 7.0),
室温温育 9 min。取另一洁净载玻片 B, 令其一端边
沿轻轻接触细胞核裂解液, 将 A 载玻片涂有细胞核
的一端提起, 慢慢使之与桌面成 45º角, 同时令载玻
片 B拉着悬浮液涂抹整个载玻片 A, 游离的 DNA便
会形成平行的 DNA纤维。空气干燥 10 min后, 在卡
诺液中固定 2 min, 60℃烘干 30 min, 立即使用, 或
4℃存放 5~7 d。
1.5 荧光原位杂交(FISH)
1.5.1 制片准备 制片在 60℃烘箱中干燥过夜,
414 作 物 学 报 第 35卷

用 100 μg mL−1的 Rnase A (2×SSC配制), 37℃温育
30 min; 2×SSC漂去盖玻片, 2×SSC洗 3次, 每次 5
min; 0.10%~0.01% Pepsin(10 mmol L−1 HCl 配制),
37℃温育 20 min; 2×SSC漂去盖玻片, 2×SSC洗 2次,
每次 5 min; 4%多聚甲醛(W/V, 现用现配)于 37℃下
固定 10 min, 2×SSC洗 2次, 每次 5 min; 70%、90%、
100%乙醇顺序脱水, 每次 3 min, 晾干备用。
1.5.2 探针标记 对 45S rDNA用生物素(Biotin-
dUTP)、石系亚 1号 gDNA用地高辛(Dig-dUTP)分别
进行缺口平移法探针标记：取模板 DNA 2 μL, 加双
纯水 14 μL, Biotin-Nick Translation Mix or Dig-Nick
Translation Mix 4 μL, 放入 PCR仪 15℃ 90 min后,
加 0.5 mol L−1的 EDTA 1 μL终止反应, –20℃保存备
用。
1.5.3 原位杂交 杂交液总体积为 20 μL, 含
100%去离子甲酰胺 10 μL, 50%硫酸葡聚糖 4 μL,
20×SSC 2 μL, 10% SDS 1 μL, 荧光素标记的探针 1
μL, 用灭菌的去离子水补足 20 μL。将杂交液混匀,
于 90℃~97℃变性 8~10 min, 转入冰水中处理 10~15
min。取 20 μL变性的杂交液滴于制片上, 加塑膜盖
片, 转入 37℃水浴中杂交过夜。
1.5.4 洗脱 2×SSC, 常温洗 5 min; 2×SSC, 42℃
洗 10 min; 2×SSC, 常温洗 5 min; 1×4T, 常温洗 5
min; 每张片子加 30 μL 5% BSA, 37℃温育 30 min,
1×TNT 洗 3 次, 每次 5 min; 每张片子加 30 μL 的
Avidin-fluoresecein, 37℃下温育 1 h (浓度 5 ng μL−1),
1×TNT 洗 3 次, 每次 5 min; 甩干(制片不能见干),
载片用DAPI衬染; 用 1×PBS洗 2次, 每次 3 min, 晾
干后用 Vectashield封片。
1.6 染色拍照保存
在蔡司荧光显微镜下检查 DNA 纤维的质量和
杂交结果, 并拍照。
2 结果与分析
2.1 细胞核的提取
采用研磨法制备棉花细胞核 , 细胞核破坏严
重、产率较低, 而且很多细胞质释放物难以除净(图
1-A); 如果使用刚刚发育 3 d的子叶, 即使在提取液
中加入 Triton X-100 和 PVP40, 细胞核提取物中仍
然含有很多其他杂质(图 1-B), 均影响细胞核的提取质
量。如果采用超过 1周以上的黄化处理, 子叶趋于老
化、腐烂, 提不出细胞核。而采用锋利刀片直接切割
发育 1 周的棉花黄化子叶, 很容易释放出细胞核, 不
需要精细研磨, 细胞核受到破坏小, 细胞核提取成
功率可达到 100% (图 1-C)。再则, 在细胞核提取液
中加入 Triton X-100 和 PVP40可以去除棉酚等次生
代谢物质, 不需用有毒试剂巯基乙醇等处理。此种
“刀切法”, 制备棉花细胞核成功率高 , 方便快捷无
毒害。
2.2 DNA纤维的制备
染色质是由 DNA 双链和蛋白质组成 , 制备
DNA 纤维, 关键是除净染色质上的蛋白质。在室温
条件下, 采用温和碱裂解法释放游离的 DNA 纤维,
用我们配制的裂解液浓度设计了 3、5、7、9、12和
16 min 共 6 个温育时间, 发现蛋白质去除程度不同
(图 2), 其中 9 min 蛋白质基本被除净, 释放出游离
的 DNA纤维(图 2-D)。处理时间过短, DNA和蛋白质
不能分开, 但处理时间过长, DNA 受到破坏甚至降



图 1 制备棉花细胞核三种方法的比较
Fig. 1 Comparison of three methods for preparing cotton cell nuclei
A: 用液氮研磨法制备细胞核; B: 用刀切法从黄化处理 3 d的子叶中提取的棉花细胞核; C: 用刀切法从黄化处理 1周的子叶中提取的
棉花细胞核; 白色箭头指示细胞核, 黑色箭头指示杂质; 细胞核用 DAPI染色(×400)。
A: Nuclei of cotton prepared with liquid nitrogen grinding method; B: Nuclei of cotton prepared with chopping method from fresh etiolated
young cotyledon grown for 3 days; C: Nuclei of cotton prepared with chopping method from fresh etiolated young cotyledon grown for one
week. The white arrows indicate the nuclei; the black arrows indicate the impurities. The cell nuclei were stained with DAPI(×400).

第 3期 彭仁海等: 适用于棉花荧光原位杂交的 DNA纤维高效制备技术 415


解, 得不到完整的 DNA纤维。然而, 对于不同的裂解
液浓度, 需进一步实验验证才能确定最佳温育时间。
伸展DNA纤维常用方法有两种, 一是重力自然
拉伸法, 一是载玻片推动涂抹法, 两者都有一定局
限性。前者因为液体表面张力的作用, 液体在下滑
过程中曲折前进, 导致 DNA 纤维分布不均匀, 有时
相互重叠, 制片质量很差。后者虽能使液体均匀分
散 , 但因推动过程中用力大小不均等因素 , 易使
DNA纤维堆积、断裂和丢失。我们采用液面前端载
玻片导引, 即“引流法”来伸展 DNA 纤维, 消除了
液体表面张力的影响, 也避免了涂抹法和重力拉伸
法造成的DNA纤维堆积和断裂, DNA纤维随着液面
的铺展而伸展开来, 所制备的DNA纤维平直、均匀、
完整(图 2-D), 完全满足荧光原位杂交的需要。
2.3 DNA纤维荧光原位杂交
用亚洲棉石系亚 1 号自身基因组 gDNA 和 45S
rDNA 作探针进行 DNA 纤维荧光原位杂交, 杂交信
号均表现为典型的非连续的念珠状(图 3)。可以看出,
“刀切引流法”所制备的棉花 DNA纤维完全满足荧
光原位杂交要求。



图 2 不同温育时间处理后制备的棉花 DNA纤维
Fig. 2 Cotton DNA fibers obtained with different treated times
A: 温育 3 min后制备的棉花 DNA纤维(×400); B: 温育 5 min后制备的棉花 DNA纤维(×560);
C: 温育 7 min后制备的棉花 DNA纤维(×560); D: 温育 9 min后制备的棉花 DNA纤维(×1000)。
A: The stretched cotton DNA fibers from nuclei incubated for 3 min(×400); B: The stretched cotton DNA fibers from nuclei incubated for 5
min(×560); C: The stretched cotton DNA fibers from nuclei incubated for 7 min(×560); D: The extended cotton DNA fibers from nuclei in-
cubated for 9 min(×1000).



图 3 DNA纤维荧光原位杂交
Fig. 3 Fluorescence in situ hybridization patterns of DNA fibers of cotton
A: 以地高辛标记的基因组作探针进行棉花 DNA纤维荧光原位杂交(1000倍);
B: 以生物素标记的 45S rDNA作探针进行棉花 DNA纤维荧光原位杂交(1000倍)
A: Cotton DNA fibers hybridized with cotton genomic DNA probes labeled by Digoxigenin(×1000);
B: Cotton DNA fibers hybridized with 45S rDNA probes labeled by Biotin(×1000).

3 讨论
制备棉花DNA纤维, 高质量的细胞核提取是关
键。首先要进行材料的黄化处理, 因为棉花细胞质
浓厚, 富含棉酚、多糖、油和丹宁等次生代谢物, 细
胞核的提取比较困难。我们发现, 用发育 1周的黄化
子叶提取的细胞核明显好于发育 3 d 的黄化子叶提
取的细胞核, 可能是较长时间的黄化处理, 使子叶
中很多次生成分被消耗, 但如果黄化处理超过 1周以
上, 子叶呈老化趋势, 容易腐烂, 不能提出细胞核。
同时, 在细胞核提取液中加入 Triton X-100 和 PVP40,
能有效去除棉酚等物质, 减少干扰, 所制备的细胞
核杂质少、质量高。其次是如何释放出细胞核。在
拟南芥、番茄等植物中, 制备 DNA纤维用的细胞核
多采用研磨法[9]。在棉花中也有用研磨法提取细胞
核的报道 [34], 然而, 研磨法时间长短和力度大小难
以掌握 , 很多细胞核被破坏 , 细胞核产率较低 , 而
且很多细胞质释放物难以除净。我们试探成功“刀
切法”, 采用锋利的刀片切割棉花子叶, 细胞核很容
易释放出来而不受到破坏, 而且不需要研磨和有毒
试剂巯基乙醇等处理, 方便快捷无毒害, 成功率可
达 100%。
典型的 DNA纤维 FISH杂交信号均表现为非连
416 作 物 学 报 第 35卷

续的念珠状 (beads-on-string)。对于其原因 , Fransz
等[9]认为有 3 个方面, 一是在制片过程中醋酸处理造
成的 DNA 损伤以及载玻片表面粘附的小片段 DNA
妨碍杂交的结果。二是细胞内 DNA 总是与蛋白质
结合在一起, 在 DNA 纤维的制备过程中, 染色体
蛋白质不可能完全去除干净, 残存的染色体蛋白质
降低了目的序列与 DNA 纤维的接近, 导致念珠间
具有空隙。三是在杂交检测过程中免疫荧光抗原-抗
体反应的结果, 优先结合的抗原-抗体大分子对邻近
的分子具有空间位阻效应, 减少了荧光信号点, 使
其表现为强弱不等、大小不一、不连续的念珠状信
号。Rijke 等[35]则认为, 两念珠之间的间隙是 DNA
变性过程中靶 DNA 部分丢失的结果。念珠大小不一
致是由于在杂交过程中, 探针DNA片段与靶DNA随
机相遇并结合, 靶 DNA有的区域得到了充分的结合,
另一些区域则很少或没有结合, 而念珠之间的间隙
区域就是没有得到结合的部分。虽然目前形成念珠
状信号的原因尚不十分确切, 但是, 念珠状信号代
表的是 Fiber-FISH 的真实结果 , 所反映的是供试
DNA序列在伸展 DNA纤维上杂交的顺序。所以, 鉴
定 DNA纤维 FISH成功与否, 或杂交信号是否真实,
关键是要看荧光信号点是否连续, 形状如何。本试
验中杂交信号均表现为典型的非连续念珠状。
4 结论
采用刀切法提取棉花细胞核, 整个过程只需 30
min左右, 不需要研磨和巯基乙醇等处理, 方便快捷
无毒害, 成功率 100%。以引流法制备 DNA 纤维,
DNA 纤维平直完整、伸展程度均匀、背景清晰, 完
全适用于荧光原位杂交。本研究首次在棉花中建立
了简单、高效、快捷、无毒害的适宜于荧光原位杂
交的DNA纤维制备技术, 为深入进行棉花基因组研
究乃至棉花基因组测序的最终完成提供强有力的技
术支持。
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