全 文 ：现代生物医学进展 www.shengwuyixue.com Progress inModern Biomedicine Vol.11 NO.3 FEB.2011
不同染色技术和双色荧光原位杂交技术对宽翅菘蓝
（Isatis violascens Bunge）的细胞遗传学分析
戚大石 1 汤佳立 2
（1徐州医学院 江苏徐州 221121；2中国药科大学生命科学与技术学院 江苏南京 210009）
摘要：为了解十字花科菘蓝属植物宽翅菘蓝（宽翅菘蓝，Isatis violascens Bunge）的染色体结构，本文利用 45S rDNA和 5S rDNA双
色荧光原位杂交、银染技术和 CMA3对宽翅菘蓝进行分子细胞遗传学研究。45S rDNA和 5S rDNA荧光原位杂交结果显示宽翅
菘蓝染色体上有 1对 45S rDNA信号和 1对 5S rDNA信号；银染结果显示其中期染色体有 1对银染点；CMA3染色结果发现宽
翅菘蓝中期染色体存在 1对 CMA3信号。
关键词：宽翅菘蓝；银染；45S rDNA；双色荧光原位杂交；CMA3染色
中图分类号：Q343，Q943 文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2011）03-485-04
Cytogenetic Analysis of Isatis Violascens Bunge by Different Staining
Techniques and D-Fluorescent in Situ Hybridization
QI Da-Shi1, TANG Jia-Li2
(1 Xuzhou Medical college, Xuzhou, 221116, China;
2 School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)
ABSTRACT: Objective In order to understand the chromosome structure of I. violascens Bunge, 45S rDNA and 5S rDNA dual-flu-
orescence in situ hybridization (45S rDNA and 5S rDNA D-FISH), silver staining and CAM3 staining were used to study the chromo-
somes of I. violascens Bunge. In the silver stained metaphase chromosomes of I. violascens Bunge, there were two positive regions; fluo-
rochrome Chromomycin A3 (CMA) staining showed two positive regions; D-FISH with 45S rDNA and 5S rDNA probes revealed one
18S-5.8S-26S rDNA loci and one 5S rDNA loci with different intensity.
Key words: Isatis violascens Bunge; Silver staining; 45S rDNA; D-fluorescence in situ hybridization; CMA3 staining
Chinese Library Classification(CLC): Q343, Q943 Document code: A
Article ID: 1673-6273(2011)03-485-04
作者简介：戚大石（1982-），男，硕士，助教，研究方向：细胞遗传学。
Tel：15351677826；E-mail：qidashi@yahoo.com.cn
(收稿日期：2010-10-18 接受日期：2010-11-15)
菘蓝属（Isatis L），属于十字花科（Brassicaceae），有 30多个
种，含多种旱生植物，在热带，亚热带以及温带地区广为栽培。
目前在我国有 6种和 1个亚种[1]，主要分布在新疆、内蒙古、陕
西、甘肃、河北、山东、江苏、浙江、安徽、贵州等地，新疆的物种
最丰富，其中有些物种是非常重要的药用植物及经济作物。
目前国内外对于菘蓝属植物的研究主要集中在几种药用
植物的生药学、胚胎学、化学成份、栽培技术、组织培养、提取物
的再利用等方面，而对于菘蓝属植物染色体的基础研究比较薄
弱，目前仅有对于菘蓝属中菘蓝核型的报道。因此，对于菘蓝属
植物的染色体研究是非常有必要的。但大多数植物染色体鉴定
是非常困难的，因为染色体形态之间的差异甚小，如果染色体
的臂长、着丝点位置、异染色质等很难被确定时，就会严重阻碍
对于植物染色体的研究[2]。幸运的是，分子细胞遗传技术，包括
各种显带技术和原位杂交技术，才使得我们可以更好的了解植
物染色体，从而进一步推动对植物研究进展。通过各种染色体
显带技术可以识别人类及大多数动植物的染色体，再加以利用
原位杂交技术，根据不同的带型、不同探针的位置，进而得到更
多有关染色体组的信息，从而有利于更好的研究物种染色体组
的结构和功能[3]。Thomas K. Wolfgruber等通过染色质纤维原位
杂交技术来研究玉米着丝点的结构和进化[4]。
本研究首次首次采用 Ag-NOR、CMA3染色和 rDNA双色
荧光原位杂交等技术（rDNA-DFISH）综合研究宽翅菘蓝染色
体，为宽翅菘蓝品种的遗传改良提供细胞及分子遗传学基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料 供试材料栽培种宽翅菘蓝（Isatis violascens
Bunge）购于新疆。
1.1.2 供试质粒探针 45S rDNA 和 5S rDNA 探针由美国 Ne-
braska大学的 Arumuganathan教授提供。45S rDNA片段长度
为 9.1 kb，包括非转录的间隔区和 18S、5.8S和 25S亚单位，以
pUC18为其克隆载体，酶切位点为 Kpn I；长度为 450 bp的 5S
rDNA片段，为 pUC18为克隆载体，BamH I为其酶切位点。
1.2 方法
1.2.1 植物染色体制备技术 参照汤佳立[5]的方法并略加修改制
备宽翅菘蓝染色体。步骤为：剪取生长旺盛的根尖(1- 2mm)，
25℃，α-溴萘饱和溶液处理 2.5 h，用 0.075 mol/L KCl前低渗
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DOI:10.13241/j.cnki.pmb.2011.03.003
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处理 30 min，乙醇：冰醋酸(3：1)固定，双蒸水充分清洗根尖，
2%纤维素酶和 2%果胶酶 1：1混合，29℃酶解 5-6 h，用双蒸水
后低渗 30 min，火焰干燥制片，-20℃贮存备用。
1.2.2 植物 Ag-NOR染色技术 参照 Hellmer的快速银染法并
略作修改对宽翅菘蓝中期染色体和间期核进行染色，制片放在
空气干燥 5h 的，在 25 ℃下，用 0.2 mol/L HCl 处理 10～15
min，空气干燥 3 h，滴加 70% AgNO3水溶液，50～60℃染色过
夜，然后镜检照相。
1.2.3 植物 CAM3染色技术 参照 Arun Kumar Sharma等并略
作修改。先用含 10mmol/L MgCl2的McIlvaine缓冲液(pH6.9～
7.0) 浸泡 10～15min, 然后用 含 有 10mmol/L MgCl2 和
0.12mg/mL CMA的 McIlvaine缓冲液染色 25～30min，然后镜
检照相。
1.2.3 质粒 DNA的提取和探针标记技术 参照萨姆布鲁克丁等
(1992)采用 碱裂解法 并略作修改提取质粒的。按照 Singh
M等 [6] 的方法通过切刻平移法用 Biotin-11-dUTP和 Digoxi-
genin-11-dUTP分别标记 5S rDNA和 45S rDNA探针。标记反
应混和物(50μL)中含 5 μL dNTP (dATP，dGTP和 dCTP等量
混合)，10×Buffer 5 μL，所需标记探针 DNA 5 μL，Biotin-11
-dUTP 0.6 μL 或者 Digoxigenin-11-dUTP 0.6 μL，Enzyme 5μL
(含 polymerase Ⅰ、Dnase Ⅰ), 加 ddH2O至终体积 50 μL，15℃
反应 3 h，2μL 0.5 mol/L EDTA终止反应。
1.2.4 原位杂交和信号检测 参照汤佳立[5]方法并略作修改进行
原位杂交。在 60℃，对染色体制片干燥 1 h，后用 RNaseA 37℃
处理 2 h，接着用 70%甲酰胺 70℃处理 3.5 min，分别在 -20℃
70%、95%、100% 乙醇中各脱水 5 min，放置于室温下约 20
min，直到染色体制片完全干燥。按照 50%甲酰胺、8%硫酸葡聚
糖、10% 20×SSC、0.1 % SDS、2 μg ssDNA配置杂交液，放置
在沸水中变性 10 min，迅速放于冰上 5 min。将 50μL杂交液加
到染色体制片，90℃，共变性 10 min，37℃保湿皿孵育 18～24 h。
用 streptavidin-Cy3 和地高辛检测杂交信号。用 DAPI
(3μg/mL)复染染色体。在 LEICA DMRA2荧光显微镜下观察
制片拍照，Photoshop软件进行图片处理。
2 结果与分析
2.1宽翅菘蓝间期核和中期染色体的银染
图 1A-B显示了宽翅菘蓝间期核以及中期染色体的银染
的结果。由图 1可见，在宽翅菘蓝间期核中，有 1-2个 Ag-NORs
区域，而且 Ag-NORs区域的大小相近似；在中期染色体中，可
以看到 1对 Ag-NORs区域。
2.2 宽翅菘蓝间期核和中期染色体的 CAM3的染色
图 1C-D显示了宽翅菘蓝间期核和中期染色体的 CAM3
的染色结果。由图 1可见，宽翅菘蓝间期核中 CAM3信号区域
有 1-2个，区域的大小相近似；在中期染色体中，可以看到 1对
CAM3信号。
2.3 45S rDNA和 5S rDNA在宽翅菘蓝间期核和中期染色体定
位
图 1 E-F显示了在宽翅菘蓝间期核和中期染色体上 45S
rDNA和 5S rDNA序列的双色荧光原位杂交结果；染色体通
过 DAPI复染为蓝色；45S rDNA杂交信号为绿色；5S rDNA
的杂交信号为红色。通过对宽翅菘蓝的 50个中期和前期分裂
相的杂交结果进行分析表明，宽翅菘蓝 14条染色体上显示有
1对 45S rDNA信号，位于 1号染色体短臂的端部和随体上，几
乎覆盖整个短臂，并且信号较强，在基因组内，我们同样发现了
1对 5S rDNA，位于 2号染色体的着丝粒处，信号强。
3 讨论
通过荧光显带技术，我们可以更好的研究宽翅菘蓝染色
体。CAM3是对 GC富含区进行着色，结合的序列为存在于
DNA小沟中的 5 - dGpC - 3序列，大于 4 bp。通过 CAM3的染
色，GC富含区显示出明亮的荧光条带，相反，AT富含区就表现
为较浅的条带[16]。在对宽翅菘蓝进行 CAM3染色，发现有 2个
明亮的区域，这意味着 GC富含区主要集中在 1号染色体的短
臂以及其随体上，而在其他染色体上分布均匀。在其它物种中，
还出现其他类型的 CAM染色条带，如在远志，CAM条带存在
于在次缢痕处[7]。
图 1 宽翅菘蓝银染、CAM3染色、45S rDNA和 5S rDNA双色荧光原位
杂交结果蓝色为 DAPI复染的染色体，红色为 5S rDNA杂交信号，绿
色为 45S rDNA杂交信号。A：间期核银染结果；B：显示 1对银染点；
C：间期核 CAM3染色结果；D显示 1对 CAM3染点；E：45S rDNA和 5S
rDNA双色荧光原位杂交核结果：F：45S rDNA和 5S rDNA双色荧光
原位杂交中期染色体图。
Figure 1 Silver (A, B), CMA3 (C, D) and Localization of 45S rRNA and
5S rDNA gene loci on some phases of cell cycle of I. violascens Bunge by
D-FISH (E, F)
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核仁组织区代表着染色体所在的区域，有大量的 rDNA基
因(5.8S, 18S and 28S rDNA)。
在细胞间期，核仁的大小与 rDNA基因活性有关系，并且
通常可以通过硝酸银染色来观察其所在位置，换句话说，即表
达的 rDNA基因可以被定位，看做为染色体所在区域[8]。为了检
测 GC富含区是否与核仁组织区存存在关系，通常通过检验硝
酸银染色结果，以 45S rDNA为探针的原位杂交结果，以及
CAM3染色结果加以判断。目前，已经有许多通过 CMA3，银染
以及 45S rDNA 的定位来确定核仁组织区的报道，Saranya
Srisuwan[8]等人在对甘薯属巴西牵牛，三浅裂野牵牛等多种植
物进行的银染、CMA3以及 45SrDNA的定位，精准的确定了核
仁组织区的数量和位置。本实验发现宽翅菘蓝间期核中
Ag-NORs和 CAM3区域各有 1-2个；在中期染色体中，可以看
到 1对 Ag-NORs信号和 1对 CAM3信号，说明在宽翅菘蓝基
因组中具有转录活性的核仁组织区有 1～2个。
45S rDNA和 5S rDNA组成了高等植物 rDNA。45S rDNA
又是由 5. 8 S rRNA、18 S rRNA、28 S (25 S) rRNA 组成，而
18S、5.8S和 28S又是通过 ITS-1、ITS-2 将其分隔开。研究表
明，45S rDNA通常被定位在核仁组织区 [9]，而 5S rDNA在物
种基因组上的位置变化很大 [10]。通过以 45S和 5S rDNA为探
针，在多个物种进行荧光原位杂交以及物种间 ITS序列差异，
不仅可以用以讨论 rDNA的起源进化，而且可以有效地反映
种、属间的分化程度，物种染色体精细结构分析，从而为染色体
的识别和在分子水平上研究基因组的进化提供线索。研究结果
表明，宽翅菘蓝中有 1个 45S rDNA位点，位于 1号染色体短
臂的端部和随体上，几乎覆盖整个短臂，1对 5S rDNA信号，位
于 2号染色体的着丝粒处。通过 45S和 5S rDNA位点的定位，
有利于我们更好识别宽翅菘蓝染色体，对宽翅菘蓝的进化研究
提供有用的信息。
在对宽翅菘蓝进行原位杂交时，我们发现 rDNA杂交信号
大小和强弱在染色体不同位点上表现出差异。在对栎属的研究
中，同源位点间信号大小和强度也表现出一定的差异[11]，汤佳
立等还发现在徐薯 18基因组中，还发现了一个 45S rDNA信
号无法稳定出现的现象[7]。造成位点拷贝数目改变的原因可能
是由于染色体重排，不等交换，由转座子引起的隐蔽 rDNA拷
贝数的扩增有关系。Mantovani[12]等认为 45S rDNA分布在染色
体端部的特点也可能是 45S rDNA数目改变的原因之一，因为
位于染色体端部位置的 DNA更容易发生交换。虽然，我们无法
通过原位杂交来直接给出基因的实际拷贝数，但是可以通过杂
交信号的大小以及强度间接估评基因拷贝数的多少，所以
FISH被认为是一种半定量分析技术[3]。
在对宽翅菘蓝的间期细胞核银染、CMA3染色以及原位杂
交时，我们发现在不同间期细胞核出现 1-2个信号，这可能与
细胞核处于不同的分裂时期有关，如在 G1期，是 DNA复制的
早期，染色体并没有开始复制，由于同源染色体的位置，可能会
出现 1-2个信号，细胞分裂的 S期和 G2期，染色体已近复制甚
至复制完成，此时由于染色单体的存在，就有可能会出现 2个
信号，同时也有可能是由于 rDNA合成量的变化造成的。
有关宽翅菘蓝染色体的研究还处于起步阶段，更多的工作
需要开展，通过传统的细胞遗传学研究方法与染色体荧光原位
杂交等研究方法相结合，可以更好的为我们区分和鉴别宽翅菘
蓝不同种及品种，为研究宽翅菘蓝种及品种间亲缘关系及新品
种选育等奠定基础。随着相关研究成果的不断积累，必将为规
范宽翅菘蓝染色体核型提供帮助，同时也为宽翅菘蓝的研究提
供细胞和分子遗传学基础，对其新品种的培育有重要的意义。
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