全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(12): 2092−2098　 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2007AA10Z134)
作者简介: 尹梦回(1982−), 男, 硕士研究生, 主要从事植物分子生物学研究。E-mail: dreamanyin@yahoo.com.cn
*
通讯作者(Corresponding author): 肖月华(1972−), 男, 研究员, 主要从事棉花基因工程研究。E-mail: xiaoyuehua@swu.edu.cn
Received(收稿日期): 2008-03-26; Accepted(接受日期): 2008-07-13.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.02092
烟草绒毡层特异启动子 pTA29在棉花中的表达特性
尹梦回 董 静 李先碧 侯 磊 罗 明 李德谋 裴 炎 肖月华*
(西南大学生物技术中心 / 农业部生物技术和作物品质改良重点实验室, 重庆 400716)
摘 要: 烟草绒毡层特异启动子 pTA29 (TA29 promoter)已用于多种植物雄性不育和花粉发育的研究。作为外源特异
表达启动子 pTA29在棉花中的表达特性尚不清楚, 为了研究该启动子在棉花中的表达特异性, 本文构建了 pTA29:gus
融合基因, 并将其转入棉花。研究发现在 GUS 染液中添加 10%的乙醇可以抑制棉花花药内源 GUS 活性。用改良的
GUS染液进行组织化学染色表明, pTA29:gus转化植株的 GUS活性主要存在于花药中, 并在花蕾长为 6 mm和 15 mm
的花药中有 2个活性高峰, 而在根、茎、胚珠、花瓣、苞叶中未被检测到。与烟草不同, 在 pTA29:gus棉花转化植株
的叶片表皮毛和花粉中也能检测到 GUS 活性。定量 RT-PCR 分析表明转化子中 gus 基因的转录水平与 GUS 活性一
致。上述结果表明, 烟草绒毡层特异启动子 pTA29 可以控制下游基因在棉花花药中优势表达; 在利用该启动子进行
棉花基因功能以及雄性不育研究时, 应注意该启动子在棉花中的表达范围和组织特异性。
关键词: pTA29; 棉花; 内源 GUS活性; 表达特异性
Expression Characteristics of Tobacco Tapetum-Specific Promoter pTA29
in Cotton
YIN Meng-Hui, DONG Jing, LI Xian-Bi, HUO Lei, LUO Ming, LI De-Mou, PEI Yan, and
XIAO Yue-Hua*
(Biotechnology Research Center, Southwest University / Key Laboratory of Biotechnology and Crop Quality Improvement, Ministry of Agriculture,
Chongqing, 400716, China)
Abstract: Tobacco tapetum-specific promoter pTA29 is widely used to create male sterile lines and to study pollen development
in various plants. However, the pTA29 expression characteristics in cotton is still not elucidated. To determine the expression
characteristics of pTA29 promoter in cotton, gus gene was fused downstream to pTA29, transformed into cotton. It was demon-
strated that 10% alcohol suppressed the intrinsic GUS-like activity in cotton anther. GUS staining with modified solution showed
that the GUS activity in the pTA29:gus transformants mainly existed in anthers with two peaks in the floral buds of 6 and 15 mm,
while no GUS activity was detected in roots, stems, ovules, petals and bracts. Inconsistent with that in tobacco, the GUS activity
was also detected in the leaf trichomes and pollens in pTA29:gus transformants. Real-time RT-PCR analysis indicated that the gus
transcripts accumulated in a same pattern with the GUS activity. These results suggest that the tobacco tapetum-specific promoter
pTA29 can drive the downstream genes to express preferentially in anthers of cotton. The application of pTA29 in cotton male
sterility engineering was discussed.
Keywords: pTA29; Cotton; Intrinsic GUS-like activity; Expression Specificity
杂种优势利用是提高作物产量和品质的重要手
段, 利用雄性不育系进行杂交制种是目前最为经济
可靠的杂种优势利用方法。因此, 雄性不育系的开
发和利用一直是作物育种研究的热点。在花药(花粉)
发育的分子生物学研究基础上, Mariani等[1]将烟草
花药特异启动子 pTA29 与细菌核糖核酸酶基因
第 12期 尹梦回等: 烟草绒毡层特异启动子 pTA29在棉花中的表达特性 2093


Barnase 融合后转入烟草和油菜, 获得了雄性不育
的转基因植株。之后研究人员设计了多种创造基因
工程雄性不育系的方法, 为雄性不育系的开发和利
用提供了新途径[2-3]。在发掘基因工程雄性不育系的
方法中, 关键在于找到花药或花粉特异表达的启动
子 , 以便能够在花药或花粉中特异表达目的基因 ,
在不影响植物正常生长发育的同时, 选择性地阻断
花药或花粉的发育。TA29是从烟草中克隆的一个绒
毡层特异表达的基因, TA29 在烟草减数分裂期到小
孢子有丝分裂期的绒毡层中特异表达, 在其他器官
和花的其他组织中均没有表达[4]。目前 pTA29 启动
子已经在烟草、油菜、小麦、棉花等多种植物上应
用[1-3,5-8], 成为应用最广泛的一个花药特异启动子。
棉花目前缺乏可利用的雄性不育系资源, 所以
杂交制种主要采用人工去雄的方法, 不但用工成本
高, 杂交种的纯度也难以保证。获得败育彻底、育
性稳定、易恢复的雄性不育系是棉花杂种优势利用
的必然条件。前人利用花药特异启动子 pTA29和 A6
等控制 Barnase 基因在棉花中表达, 获得了花粉不
育的转基因棉花 [7-8], 为了更好地在棉花中应用
pTA29 启动子, 本文将该启动子与 gus报告基因融合,
利用遗传转化获得的转基因棉花分析了 pTA29 启动
子在棉花中的表达特异性。
1 材料与方法
1.1 材料
用于遗传转化的材料为陆地棉 (Gossypium
hisutum L.)冀棉 14, 由河北农业大学马峙英教授提
供。转化用大肠杆菌菌株 DH5α 和农杆菌菌株
LBA4404为本实验室保存。
限制性内切酶购自 Roche公司, Taq DNA聚合
酶、反转录试剂盒和定量 PCR 试剂盒购自大连
TaKaRa公司, 尼龙膜、[α-32P] dCTP和 Ready-To-Go
标记试剂盒为 Pharmacia公司产品, Gelrite和乙酰丁
香酮(AS)为 Sigma 公司产品, 其他试剂均为进口或
国产分析纯。

图 1 pTA29表达载体 T-DNA的结构图
Fig. 1 Scheme of T-DNA of the pTA29 expression vector
LB和 RB: T-DNA的左边界和右边界; pTA29: pTA29启动子; gus: β-葡萄糖酸苷酶基因; nptII: 新霉素磷酸转移酶基因; Nos-P和 Nos-T:
冠瘿碱合酶基因启动子和终止子。
LB and RB: the left and right border of T-DNA; TA29: TA29 promoter; gus: β-glucuronidase; nptII: neomycin phosphotransferase II gene;
Nos-P and Nos-T: the promoter and terminator of nopline synthase gene, respectively.

1.2 启动子的获得及表达载体构建
pTA29启动子由西南大学宋洪元博士提供[9]。其
序列克隆在 pUC载体上, 包含 TA29基因上游 5′非编
码序列 293 bp (−328 ~ −36), 其中包含在烟草绒毡层
特异表达所需的 122 bp基本元件(−207 ~ −85)[4]。
经测序验证后, 用 Hind III和 BamH I将 pTA29
启动子序列从克隆载体上切下, 回收约 300 bp片段
与相同酶切的 pBIl21 的载体相连, 获得重组双元植
物表达载体 pBI-pTA29 (图 1)。用电转化法将该载体
转入农杆菌菌株 LBA4404中, 进一步用于棉花遗传
转化。
1.3 棉花的遗传转化和转化植株的分析
参照本实验室的方法进行棉花遗传转化[10-11]。
用 YEB 活化转化用农杆菌, 待菌液 OD600值为 0.8
左右时离心收集, 然后用液体 MSB(MS 无机盐+B5
有机+100 μmol L−1 AS)[12]培养基重悬菌体, 调整
OD600值为 0.3~0.5。选取萌发 5~7 d健壮幼苗的下胚
轴, 以 0.3~0.5 cm的切段放入重悬菌液中浸染 20~30
min。再转移到共培养培养基 (MSB+1.9 g L−1
KNO3+30 g L−1葡萄糖+2.0 g L−1 Gelrite +100 μmol
L−1 AS, pH 5.2), 黑暗条件下共培养 4 d。之后, 接种
于筛选培养基 (MSB+0.5 mg L−1 IAA+0.1 mg L−1
KT+75 mg L−1卡那霉素(kan)+500 mg L−1头孢霉素
+30 g L−1葡萄糖+2.0 g L−1 Gelrite, pH 5.8), 每 3周继
代一次至胚性愈伤组织产生。当每块组织增殖到
2.0~3.0 g时接入液体培养基, 于 120 r min−1的摇床
上进行悬浮培养以获得大量体胚。2 周后, 用 30 目
筛网过滤 , 将网下沉淀物转入体胚成熟培养基
(MSB+1.9 g L−1 KNO3+30 g L−1葡萄糖+2.0 g L−1
Gelrite, pH 6.2)．取萌发的成熟胚转入诱导体胚伸长
培养基(1/2 MSB+15 g L−1葡萄糖+15 g L−1 蔗糖+3.0
g L−1 Gelrite, pH 6.2)上, 培养 2周诱导体胚伸长、萌
2094 作 物 学 报 第 34卷

发。取较大的萌发胚(>0.5 cm)转接入 SH 培养基成
苗[13]。幼苗长出 3~4 片真叶时嫁接[14], 并移栽到温
室中生长。
获得的 kan抗性植株用 PCR和 Southern blotting
方法进行分子生物学验证。取阳性植株当天开花的
花药进行初步的 GUS 染色鉴定。进一步播种 T0代
种子获得 T1代植株。取 GUS 阳性的 T1植株的不同
组织进行 GUS染色和定量 RT-PCR分析。
1.4 DNA 提取、PCR 验证和 Southern blotting
分析
用本实验室改良的 CTAB法提取 8 个株系棉花
DNA[15]。25 μL PCR反应体系中含约 50 ng基因组
DNA, 100 nmol L−1的上下游引物(gus-P1, 5′-GGTG
GTCAGTCCCTTATGTT-3′和 gus-P2, 5′-TCATTGTT
TGCCTCCCTGCT-3′), 1 U Ex Taq DNA聚合酶。反
应程序为 94℃ 5 min; 94℃变性 30 s, 56℃退火 30 s,
72℃延伸 2 min, 30个循环; 72℃最后延伸 10 min。
将扩增产物在 1.2%的琼脂糖凝胶上电泳检测目的片
段的有无。
参照分子克隆手册方法进行 Southern blotting
分析[16]。每种 DNA取 10 μg, 用 Hind III充分酶切
后, 在 0.8%的琼脂糖凝胶上电泳 , 并转到 Hybond-
N+尼龙膜上。对扩增的 gus基因用Ready-To-Go DNA
标记试剂盒进行 α-32P 标记。用 Xiao 等的方法进行
杂交和信号检测[11]。
1.5 RNA提取和定量 RT-PCR分析
为检测 gus 基因在不同组织中的相对转录水平,
在大田栽培条件下分两次提取 5号转化子 T1代GUS
阳性植株的不同组织的 RNA, 分别进行定量
RT-PCR 分析, 取花蕾长为 4、6、8、10 和 15 mm
的花药、开花当天花药、根、茎、叶、开花后 2 d
胚珠以及开花后 8 d 纤维进行 gus 相对转录强度检
测。
参照试剂盒说明书进行定量 RT-PCR 分析。取
约 1 μg总 RNA进行反转录, 合成 cDNA一链, 稀释
5倍, 取 5 μL作模板进行定量 PCR分析。gus基因
引物为 gus-P3, 5′-ACACCGACATGTGGAGTGAA-3′
和 gus-P2, 扩增片段长度 263 bp。用棉花 Histone3
基因作内标, 引物为 Ghhis1, 5′-GAAGCTGCAGAG
GCATACC-3′ 和 Ghhis2, 5′-CTACCACTACCAT
CATGGC-3′[17], 扩增片段长度为 241 bp。扩增程序
为 95℃ 2 min; 94℃变性 30 s, 56℃退火 30 s, 72℃延
伸 30 s, 40个循环。定量 PCR分析在 Bio-Rad公司
Icycler IQ定量 PCR检测系统上完成, 每样品进行 3
次重复。将 gus 和 Histone3 基因表达量的比值作为
gus转录强度的相对定量值, 应用 Excel程序进行数
据分析与作图。
1.6 GUS组织化学染色
为抑制棉花组织中的内源 GUS 活性 , 参考
Jefferson方法[18]用本试验改良的 GUS染液(0.1 mol
L−1磷酸缓冲液, pH 7.0, 0.01 g L−1 X-gluc, 0.5 mmol
L−1 K3[Fe(CN)6], 0.5 mmol L−1 K4[Fe(CN)6], 2 % Tri-
ton X-100, 10%乙醇)进行织化学染色。将材料切成
约 0.5~1.0 mm 大小, 迅速加入预冷固定液(0.1 mol
L−1 磷酸缓冲液 pH 7.0, 0.3%甲醛 , 0.2% Triton
X-100), 冰上固定约 0.5 h, 用 0.1 mol L−1的磷酸缓
冲液(pH 7.0)洗 2~3次, 加入GUS染液, 真空渗透 20
min, 将样品置 37℃染色 5~6 h。取出样品, 吸去染
液加入适量 FAA固定液, 室温固定 6~12 h, 最后加
50%乙醇脱色, 在体视镜下观察照相。
2 结果与分析
2.1 棉花转基因植株的获得
通过两批共约 120 个下胚轴段的转化, 最后嫁
接成活了 8 株 kan 抗性植株(命名为 1~8 号)。PCR
分析结果(图 2)显示 3、5、6、7 和 8 号共 5 株 kan
抗性植株能扩增出约 1.8 kb 的 gus 片段, 表明这 5
株 kan抗性植株是真实转化子。Southern blotting分
析表明 PCR阳性的 5株转基因棉花均能与 gus探针
杂交, 获得一条杂交单带(图 3), 进一步说明这 5 株
转基因棉花中均成功整合了 T-DNA序列, 且均为单
拷贝插入。

图 2 转化植株 gus基因的 PCR验证
Fig. 2 PCR analysis of the gus gene of transformed plants
M: marker15(MBI); P: pBI-pTA29质粒; 1~8: 不同的 kan抗性
植株。
M: marker15 (MBI); P: pBI-pTA29plasmid; 1–8: various
kan-resistant plants.

2.2 转基因植株的 GUS组织化学分析
在棉花花药中有较强的内源类GUS活性, 用一般
的GUS染液染色很容易将野生型花药染成蓝色(图4)。
在 GUS 染液中添加 10%乙醇几乎能完全抑制棉花花
第 12期 尹梦回等: 烟草绒毡层特异启动子 pTA29在棉花中的表达特性 2095



图 3 转化植株 Southern blotting分析
Fig. 3 Southern blotting analysis of the transformed plants
3, 5~8: gus PCR阳性的 kan抗性植株。
3, 5–8: gus PCR positive and kan-resistant plants.

图 4 乙醇对野生型棉花花药的内源 GUS活性的抑制效应
Fig. 4 The inhibition effect of ethanol on endogenous GUS
activity in wild type cotton anthers
花药取自长为 4、6、8、10和 15 mm的花蕾和开花当天的花朵
(0DPA)。
+: 在 GUS染液中加入 10%的乙醇; –: 在 GUS染液中未加乙醇。
Anthers from 4, 6, 8, 10, and 15 mm floral buds and 0DPA flower.
+: 10% ethanol in the GUS staining solution; –: no ethanol in the
GUS staining solution.

药中的内源类 GUS活性。因此, 本文采用添加了 10%
乙醇的改良 GUS染液进行组织化学染色。
取 3、5、6、7 和 8 号转化棉花开花当天的花
药进行 GUS 染色, 3、5 和 7 号转化子表现为 GUS
阳性, 而 6和 8 号转化子在开花当天的花药以及不
同时期的花蕾、根、茎、叶、胚珠和纤维组织中均
未检测到 GUS 活性。播种 3、5 和 7 号转化子的
T1 代种子获得 T1 代植株 , 并用开花当天的花药
GUS 染色的方法鉴定阳性植株。在 T1 代阳性植株

上取根、茎、叶、花药和胚珠进行GUS染色, 结果
表明 3个转化子具有相似的表达特性。最后用 5号
转化子的不同组织和不同发育时期的花蕾(或花药)
进行了详细的 GUS组织化学分析和定量 RT-PCR分
析。
用改良的 GUS染色方法, 在未转化棉花的各种
组织中均未检测到蓝色反应, 而在 pTA29:gus 转化
子的不同组织中却出现不同的蓝色反应(图 5)。不同
组织和器官的 GUS 染色结果表明, pTA29:gus 转化
子的 GUS活性主要集中在花药中(图 5-A~F)。此外,
在叶片表皮毛中检测到较弱的 GUS活性, 而在其余
组织(包括根、茎、花瓣、苞叶、萼片、胚珠、子房
等)中未检测到 GUS活性(图 5-G~J)。为检测不同发
育时期花药中的 GUS活性, 对从现蕾到开花当天的
花蕾进行 GUS组织染色。结果, 小于 4 mm的花蕾
均不能被染上蓝色。从花蕾长 4 mm (花粉母细胞形
成到减数分裂时期)开始, pTA29:gus 转化植株的花
药中有较弱的蓝色反应(图 5-A)。到花蕾长 6 mm时
(减数分裂完成到小孢子增大期), 转化花药的 GUS
活性表达到一个高峰, 花药被染成深蓝色(图 5-B),
随后花药中的 GUS 活性明显降低(图 5-C)。当花蕾
发育到 10 mm 长时转化花药中的 GUS 活性又开始
升高(图 5-D), 当花蕾长到 15 mm 长时, 花药 GUS
活性达到了第 2个高峰, 花药被染成蓝色(图 5-E), 还
可以观察到被染成蓝色的花粉。在开花当天的花药
中, 只有花粉被染成蓝色, 花药壁无 GUS 活性(图
5-F)。这些结果表明烟草花药特异启动子 TA29可以
控制下游基因在棉花花药中优势表达, 而且该启动
子控制的基因也会在棉花的叶片表皮毛和花粉中表
达。
2.3 转 gus基因植株的 Real time-PCR分析
为进一步从转录水平定量分析 pTA29 启动子在
棉花不同组织中的相对表达强度, 分别提取了不同
时期的花药、胚珠、纤维、叶片、茎、根等组织的
RNA, 用定量 RT-PCR 方法检测了各组织中 gus 转
录本的相对水平(图 6), gus基因主要在 pTA29:gus转
化子的花药中表达, 在花蕾长为 6 mm和 15 mm的
花药中有两个表达高峰。在叶片中也检测到较弱水
平的 gus基因表达, 而 gus基因在胚珠、纤维、根和
茎中只有痕量的表达。这一结果与 GUS染色的结果
一致, 说明 pTA29 启动子是从转录水平控制 gus 基
因在棉花花药中的特异表达。
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图 5 pBI-pTA29 5号 T1代转基因植株不同组织的 GUS染色
Fig. 5 GUS staining of various tissues from pBI-pTA29 No.5 plants of T1 generation
A~E: 4、6、8、10和 15 mm长的花蕾; F: 开花当天的花药; G: 开花后 1 d的棉铃和胚珠; H: 幼茎; I: 根; J: 叶片。图中标尺均为 1 mm。
A−E: 4, 6, 8, 10, and 15 mm floral buds, respectively; F: anther at the day of anthesis; G: ovary and ovules of 1 days post anthesis (DPA);
H: immature stem; I: root; J: leaf. Bars=1 mm.


图 6 pBI-pTA29 5号 T1代转基因植株不同组织中表达的定量
RT-PCR分析
Fig. 6 Real time RT-PCR analysis of the gus expression in
various tissues from pBI-pTA29 No.5 plants of T1 generation
RNA来自不同发育时期花蕾的花药(花蕾长度分别为 4、6、8、
10和 15 mm)和开花当天的花药(A), 以及开花后 2 d的胚珠(O)、
开花后 8 d的纤维(F)、根(R)、茎(S)和叶(L)。
RNAs from anthers of floral buds at various developmental stages
(4, 6, 8, 10, and 15 mm in length), 0DPA anthers (A), ovules of
2DPA (O), fibers of 8 DPA (F), roots (R), stems (S), and leaves (L).

3 讨论
前人研究发现在多种植物(包括烟草、水稻、马
铃薯、番茄、大豆等)中都存在不同强度的内源类
GUS活性 [19-21]。棉花中也存在类似现象, 当花蕾长
度大于 8 mm时, 棉花花药有很强的内源类 GUS活
性, 很容易被 GUS 染液染成蓝色(图 4)。这给 GUS
组织化学分析造成了困难 , 当外源 gus基因表达较
弱或不表达时, 组织中的内源类 GUS活性可能造成
假阳性结果。因此, 抑制内源类 GUS 活性在 GUS
组织化学染色分析中是非常必要的。Kosugi等[21]发
现在GUS染液中加入 20%的甲醇能完全抑制烟草花
粉的内源类 GUS活性。在本实验中, 比较了不同浓
度的甲醇和乙醇的抑制效果。结果发现, 添加 20%
的甲醇不能完全抑制棉花花药的内源 GUS活性, 并
且随着甲醇浓度的升高 , 染色材料以及染液变红 ,
GUS 染色效率有所降低(资料未显示), 而 10%的乙
醇可完全抑制棉花花药中的内源类 GUS活性, 并且
加入乙醇并不影响阳性对照的外源GUS酶活的检测
(图 4和图 5)。同时, 我们用定量 RT-PCR方法检测
了 pTA29:gus 转化子中 gus 基因的表达特异性。两
种方法获得了一致的结果, 说明改良的 GUS染色方
法是可靠的。
TA29首先作为烟草花药特异表达基因被克隆[4]。
原位杂交和启动子 :报告基因的转基因分析表明 ,
TA29 基因专一性地在绒毡层细胞中表达, 表达时期
为减数分裂期到花粉壁增厚期(–1 到+6 期)[4]。我们
发现 pTA29启动子的表达特性在棉花中发生了改变,
与在烟草中不一致。在 pTA29:gus 转基因棉花的花
粉(花粉成熟期, 花蕾长度约 15 mm 时期)和叶片表
皮毛中也检测到 gus 基因的表达。说明 pTA29 启动
子在棉花中的表达范围更广。因此, 当用 pTA29 启
动子控制细胞毒素基因(如 Barnase基因等)创造转
基因棉花雄性不育系时, 可能造成非靶标组织(非花
药组织)的毒害, 从而影响棉花的正常生长发育[22]。
第 12期 尹梦回等: 烟草绒毡层特异启动子 pTA29在棉花中的表达特性 2097


与这一推论一致 , Zhang等 [7-8]的结果显示 pTA29-
Barnase转基因棉花除花药干瘪、花粉无活力外, 也
表现花朵变小、花丝变短等性状。如果用 pTA29 启
动子控制 RNAi 或反义基因抑制花粉或花药特异基
因的表达[22-24], 则可以降低转基因对非靶标组织的
伤害, 获得生长发育正常的转基因雄性不育系。
通过 PCR和 Southern blotting, 在 6号和 8号转
花子中检测到 gus基因的存在(图 3), 但 GUS染色没
有检测到 GUS 活性, 表明转入的 gus 基因未获得有
效表达。棉花基因组较大(陆地棉基因组据估计在
2.2~2.9 Gb)[25], 基因组中重复序列较多。gus基因很
可能因为插入染色体的非活跃区域而不能高效表
达。
4 结论
在GUS染液中添加 10%的乙醇可以抑制棉花花
药内源 GUS 活性。烟草花药绒毡层特异启动子
pTA29 控制的 gus 报告基因主要在棉花花药中表达,
在花蕾长为 6 mm和 15 mm的花药中存在两个表达
高峰。与烟草相比, pTA29启动子在棉花中的表达特
性有所改变, 在叶片表皮毛和花粉中也有表达。
References
[1] Mariani C, De Beuckeleer M, Truettner J, Leemans J, Gold-
berg R B. Induction of male sterility in plants by a chimaeric
ribonuclease gene. Nature, 1990, 347: 737−741
[2] Xu F(徐芳), Xiong A-S(熊爱生), Peng R-H(彭日荷), Hou
X-L(侯喜林), Yao Q-H(姚泉洪). Progress in the study on
conditional male sterility in plants by genetic engineering.
Hereditas(Beijing)(遗传), 2006, 28(4): 507−510(in Chinese
with English abstract)
[3] Yang Z-L(杨泽良), Dang X-M(党选民), Cao Z-M(曹振木), Hu
K-L(胡开林). The application of gene engineering on creating
male sterility in plants. Chin Agric Sci Bull (中国农学通报),
2005, 21(10): 25−29(in Chinese with English abstract)
[4] Koltunow A M, Truettner J, Cox K H, Wallroth M, Goldberg
R B. Different temporal and spatial gene expression patterns
occur during anther development. Plant Cell, 1990, 2:
1201−1224
[5] Denis M, Delourme R, Gourret J P, Mariani C, Renard M.
Expression of engineered nuclear male sterility in Brassica
napus. Plant Physiol, 1993, 101: 1295−1304
[6] Huang S, Cerny R E, Qi Y, Bhat D, Aydt C M, Hanson D D,
Malloy K P, Ness L A. Transgenic studies on the involvement
of cytokinin and gibberellin in male development. Plant
Physiol, 2003, 131: 1270−1282
[7] Zhang Y-M(张玉满), Wang H-Y(王寰宇), Liu Y-L(刘玉乐).
Gene Engineering Insect Resistant Hybrid Cotton (基因工程
抗虫杂交棉). In: Jia S-R(贾士荣), Guo S-D(郭三堆), An
D-C(安道昌), eds. Transgenic Cotton (转基因棉花), Beijing:
Science Press, 2001. pp 235−240(in Chinese)
[8] Zhang H-J(张惠军), Wang H-Y(王寰宇), Shi Y-J(石跃进),
Zhang Y-M(张玉满), Yue J-X(岳见雄), Wu S-J(吴慎杰), Zhu
Y-H(朱永红), Liu Y-L(刘玉乐), Yang H-Y(杨怀义). Cotton
genetic tranformation of barnase male sterility gene. Cotton
Sci (棉花学报), 2007, 19(4): 261−266 (in Chinese with Eng-
lish abstract)
[9] Song H-Y(宋洪元), Cao B-H(曹必好), Ding J-G(丁建刚),
Lei J-J(雷建军), Song M(宋明). Constructions of male steril-
ity gene and fertility restoring gene expression vectors by
Cre/loxp site-specific recombination system. J Agric Bio-
technol (农业生物技术学报), 2004, 12(4): 396−400 (in Chi-
nese with English abstract)
[10] Luo M, Xiao Y H, Li X B, Lu X F, Deng W, Li D M, Hou L,
Hu M Y, Li Y, Pei Y. GhDET2, a steroid 5α-reductase, plays
an important role in cotton fiber cell initiation and elongation.
Plant J, 2007, 51: 419−430
[11] Xiao Y H, Li X B, Yang X Y, Luo M, Hou L, Guo S H, Luo X
Y, Pei Y. Cloning and characterization of a balsam pear class
I chitinase gene (Mcchit1) and its etopic expression enhaces
fungal resistance in transgenic plants. Biosci Biotechnol Bio-
chem, 2007, 71: 1211−1219
[12] Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth
and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol Plant, 1962,
15: 473−497
[13] Shenk R U, Hildebrandt A C. Medium and techniques for in-
duction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous
plant cell cultures. Can J Bot, 1972, 50: 199−204
[14] Li Y-E(李燕娥), Zhu Z(朱祯), Wu X(吴霞), Meng J-H(孟晋
红), Fan X-P(范小平), Wu J-H(吴家和), He J-X(何鉴星), Shi
G-C(史高川), Xiao J-L(肖娟丽), Zhang H-X(张换样). Report
on grafts of transgenic cotton. China Cotton (中国棉花),
2000, 27(3): 25−30(in Chinese)
[15] Xiao Y-H(肖月华), Luo M(罗明), Fang W-G(方卫国), Luo
K-M(罗克明), Hou L(侯磊), Li D-M(李德谋), Pei Y(裴炎).
PCR walking in cotton genome using YADE method. Acta
Genet Sin (遗传学报), 2002, 29(1): 62−66 (in Chinese with
English abstract)
[16] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2nd edn. New York: Cold Spring Harbor
2098 作 物 学 报 第 34卷

Laboratory Press, 1989
[17] Zhu Y Q, Xu K X, Luo B, Wang J W, Chen X Y. An
ATP-binding cassette transporter GhWBC1 from elongating
cotton fibers. Plant Physiol, 2003, 133: 580−588
[18] Jefferson R A, Kavanagh T A, Bevan M W. GUS fusions:
β-glucuronidaseas a sensitive gene fusion marker in higher
plants. EMBO J, 1987, 6: 3901−3907
[19] Hu Q Y, Chee P P, Miller P D. Intrinsic GUS-like activity in
soybean. Soybean Sci, 1991, 10: 200−204
[20] Plegt L, Bino R J. β-Glucuronidase activity during develop-
ment of the male gametophyte from transgenic and
non-transgenic plants. Mol Gen Genet, 1989, 216: 321−327
[21] Kosugi S, Ohashi Y, Nakajima K, Arai Y. An improved assay
for β-glucuronidase in transformed cells: Methanol almost
completely suppresses a putative endogenous β-glucuronidase
activity. Plant Sci, 1990, 70: 133−140
[22] Burgess D G, Ralston E J, Hanson W G, Heckert M, Ho M,
Jenq T, Palys J M, Tang K, Gutterson N. A novel,
two-component system for cell lethality and its use in engi-
neering nuclear male-sterility in plants. Plant J, 2002, 31:
113−125
[23] Kapoor S, Kobayashi A, Takatsuji H. Silencing of the
tapetum-specific zinc finger gene TAZ1 causes premature de-
generation of tapetum and pollen abortion in Petunia. Plant
Cell, 2002, 14: 2353−2367
[24] Mansoor S, Amin I, Hussain M, Zafar Y, Briddon R W. En-
gineering novel traits in plants through RNA interference.
Trends Plant Sci, 2006, 11: 559−565
[25] Wendel J F, Cronn R C, Johnston J S, Price H J. Feast and
famine in plant genomes. Genetica, 2002, 115: 37−47