全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(6): 1151−1155 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30800084)和国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10A103)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 李平，E-mail: liping6575@163.com ** 共同第一作者
Received(收稿日期): 2009-01-12; Accepted(接受日期): 2009-03-23.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01151
一个水稻雄性不育突变体的遗传分析和基因定位
初明光 李双成** 王世全 邓其明 张 婧 丁 磊 文 勇 郑爱萍
周星宇 李 平*
四川农业大学水稻研究所, 四川温江 611130
摘 要: ms-np是一个源于自然突变的水稻雄性不育突变体, 明显较正常植株矮小, 叶色浓绿。小花解剖观察发现, 突
变体小花花丝细长, 花药干瘪, 呈白色透明状, 但雄性器官的数量和雌性器官正常。碘染证实, 突变体的花药壁内没
有花粉粒着色, 是一个典型的无花粉型雄性不育材料。5 个 F2和 2 个 BC1F1群体的遗传分析显示, 该突变性状受 1
对隐性基因控制。对组合 ms-np/M63 衍生 F2不育单株的连锁分析表明, ms-np(t)基因位于水稻第 6 染色体微卫星标
记 RM541和 RM343之间, 遗传距离分别为 15.2 cM和 7.9 cM。
关键词: 水稻; 雄性不育; 遗传分析; 基因定位
Genetic Analysis and Molecular Mapping of a Male Sterile Mutant in Rice
CHU Ming-Guang, LI Shuang-Cheng**, WANG Shi-Quan, DENG Qi-Ming, ZHANG Jing, DING Lei,
WEN Yong, ZHENG Ai-Ping, ZHOU Xing-Yu, and LI Ping*
Rice Research Institute, Sichuan Agricultural University, Wenjiang 611130, China
Abstract: Male sterility is an important inheritance phenomenon in plants and widely used in hybrid seed production. The male
sterile plant cant produce normal male gametophyte for reproduction, while the female counterpart is normal. So far, more than
100 of male sterile mutants or genes have been reported in rice. Ms-np is a male-sterile mutant derived from a spontaneous muta-
tion. The filaments of the mutant are long and thin, and the withered anthers are white and transparent. Ms-np was confirmed to be
a none-pollen type mutant of male sterility, for no pollen grains were stained with I2-KI solution and the anther locules were al-
ways hollow. Genetic analysis of five F2 populations and two BC1F1 populations revealed that the mutation was controlled by a
single recessive gene. To uncover the molecular basis of ms-np, the F2 population derived from the cross of ms-np/M63 was used
for genetic mapping. Screening of 227 F2 mutant individuals with simple sequence repeat (SSR) markers indicated that ms-np(t)
was located between the molecular markers RM541 and RM343, on chromosome 6, with the distances of 15.2 and 7.9 cM, re-
spectively. The results provide a basis for further gene cloning and understanding of the molecular mechanism underlying rice
male fertility.
Keywords: Rice; Male sterility; Genetic analysis; Mapping
植物雄性不育是其在有性繁殖过程中不能产生正常
可育雄配子体的遗传现象, 它广泛存在于开花植物中。小
孢子母细胞在花粉囊中进行减数分裂产生小孢子 , 进一
步发育成花粉粒。当花粉囊裂开时, 成熟的花粉粒被释放
出来。任何参与雄蕊发育、孢原细胞分化、减数分裂、小
孢子的有丝分裂、花粉分化等过程基因的突变, 均能引起
花药发育异常, 最终导致雄性不育[1-2]。目前在水稻上报道的
雄性不育突变体或基因已经有 70 多个[3], 雄性不育胞质
达 30多种 [4], 其中超过 30个核基因实现了染色体定位。
近年来, 已经有很多关于细胞核雄性不育的基因被
克隆。Ms2基因是用转座子标签法在拟南芥中克隆的第一
个细胞核雄性不育基因[5]。此外, 人们还从拟南芥中克隆
了雄性不育基因 Ms1 和 Bcp1[6-7]。Ms45 基因是从玉米中
克隆的细胞核雄性不育基因[8], Ms5则是由 T-DNA标签法
克隆得到的另一核雄性不育基因[9]。目前从水稻中克隆的
基因大致包括与绒毡层发育及降解有关的基因 Udt1 及
TDR [10-11]; 与小孢子母细胞减数分裂有关的基因 PAIR1、
PAIR2; 与孢原细胞的分化有关的 MSP1[12]; 雄性育性的
调控基因 Ugp1、Ugp2、AID1和 OsGAMYB [13-14]。因此, 雄
配子体发育的部分过程和调控机制已经逐渐明朗。更多雄
性不育基因的克隆将有助于更全面地了解雄配子体发育
的分子机制。
1152 作 物 学 报 第 35卷

本研究对一个衍生自籼/籼稻杂交组合的雄性核不育
材料进行了初步的表型鉴定、遗传分析和分子标记定位,
以期为该基因的精细定位、分离克隆及其在水稻生殖生长
中的功能等相关研究打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
水稻雄性不育突变体材料 ms-np 来源于一个籼/籼稻
杂交组合后代的自然突变体。其他野生型水稻材料 M63、
527R、881R、885R 和 D62B, 均由四川农业大学水稻研
究所提供。
1.2 突变体外观形态观察及花粉育性鉴定
取突变体成熟颖花在解剖镜下进行形态观察; 同时
挑出花药捣碎, 用 1% I2-KI染色, 在显微镜下根据花粉粒
形态和染色状况, 分析可育和败育的花粉及败育类型。
1.3 突变体育性稳定性调查
2005 年分别在四川成都与海南陵水对突变体的育性
稳定性进行调查。于水稻开花期随机选取水稻小穗 20个,
再于每个小穗的不同部位选择 8~12 朵成熟小花, 按 1.2
中的方法对小花进行育性鉴定。同时去除其余小穗, 一定
时期后对再生小穗进行育性调查; 再次去除其余小穗, 重
复调查再生小穗育性。总计调查小花育性 3次, 以评价突
变体在不同光、温环境下的育性稳定性。
1.4 突变性状的遗传
群体构建：2005 年在温江以该突变体为母本, 分别
与 M63、527R、881R、885R 和 D62B 等杂交, 在海南陵
水种植 F1并套袋自交, 2006 年在温江种植 F2。同时利用
其与 527R和 D62B杂交的 F1作为父本与突变体测交, 在
温江种植回交一代植株。成熟时以群体为单位分单株统计
突变性状的分离情况, 进行遗传分析。
1.5 基因定位
1.5.1 作图群体 以组合 ms-np/M63 的 F2群体作为该
基因的定位群体, 其中含有突变型单株 227株。
1.5.2 水稻叶片总DNA的提取 取新鲜叶片少许放入
1.5 mL离心管, 置液氮中, 用镊子研磨成粉末; 加 65℃预
热的 DNA 提取液(100 mmol L−1 Tris-Cl; 50 mmol L−1
EDTA; 500 mmol L−1 NaCl; 1.5% SDS; pH 8.0) 700 μL, 摇
匀, 水浴 65℃保温 20~30 min, 并不时摇动以免结团; 再
加 180 μL 5 mol L−1醋酸钾溶液, 混匀后 0℃冰浴 20~30
min; 每管加入 24∶1 的氯仿/异戊醇 400 μL, 充分混匀,
室温下放置 10~20 min, 12 000×g离心 6 min; 吸取上清液
至另一干净离心管, 加入−20℃预冷的 0.6~1.0 倍体积的
异丙醇或 2倍体积的无水乙醇, 缓慢混匀, 沉淀 DNA; 小
心倒出液体, 以 70%的乙醇洗涤 2~3次, 然后用无水乙醇
脱水, 吹干; 加 500~1 000 μL超纯水溶解备用。
1.5.3 SSR分析 (1) 微卫星引物分析: 以均匀分布于
水稻染色体上的 512 对微卫星引物(序列由康乃尔大学公
布, 由上海 invitrogen 生物技术有限公司合成)筛选亲本,
差异标记分别在由 M63、ms-np、4株可育株、6株不育株
构成的小群体中进行连锁分析。对小群体得到的连锁标记
进一步在所有的不育单株中进行连锁验证和连锁分析。(2)
PCR扩增: 反应体系总体积为 20 μL, 包含 2 μL模板DNA,
2 pmol SSR前、后引物各 1 μL, 10×PCR buffer (含镁离子)
2 μL, 2.5 mmol L−1 dNTP 2 μL, Taq DNA聚合酶 1 U,
ddH2O 12 μL; 扩增程序为 94℃预变性 5 min; 94℃变性 45
s, 55℃退火 45 s, 72℃延伸 1 min; 35个循环后 72℃延伸
10 min。(3)电泳: 在扩增产物中加入 3 μL 6×loading buffer,
混匀, 用 3%~4%的琼脂糖凝胶(加微量 EB)于 0.5×TBE缓
冲液中 120 V下电泳 2~4 h左右, 在凝胶扫描成像系统记
录电泳分离结果。
1.5.4 遗传作图 将具有野生型亲本带型的单株记为
“1”, 具有突变体亲本带型的单株标记为“2”, 具有二
者杂合带型的单株记为“3”, 利用 mapmaker 3.0软件对
分离群体的不育性状和分子标记的分离数据进行连锁分
析, 并进行遗传图距(cM)的计算。
2 结果与分析
2.1 突变体形态
突变体植株明显较正常植株(姊妹株)矮小 , 叶色浓
绿。突变体最明显的特征就是自然结实率低, 仅有 10%左
右(图 1-A); 套袋自交的突变体的结实率为 0, 说明自然状
态下的结实实际上是异花授粉的结果。小花的解剖观察发
现, 正常材料到花期时雄蕊饱满, 颜色淡黄(图 1-B); 而突
变体小花花丝细长, 花药干瘪, 呈白色透明状, 但雄性器
官的数量和雌性器官形态正常(图 1-C)。碘染证实, 突变
体的花药捣碎后没有花粉粒着色(图 1-D, E), 据此认为突
变体是一个典型的无花粉型雄性不育材料 , 并命名为
ms-np (male sterility with no pollen grains)。
2.2 突变体育性稳定性
不同生态区域和生育时期小穗育性观察结果表明 ,
突变体在不同光周期和温度条件下均表现稳定不育 , 证
实该不育特性不受光温调控, 隶属普通核不育类型(表 1)。
2.3 突变性状的遗传
以突变体ms-np作为母本, 分别与M63、527R、881R、
885R、D62B杂交衍生 F2群体, 同时利用 ms-np×D62B和
ms-np×527R的 F1与突变体 ms-np回交衍生 BC1F1代植株,
调查突变性状在各种背景下的分离。结果表明, 所有群体
的 F1植株均表现正常可育, F2和 BC1F1出现育性分离, 说
明该育性性状受核基因控制而不受胞质基因组的影响 ,
可育相对不育为显性。在所有 F2群体中, 育性均符合 3∶
1的分离, 而BC1F1植株则符合 1∶1的分离规律(表 2), 表
明该不育性状为单个基因控制的隐性突变。
2.4 ms-np(t)基因的初步定位
利用均匀分布于水稻 12条染色体上的 512对 SSR引
物分析雄性不育突变体和 M63, 筛选在两个亲本间具有
多态性的引物。对差异标记分别在由亲本、4株可育株、
第 6期 初明光等: 一个水稻雄性不育突变体的遗传分析和基因定位 1153




图 1 突变体的形态特征
Fig. 1 Phenotype of the mutants
A：正常材料(左)与突变体(右)的株型对比; B：正常水稻小花; C：突变体小花; D：正常花粉染色; E：突变体的花药染色。
A: comparison of the plant character of the normal plant (left) and the mutant (right); B: a normal floret; C: a mutant floret;
D: staining of the normal pollen grains; E: staining of the mutant anther locule.

表 1 突变体育性稳定性
Table 1 Stability of the mutant fertility
区域
Location
时期
Date
(month/day)
调查小花数(个)
No. of investi-
gated florets
可育小花数(个)
No. of fertile
florets
海南陵水 3/20 196 0
Lingshui,
Hainan 4/10 203 0
4/30 187 0

四川温江 8/30 234 0
Wenjiang,
Sichuang 9/20 212 0
10/10 201 0

6株不育株构成的小群体中进行初步连锁分析。发现位于
第 6 染色体上的 SSR 标记 RM3、RM541 和 RM343 与突
变性状存在连锁关系。进一步用 F2 群体的所有隐性单株
(227 株)对这 3 个标记进行分析, 结果显示突变基因与上
述标记表现明显的连锁(图 2), 遗传距离分别为 15.2、15.2
和 7.9 cM。其中 RM3 和 RM541 表现共分离, 与 RM343
分别位于突变基因的两侧。根据各标记在基因组上的位置,
ms-np(t)基因被初步定位在水稻第 6 染色体上的微卫星标
记 RM541和 RM343之间(图 3)。
3 讨论
雄性不育可以分为核不育和细胞质不育(包括核质互
作不育)两种类型, 其中细胞核雄性不育又包括显性核不
育与隐性核不育两类。根据育性是否受光照、温度等外界
条件影响, 核不育又可以分为光(温)敏核不育和普通核不
育两种类型。根据 GRAMENE(http://www.gramene.org)网
站的数据库记载, 目前在该数据库登录的雄性不育基因大
致有 120多个, 其中大约有 20多个属于细胞质雄性不育类

表 2 突变性状在群体中的分离
Table 2 Segregation of the mutation in different populations
组合
Population
群体大小
Total number of
individuals
正常株
No. of wild-type
individuals
突变株
No. of mutant
individuals
期望比例
Expected value
χ2
ms-np×M63 871 644 227 3:1 0.47
ms-np×527R 339 259 80 3:1 0.28
ms-np×881R 374 275 99 3:1 0.36
ms-np×885R 233 181 52 3:1 0.75
ms-np×D62B 411 315 96 3:1 0.51
ms-np×(ms-np×D62B) 311 149 162 1:1 0.46
ms-np×(ms-np×527R) 277 147 130 1:1 0.92
P0.05,1=3.84.

1154 作 物 学 报 第 35卷



图 2 连锁标记在群体中的分离
Fig.2 Segregation patterns of the linked makers in F2 populations
1: M63; 2: ms-np; 3~6为 F2群体中可育株; 7~12为 F2群体中不育株。
1: M63; 2: ms-np; 3–6: fertile plants in F2 population;
7–12: sterile plants in F2 population.



图 3 SSR标记和雄性核不育基因的局部连锁图
Fig. 3 Linkage map of the ms-np(t) gene and SSR makers

型, 约有 30 多个核不育基因实现了染色体定位。其中光
敏核不育基因主要定位在第 3、5、6、7、11、12 染色体
上, 温敏核不育基因则主要定位在第 2、6、7、8、9、10
染色体上[15]。而核质互作雄性不育(恢复)基因主要被定位
在第 10 染色体的长臂上[16-18], 其他染色体上也有定位报
道[19]。但目前在水稻第 6 染色体上报道的基因仅有 4 个,
即 ms9、ms64、ms75(pgms)和 ms82(tms3)。ms75(pgms)、
ms82(tms3)分别属于光、温敏型核不育, 与 ms-np(t)不属
于同一类型; 而 ms9 和 ms64 同属于普通核不育类型, 但
均由早期的形态学标记定位 , 它们之间的等位关系尚需
要进一步验证。
利用不育突变体与 M63 杂交衍生的分离群体, 成功
地将 ms-np(t)定位在第 6 染色体上的微卫星标记 RM541
和 RM343 之间。但这只是初步界定, 因差异引物十分匮
乏, 尚未实现精细定位。我们又尝试在其他群体内进行定
位, 结果发现多态性仍然不丰富, 这可能与初期配制群体
的亲本材料遗传基础比较狭窄有关(虽然我们曾尝试籼粳
交, 但 F1 育性不正常)。要实现该基因的精细定位, 配制
亲本间遗传差异足够大、F1植株育性正常的分离群体至关
重要。目前, 我们已经配制了一些亲缘关系较远的组合,
期望能够实现该基因的精细定位。
隐性核不育材料在育种上的应用目前主要集中在以
轮回选择为主要手段的群体改良上。杂交、轮回和周期性
的杂交有利于打破不利连锁, 实现有益基因的累加, 从而
拓宽育种的质源。目前已经有研究人员利用隐性核不育材
料育成高产、优质的不育系、恢复系或杂交组合, 表明隐
性核不育材料在水稻育种应用上具有一定的价值。不仅如
此 , 隐性核不育的克隆和表达调控可能创造新的杂种优
势的利用途径。有研究者认为克隆育性控制基因, 在该基
因前面人为添加一个可以受化学物质调控的启动子 , 从
而控制基因的表达活性, 达到人为操纵植物育性的目的。
这样既实现了一系两用 , 又摆脱了目前三系育种受恢保
关系制约的瓶颈 , 因为凡是育性正常的水稻材料都可以
作为该材料的恢复系 , 可能对水稻杂种优势的利用产生
较深远的影响。
References
[1] Ma H. Molecular genetic analysis of microsporogenesis and
microgametogenesis in flowering plants. Annu Rev Plant Biol,
2005, 56: 393–434
[2] Glover J, Grelon M, Craig S, Chaudhury A, Dennis E. Cloning
and characterization of Ms5 from Arabidopsis: A gene critical in
male meiosis. Plant, 1998, 15: 345–356
[3] Kinoshita T. Gene symbols and information on male sterility.
Rice Genet Newsl, 1997, 14: 13–22
[4] Schnable P S, Wise R P. The molecular basis of cytoplasmic
male sterility and fertility restoration. Trends Plant Sci, 1998, 3:
175–180
[5] Aarts M G M, Dirkse W G, Stiekema W J, Pereira A. Transposon
tagging of a male sterility gene in Arabidopsis. Nature, 1993, 363:
715–717
[6] Wilson Z A, Morroll S M, Dawson J, Swarup R, Tighe P J. The
Arabidopsis MALE STERILITY1(MS1) gene is a transcriptional
regulator of male gametogenesis, with homology to the PHD-
finger family of transcription factors. Plant, 2001, 28: 27–39
[7] Xu H, Knox R B, Taylor P E, Sinhg M B. Bcp1, a gene required
for male fertility in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 1995,
92: 2106–2110
[8] Cigan A M, Unger E, Xu R J, Kendall T, Fox T W. Phenotypic
complementation of ms45 maize requires tapetal expression of
MS45. Sex Plant Reprod, 2001, 14: 135–142
[9] Ross K J, Fransz P, Armstrong S J, Vizir I, Mulligan B, Franklin
F C H, Jones G H. Cytological characterization of four meiotic
mutant of Arabidopsis isolated from T-DNA transformed lines.
Chromosome Res, 1997, 5: 551–559
[10] Jung K H, Han M J, Lee Y S, Kim Y W, Hwang I, Kim M J, Kim
Y K, Nahm B H, An G. Rice undeveloped tapetum1 is a major
regulator of early tapetum development. Plant Cell, 2005, 17:
2705–2722
[11] Solomon M, Belenghi B, Delledonne M, Menachem E, Levine A.
The involvement of cysteine proteases and protease inhibitor
genes in the regulation of programmed cell death in plants. Plant
Cell, 1999, 11: 431–443
[12] Nonomura K I, Miyoshi K, Eiguchi M, Suzuki T, Miyao A, Hi-
rochika H, Kurata N. The MSP1 gene is necessary to restrict the
number of cells entering into male and female sporogenesis and
to initiate anther wall formation in rice. Plant Cell, 2003, 15:
1728–1739
第 6期 初明光等: 一个水稻雄性不育突变体的遗传分析和基因定位 1155


[13] Zhu Q H, Ramm K, Shivakkumar R, Dennis E S, Upadhyaya N
M. The ANTHER INDEHISCENE1 gene encoding a single
MYB domain protein is involved in anther development in rice.
Plant Physiol, 2004, 135: 1514–1525
[14] Miyuki K, Yoshiaki I, Miyako U T, Hironori I, Takeshi I, Yuhko
K, Tsukaho H, Akio M, Hirohiko H, Motoyuki A, Makoto M.
Loss-of-function mutations of the rice GAMYB gene impair
α-amylase expression in aleurone and flower development. Plant
Cell, 2004, 16: 33–44
[15] Lu X-G(卢兴桂), Gu M-H(顾铭洪). The Principles and Tech-
niques of Two-Line Hybrid Rice (两系杂交水稻理论与技术).
Beijing: Science Press, 2001 (in Chinese)
[16] Tan X L, Vnavichit A, Amornsilpa S, Trangoonrung S. Mapping
of rice Rf gene by bulked line analysis. DNA Res, 1998, 5: 15–18
[17] Norio I, Noaki K, Akiko I, Atsushi N, Yoko K, Yumi Y, Masaaki
O, Shiro S, Hiromori A, Kenichi H, Choyu S, Tatsuhito F, Hiro-
aki S. A rapid PCR-aided selection of a rice line containing the
Rf-1 gene which is involved in restoration of the cytoplasmic
male sterility. Mol Breed, 1997, 3: 195–202
[18] Liang G-H(梁国华), Yan C-J(严长杰), Tang S-Z(汤述翥). Mo-
lecular location of a fertility restorer gene for BT type CMS rice.
Chin J Rice Sci (中国水稻科学), 2001, 15(2): 89–92 (in Chinese
with English abstract)
[19] Bharaj T S, Bains S S, Sidhu G S, Gagneja M R. Genetics of fer-
tility restoration of ‘wild abortive’ cytoplasmic male sterility in
rice. Euphytica, 1991, 56: 199–203