全 文 ：·生物技术· 北方园艺２０１６（０２）：１１０～１１２
第一作者简介：吴新义（１９８４－），男，河南南阳人，博士，助理研究员，
研究方向为瓠瓜和豇豆基因组学及分子育种。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｕｘｉｎｙｉ＠
ｍａｉｌ．ｚａａｓ．ａｃ．ｃｎ．
责任作者：李国景（１９６６－），男，博士，研究员，研究方向为蔬菜育种
与栽培技术。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｇｊ＠ｍａｉｌ．ｚａａｓ．ａｃ．ｃｎ．
基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（ＬＹ１４Ｃ１５０００４）；浙江省
农业新品种选育重大科技专项资助项目（２０１２Ｃ１２９０３）。
收稿日期：２０１５－１０－０８
ＤＯＩ：１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１６０２０２９
瓠瓜基因组测定
吴 新 义，徐 　 沛，吴 晓 花，汪 宝 根，鲁 忠 富，李 国 景
（浙江省农业科学院 蔬菜研究所，浙江 杭州３１００２１）
　　摘　要：以４份来自中国不同地区的瓠瓜（Ｌａｇｅｎａｒｉａ　ｓｉｃｅｒａｒｉａ（Ｍｏｌｉｎａ）Ｓｔａｎｄｌ．）纯系为试
材，采用流式细胞术测定其基因组大小。结果表明：６种细胞核裂解液对瓠瓜嫩叶进行处理，发现
Ｏｔｔｏ　Ｉ最适合瓠瓜细胞裂解；从５种候选内标作物中筛选出水稻日本晴（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．ｖａｒ．Ｎｉｐ－
ｐｏｎｂａｒｅ）为最适内标作物；４份中国瓠瓜种质资源的基因组大小为３２９．１１～３４４．５６Ｍｂ。
关键词：瓠瓜；基因组；流式细胞术；水稻
中图分类号：Ｓ　６４２．９０３．６　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１６）０２－０１１０－０３
　　瓠瓜（Ｌａｇｅｎａｒｉａ　ｓｉｃｅｒａｒｉａ（Ｍｏｌｉｎａ）Ｓｔａｎｄｌ．）属葫芦
科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）葫芦属（Ｌａｇｅｎａｒｉａ），又名瓠子、长瓜、
蒲瓜、夜开花、葫芦等。瓠瓜起源于非洲，随后可能在亚
洲和非洲得到独立驯化，目前在全世界各地均有种
植［１－２］。瓠瓜雌雄异花同株，其果实形状变异很大［３］。瓠
瓜成熟果可作容器、乐器或工艺品；瓠瓜也是传统的药
用植物，其蔓、须、叶、花、子、壳均可入药［１］。近年来瓠瓜
常作为黄瓜、西瓜等作物嫁接用砧木，以增强后者的抗
病性［４］。在我国瓠瓜栽培已经有７　０００多年的历史，主
要以嫩果做蔬菜用，是我国南方地区重要的瓜类蔬菜作
物之一。
瓠瓜为同源二倍体植物，染色体数目为２ｎ＝２ｘ＝２２［５］。
由于缺乏基因组信息，瓠瓜分子生物学研究远落后于黄
瓜、西瓜、甜瓜等其它葫芦科作物。随着测序技术的发
展和测序成本的大幅度降低，使得对瓠瓜等我国传统特
色蔬菜作物进行全基因组测序成为可能。评估一个物
种基因组大小是对该物种进行全基因组测序的前提，基
于该物种的基因组大小信息，可以估算测序成本，并为
基因组文库构建、测序深度和基因组组装提供理论依
据。基因组大小是指一个物种单倍体核的ＤＮＡ含量，
常用质量（ｐｇ）和碱基对的数目（Ｍｂ）来量化，１ｐｇ＝９７８Ｍｂ
或１Ｍｂ＝１．０２２×１０－３　ｐｇ［６］。目前测定基因组大小的
方法通常有２种，即Ｆｅｕｌｇｅｎ分光光度法和流式细胞术。
流式细胞术由于高效、准确等优点，目前被广泛应用于
测定物种的基因组大小［７］。现以４份中国瓠瓜种质资
源为材料，采用流式细胞术测定其基因组大小，以期为
瓠瓜分子生物学研究提供理论参考。
１　材料与方法
１．１　试验材料
以４份来自中国不同地区的瓠瓜纯系作为供试材
料，编号为Ｊ７③、Ｉ７７①、Ｇ８－２①、Ｇ６－３－５②；水稻（日本晴）、
番茄、黄瓜、甜瓜、萝卜作为候选内标。
１．２　试验方法
１．２．１　细胞核裂解液配方　６种细胞核裂解液配方见
表１，裂解效果最高的将用于流式细胞术试验。
１．２．２　样品处理及ＤＮＡ特异性染色　选择１ｃｍ２大小
的瓠瓜嫩叶组织置于培养皿上，加入１ｍＬ的细胞核裂
解液，用锋利的刀片迅速将其切碎，用４００目的尼龙网过
滤除去悬浮物，５　０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，弃去上清液后再
次离心，用移液器将多余的上清液吸走，加入２００μＬ的
碘化丙啶溶液（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），反复吸打后制成细胞核
悬浮液备用，整个过程均在冰上操作。采用同样的方法
获得内标作物的细胞核悬浮液备用。
１．２．３　基因组大小的测定与计算　采用ＢＤ　ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ
流式细胞仪进行基因组大小测定。设定参数为：４８８ｎｍ
蓝光激发，收集ＦＬ２通道的荧光，检测ＰＩ的发射荧光强
度。每个样本至少收集１万个细胞，每个样品重复测定
３次。
１．３　项目测定
样本基因组大小计算采用ＤＯＬＥＥＬ等［８］的公式计
算，即：样品基因组大小＝内标基因组大小× （样品２Ｃ
ＤＮＡ峰值／内标２ＣＤＮＡ峰值）。
０１１
北方园艺２０１６（０２）：１１０～１１２ ·生物技术·
　　　　　　表１　 ６种细胞核裂解液配方
　　Ｔａｂｌｅ　１ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｏｆ　ｓｉｘ　ｎｕｃｌｅｉ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｂｕｆｅｒｓ
裂解液
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｂｕｆｅｒ
配方
Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ
参考文献
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
Ｏｔｔｏ　Ｉ　 ０．１ｍｏｌ／Ｌ　ｃｉｔｒｉｃ　ａｃｉｄ，０．５％ （ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ　２０ ［８］
Ｇａｌｂｒａｉｔｈ’ｓ　 ２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＯＰＳ，４５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２·６Ｈ２Ｏ，３０ｍｍｏｌ／Ｌ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，ｐＨ　７．０ ［９］
Ｃｈｏｐｐｉｎｇ　 ４４．８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２，４６ｍｍｏｌ／Ｌ　ｃｉｔｒｉｃ　ａｃｉｄ，２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＯＰＳ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，５０μｇ／ｍＬ　ＲＮａｓｅＡ ［９］
ＬＢ０１　 １５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ，２ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｎａ２ＥＤＴＡ，０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ｓｐｅｒｍｉｎｅ·４ＨＣｌ，８０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ，２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，１５ｍｍｏｌ／Ｌβ?巯基乙醇，ｐＨ　７．５ ［８］
ＧＰＢ　 ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ｓｐｅｒｍｉｎｅ·４ＨＣｌ，３０ｍｍｏｌ／Ｌ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ，２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＯＰＳ，８０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ，２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ，０．５％ （ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，ｐＨ　７．０ ［１０］
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ａ　 ＭｇＳＯ４Ｂｕｆｅｒ：（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ，５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ　８．０），１０％ （ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，１ｍｇ／ｍＬ　ＤＴＴ ［１１］
１．４　数据分析
利用流式细胞仪自带软件（ＣｅｌＱｕｅｓｔ　Ｐｒｏ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）
分析和处理所得的图像和数据。
２　结果与分析
２．１　细胞核裂解液选择
根据６种细胞核裂解液制备的细胞核悬浮液在流
式细胞仪上显示的ＤＮＡ峰图，Ｏｔｔｏ　Ｉ的裂解效果最好
（图１ａ、ｂ），获得的２Ｃ和４ＣＤＮＡ峰清晰可见，峰图质
量高而且同一材料的重复性较好。Ｇａｌｂｒａｉｔｈ’ｓ　Ｂｕｆｅｒ
和ＬＢ０１的效果次之，其余裂解液的效果均较差，说明
Ｏｔｔｏ　Ｉ是最适合瓠瓜进行流式细胞术研究的细胞核裂
解液。
注：ａ，单独的瓠瓜样品；ｂ，单独的水稻样品；ｃ，瓠瓜和水稻的混合样品。
Ｎｏｔｅ：ａ，Ｂｏｔｔｌｅ　ｇｏｕｒｄ　ｓａｍｐｌｅ；ｂ，Ｒｉｃｅ　ｓａｍｐｌｅ；ｃ，Ｍｉｘｅｄ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ　ｂｏｔｔｌｅ　ｇｏｕｒｄ　ａｎｄ　ｒｉｃｅ．
图１　部分分离后的细胞核的相对荧光含量（相对ＤＮＡ含量）
Ｆｉｇ．１　Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ＤＮＡ　ｃｏｎｔｅｎｔ）ｏｆ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｐｌａｎｔ　ｎｕｃｌｅｉ
２．２　内标选择
采用Ｏｔｔｏ　Ｉ裂解液，测得瓠瓜、番茄、水稻、黄瓜、萝
卜、甜瓜的２ＣＤＮＡ峰值分别为１６１．５、４３８．０、２１４．５、
１８４．５、２９９．０、２１７．０。从峰值的位置来看，番茄与瓠瓜
的２ＣＤＮＡ峰值相距较大，可能增大最终的计算误差；
黄瓜与瓠瓜的２ＣＤＮＡ峰值有重叠，表明二者混合后
可能无法区分；萝卜与瓠瓜的２ＣＤＮＡ峰值能够清楚
地分开，但与瓠瓜的４ＣＤＮＡ峰值可能有重叠；水稻和
甜瓜与瓠瓜的２ＣＤＮＡ峰值既能清楚地分开，位置相
距又不大（图１ｃ），因而最适宜做为瓠瓜基因组测定的
内标。
２．３　瓠瓜基因组大小计算
该研究选择水稻作为内标作物测定瓠瓜的基因组
大小，水稻的基因组大小约为４３０Ｍｂ［１２］，其２ＣＤＮＡ峰
值平均为１９５．３１，瓠瓜的２ＣＤＮＡ峰值平均为１５１．８５，
根据水稻和瓠瓜的峰值的倍数关系，计算出瓠瓜的基因
组大小约为３２９．１１～３４４．５６Ｍｂ，且材料间基因组大小
差异并不显著（表２）。
表２ 瓠瓜基因组大小测定结果
　　Ｔａｂｌｅ　２ Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　ｂｏｔｔｌｅ　ｇｏｕｒｄ
品种
Ｖａｒｉｅｔｙ
瓠瓜峰值位置
Ｐｅａｋ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ
ｏｆ　ｂｏｔｔｌｅ　ｇｏｕｒｄ
水稻峰值位置
Ｐｅａｋ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ
ｏｆ　ｒｉｃｅ
二者比值
Ｒａｔｉｏ
瓠瓜基因组大小
Ｇｅｎｏｍｅ　ｓｉｚｅ　ｏｆ
ｂｏｔｔｌｅ　ｇｏｕｒｄ／Ｍｂ
平均值
Ｍｅａｎ
ｖａｌｕｅ
１　 １４８　 １９４　 ０．７６２　９　 ３２８．０５　 ３２９．１１
Ｊ７③ ２　 １４９　 １９３　 ０．７７２　０　 ３３１．９６
３　 １５３　 ２０１　 ０．７６１　２　 ３２７．３２
１　 １５６　 ２０６　 ０．７５７　３　 ３２５．６４　 ３３３．７２
Ｉ７７① ２　 １６２　 ２０９　 ０．７７５　１　 ３３３．２９
３　 １５６　 １９６　 ０．７９５　９　 ３４２．２４
１　 １６１　 １８９　 ０．８５１　９　 ３６６．３２　 ３４４．５６
Ｇ８－２① ２　 １４７　 １８６　 ０．７９０　３　 ３３９．８３
３　 １４７　 １９３　 ０．７６１　７　 ３２７．５３
１　 １５７　 ２０３　 ０．７７３　４　 ３３２．５６　 ３３２．９６
Ｇ６－３－５② ２　 １４４　 １９０　 ０．７５７　９　 ３２５．９０
３　 １５２　 １９２　 ０．７９１　７　 ３４０．４３
３　讨论
该研究确定以水稻作为内标，测定了４份中国瓠
瓜的基因组大小，为瓠瓜的全基因组测序及基因组学
１１１
·生物技术· 北方园艺２０１６（０２）：１１０～１１２
研究提供了基础数据。在流式细胞术分析中，样品前
处理至关重要，其中合适的细胞核裂解液起着关键的
作用。ＡＣＨＩＧＡＮ－ＤＡＫＯ等［１３］曾使用Ｇａｌｂｒａｉｔｈ’ｓ　Ｂｕｆ－
ｅｒ测定瓠瓜基因组大小，该研究通过比较６种细胞核裂
解液对瓠瓜嫩叶的处理效果，发现Ｏｔｔｏ　Ｉ比Ｇａｌｂｒａｉｔｈ’ｓ
Ｂｕｆｅｒ的效果更好，不仅峰图质量高，而且不同材料间稳
定性最强。在细胞核悬浮液的制备及染色上，传统的做
法是对离心收集到的细胞核再次加入细胞核裂解液，制
成细胞核悬浮液，然后加入染料染色２０～１２０ｍｉｎ［１４－１５］，该
研究对离心收集到的细胞核加入ＰＩ染色液制成细胞核
悬浮液，直接上机进行测定，与传统方法相比，节省了染
色的时间，而且能最大限度的保持细胞核的完整性，使
得测定结果更为准确。
在该研究中，通过比较瓠瓜与番茄等其它５种作
物的２ＣＤＮＡ峰图，认为水稻和甜瓜的ＤＮＡ峰与瓠瓜
差距不大且能清楚地区分，因而适合作为内标。水稻
品种“日本晴”是已经测序且序列组装质量较高的品
种，其基因组序列和大小得到了深入的研究，以该品种
作为内标可以确保瓠瓜基因组大小测定的准确性。
ＡＣＨＩＧＡＮ－ＤＡＫＯ等［１３］曾以萝卜为内标，利用流式细胞
仪测定非洲和美洲瓠瓜的２ＣＤＮＡ含量为０．６８３～
０．７７６ｐｇ，对应基因组大小约为３３３～３７９Ｍｂ，该研究还
发现不同材料间的基因组大小存在１２％的变异。该研
究测定的瓠瓜基因组大小为３２９．１１～３４４．５６Ｍｂ，尽管
使用的内标不一样，但２份独立的试验获得的结果较为
一致。
（致谢：感谢浙江大学张宪银和李梅在细胞核提取
液选择、试验方法优化方面提供的帮助。）
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ｍｅｔｒｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｌａｇｅｎａｒｉａ　ｓｉｃｅｒａｒｉａ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｇｅｎｏｍｅ　ｓｉｚｅ　ｗｉｔｈ　ｕｓａｇｅ　ｔｙｐｅｓ　ａｎｄ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｅｌｅｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｓｙｓｔ　Ｅｖｏｌ，
２００８，２７６：９－１９．
［１４］邓果特，刘清波，蒋建雄，等．五节芒基因组大小测定［Ｊ］．植物遗传资
源学报，２０１３，１４（２）：３３９－３４１．
［１５］李祯，伊贤贵，顾宇，等．山樱花基因组大小的测定［Ｊ］．南京林业大学
学报（自然科学版），２０１４，３８（Ｓ１）：１７－１９．
Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｏｍｅ　ｏｆ　Ｂｏｔｌｅ　Ｇｏｕｒｄ
ＷＵ　Ｘｉｎｙｉ，ＸＵ　Ｐｅｉ，ＷＵ　Ｘｉａｏｈｕａ，ＷＡＮＧ　Ｂａｏｇｅｎ，ＬＵ　Ｚｈｏｎｇｆｕ，ＬＩ　Ｇｕｏｊｉｎｇ
（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　３１００２１）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ　ｆｏｕｒ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｂｏｔｔｌｅ　ｇｏｕｒｄｓ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ａｒｅａｓ　ａｓ　ｍａｔｅｒｉａｌ，ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ
ｇｅｎｏｍｅ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　ｂｏｔｔｌｅ　ｇｏｕｒｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　６ｎｕｃｌｅｉ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｂｕｆｅｒｓ　ｗａｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ａｎｄ
Ｏｔｔｏ　Ｉ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｂｕｆｅｒ　ｆｏｒ　ｂｏｔｔｌｅ　ｇｏｕｒｄ；ｔｈｅ　ｒｉｃｅ　ｖａｒｉｅｔｙ　Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ　ｗａｓ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｉｎｔｅｒｎａｌ
ｓｔａｎｄａｒｄ　ｆｒｏｍ　５ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｃｒｏｐｓ；ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　４Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｂｏｔｔｌｅ　ｇｏｕｒｄ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｗａｓ　ａｂｏｕｔ　３２９．１１－３４４．５６Ｍｂ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｂｏｔｔｌｅ　ｇｏｕｒｄ；ｇｅｎｏｍｅ；ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ；ｒｉｃｅ
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