全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(3): 566−570 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2008AA10Z408和 2006 AA10Z1B4)和教育部科学技术研究重点项目(206065)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 程备久, E-mail: cbj@ahau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: wjmmjw2000@163.com
Received(收稿日期): 2008-08-20; Accepted(接受日期): 2008-10-06.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00566
玉米自交系 B73全基因组 NBS类型抗病基因分析
汪结明 江海洋 赵 阳 项 艳 朱苏文 程备久*
安徽农业大学生命科学学院, 安徽合肥 230036
摘 要: 核苷酸结合位点(NBS)类型抗病基因是植物抗病基因中最大的一个类别, 也是近年来植物抗病分子育种研
究的一大热点。本研究对玉米自交系 B73全基因组中含有 NBS结构的候选抗病基因进行了基因总数、类型、系统进
化关系等分析。在 B73全基因组中含有 165个 NBS结构的基因, 远远少于水稻中的同类基因, 按照 N-端结构和亮氨
酸富集区 (LRR)结构 , 将其分为 153 个标准结构和 12 个非标准结构 NBS 基因。其中 , 标准结构基因又分为
CC-NBS-LRR、CC-NBS、NBS、NBS-NBS、NBS-LRR、NBS-NBS-LRR、NBS-X、X-NBS等 8个类型。系统进化树
分析表明, NBS类型抗病基因存在明显的两大分支, 与水稻的星状发散型分布有很大差异。通过基因家族分析, 还发
现了玉米 NBS类型基因的复制现象, 但发生复制的基因比例低于水稻, 可能是造成玉米 NBS抗病基因数目较少的原
因之一。
关键词: 玉米; 生物信息学; 抗病基因; 核苷酸结合位点(NBS); 系统进化树
Genome-Wide Analysis of NBS-Encoding Disease Resistance Genes in Maize
Inbred Line B73
WANG Jie-Ming, JIANG Hai-Yang, ZHAO Yang, XIANG Yan, ZHU Su-Wen, and CHENG Bei-Jiu*
School of Life Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China
Abstract: Nucleotide-binding site (NBS) disease resistance gene is a largest category in plant disease resistance genes, which is a
focus in recent studies on molecular breeding of plant disease resistance. Using maize (Zea mays L.) inbred line B73, the complete
set of disease resistance candidate genes that encode NBS was identified in the genome. The putative NBS genes were character-
ized with respect to structural diversity, phylogenetic relationships and so on. One hundred and sixty-five NBS-coding sequences
were identified into two types: nonregular (12) and regular NBS genes (153). The amount of NBS genesis much smaller in maize
than in japonica rice (Oryza sativa L.). The 153 regular NBS genes were categorized into eight classes, including CC-NBS-LRR,
CC-NBS, NBS, NBS-NBS, NBS-LRR, NBS-NBS-LRR, NBS-X, and X-NBS, according to N-terminal motif and leucine-rich
repeat (LRR) domains motif. The 165 NBS genes showed two remarkable branches in the phylogenetic tree, differing from the
radiation structure in japonica rice. Gene duplication event was observed based on gene family analysis of the NBS dis-
ease-resistance genes in maize; however, the ratio of gene duplication was smaller than that in rice. This might be one of the rea-
sons for less NBS disease-resistance genes in maize than in rice.
Keywords: Zea mays L.; Bioinformatics; Disease resistance gene; Nucleotide binding site; Phylogenetic tree
玉米(Zea mays L.)作为重要的粮食、饲料和能源作物
在世界范围内广泛种植[1], 但由于病害较为普遍, 往往造
成大量减产、品质下降。阐明病原菌与寄主植物之间的相
互作用关系 , 揭示植物抗病机制一直是植物病理学及植
物抗病育种研究中的热点问题[2]。植物对病原菌的抗病性
表现多种途径 , 首先是植物本身的某些结构障碍如细胞
壁的角质、蜡质、栓质、木质素及特殊的气孔结构等; 其
次是植物本身的某些化学成分具有抗病功能 , 如小分子
抗病物质、影响病原菌细胞透性的蛋白质和核糖体失活蛋
白等 [3]; 此外还有在病原菌侵染时植物表现的受抗病基
因影响的抗病反应。根据 Flor的“基因对基因”假说, 植
物与病原菌之间存在着共进化(arm race)的关系, 寄主植
物的每一个抗性基因 (resistance gene, R基因), 在病原菌
中就存在相应的无毒基因(avirulence gene, avr 基因), 与
avr基因相对应的是病原菌的毒性基因(virulence gene, vir
基因), 含有 avr和 vir基因的病原菌对含 R基因的寄主分
第 3期 汪结明等: 玉米自交系 B73全基因组 NBS类型抗病基因分析 567


别表现出非亲和性与亲和性[4]。
作为最大的一个抗病基因类别, NBS 类型抗病基因
在保护植物免受病原菌和有害物侵害中起十分重要的作
用, 其编码蛋白包含一个核苷酸结合位点(NBS)和亮氨酸
的富集区 (LRR)[5], 这个区域包含一些非常保守的基序 ,
因而被广泛地用于植物抗病基因的识别和分类。根据系统
发生学对 NBS 抗病基因的 8 个主要基序进行的研究显
示[6-7], 以NBS-LRR结构编码的这一类基因在植物中主要
被分成两大类。一类是在编码蛋白 N 端包含一个 TIR
(tolland interleukin-1 receptor, 是与果蝇 Toll 蛋白及哺乳
动物白细胞介素-1受体的胞外域相似的区域)结构, 称作
TIR-NBS-LRR类型基因或简称 TNL类型基因[8]。另一类
并不编码 TIR 结构区域, 而往往在 N-端带有一个卷曲螺
旋结构(coiled-coil, CC), 所以也称作 CC-NBS-LRR 类型
基因[9]。
抗病基因作为玉米基因组中的一个大家族, 对其进
行分子生物学研究具有十分重要的意义。目前, 在玉米全
基因组 NBS 类型抗病基因的分类和系统进化关系等方面
的研究明显落后于模式植物拟南芥(Arabidipsis thaliana)
和水稻(Oryza sativa L.)。美国华盛顿大学科学家今年 3月
份宣布玉米基因组草图绘制完成 , 并且已经通过网站免
费向世界提供草图数据 [10], 其功能基因组的研究已经起
步。因此利用现代生物信息学的手段, 在玉米全基因组水
平上研究含有核苷酸结合区(NBS)结构的候选抗病基因已
成为可能。本文在玉米基因组草图公布后, 首次通过生物
信息学方法研究玉米 B73全基因组中 NBS类型的抗病基
因总量, 并对其进行分类和系统发生学分析, 旨在为玉米
抗病基因的克隆、抗病机制的分析, 加快玉米抗病育种进
程奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料及其基因组 DNA信息获得
以玉米自交系 B73 全基因组数据为研究对象, 资料
来自玉米基因组测序网站 http://www.maizegenome.org/
data_portal.html。
1.2 NBS类型基因的确定
第一步, 在 NCBI 网站的 GenBank 中以“resistance”
和“disease”为关键词搜索, 获得以单子叶植物为主的 20
种植物 180 个含 NBS 区域的基因, 将这些基因提交蛋白
家族数据库(Pfam, http://pfam.janelia.org)以获取抗病基因
NBS区域。然后, 使用 DNAtools软件建立玉米 B73基因
组 cDNA 本地数据库, 再以抗病基因的 NBS 区域序列为
递交序列, P-value设为 10−6进行 BLAST搜索, 寻找同源
序列[11]。
第二步, 对所有符合要求的序列再通过 Pfam数据库
(http://pfam.wustl.edu/hmmsearch.shtml)、SMART 蛋白基
序 分 析 (Simple Modular Architecture Research Tool,
http://smart.embl-heidelberg.de)、COILS(http://www.ch.embnet.
org/software, threshold = 0.9)来确定它们的蛋白基序、区域,
并进行家族分类信息[12]。
第三步 , 对所有已被选取基因的核苷酸序列通过
ClustalW的方法进行多序列排列, 根据排列的结果, 去除
候选基因中的重复序列。
1.3 NBS类型基因的分类
参照水稻、拟南芥中 NBS类型基因的分类方法, NBS
区域由 pre-P-Loop 结构开始至 MHDV 结构结束, 一般包
含 260~300个氨基酸。在 pre-P-Loop结构之前以及MHDV
结构之后分别是 N-端和 LRR 结构[13]。根据 NBS 类型蛋
白的 N端结构和 LRR结构的不同, 对其进行分类。
1.4 NBS类型基因系统进化树的构建
由于抗病基因 NBS结构的氨基酸序列具有高度保守
性, 因此可以进行多序列的比对和构建进化树, 以用于研
究它们的差异以及系统进化关系[14]。本研究将玉米 B73
基因组 NBS基因 NBS结构区域氨基酸序列进行 ClustalW
排序, 利用 DNAMAN 软件对所有序列使用 Kimrua 距离
法构建系统进化树[15], 以分析其抗病基因的进化关系。
1.5 NBS类型基因的复制
基因复制(gene duplication)是多基因家族中普遍存在
的方式, 通过不等交换(unequal crossing over)、逆转录转
座(retroposition) 或全基因组重复(whole genome duplica-
tion) 等途径产生一个与原基因相似的基因或碱基序列 ,
Bai 等[16]将基因复制概念归纳为两个特征, 即发生基因重
复的两个基因序列之间有大于 70%的核苷酸序列可以排
列; 可排列的区域氨基酸序列的序列相似度大于 70%。通
过对基因复制的研究,能更好地理解基因的起源、基因家
族的形成、基因表达水平的多样性[17]。利用 MEGA3.1中
的 ClustalW模块将所有的玉米 NBS类型抗病基因进行排
序, 再将排序结果进行基因间序列相似度计算, 根据计算
结果统计基因复制事件。
2 结果与分析
2.1 NBS类型基因的鉴定
在获得的180个含NBS区域的核苷酸序列中, 经BLAST
将序列比对后的重叠序列去除, 最终得到 172 个候选基
因。再经 Pfam分析和多序列排序去除无 NBS结构区域的
候选基因, 最终得到 165个含 NBS结构的基因。
2.2 NBS类型基因的分类
在 165 个 NBS 类型抗病基因中, 153 个基因的 NBS
区域的基序高度保守, 具有完整的开放阅读框(ORF), 这
类基因被称为标准NBS类型基因, 但其他 12个基因的 NBS
区域呈高度分化状态, 它们的NBS区域的结构与上述 153
个基因有很大差别, 往往 N-端序列过短(小于正常的 2/3长),
被称为非标准 NBS类型基因(nonregular NBS gene)。这些
非标准 NBS 类型基因在 NBS 区域的 TBLASTN 工作中,
显示出非常高的 P 值匹配, 这也说明它们在 NBS 区域与
标准的NBS类型基因结构上的差距, 但是它们也带有 LRR
568 作 物 学 报 第 35卷




图 1 玉米自交系 B73中 NBS基因的系统发生树
Fig. 1 Phylogenetic tree of NBS genes in maize inbred line B73

第 3期 汪结明等: 玉米自交系 B73全基因组 NBS类型抗病基因分析 569


区域, 还有的非标准 NBS 类型基因序列只有部分保守的
NBS基序。
在拟南芥中, 两大类 NBS类型基因的分类依据其 N-
端 TIR 结构的存在与否[18]; 在玉米 B73 基因组中, 标准
NBS 类型基因主要区别在于 N-端结构和 C-端结构的差异,
所以本研究参考拟南芥和水稻的抗病基因分类方法 , 通
过 Pfam 数据库的分析, 按照 N-端和 LRR 区域基序的区
别对这些 NBS 抗病基因进行分类, 共分为 11 类(表 1)。
大多数标准 NBS 类型基因的 N-端含有一些未知基序, 都
统一以 X 表示其结构。经过 COILS 和 Pfam 分析, 共 59
个基因序列含有 CC 基序 , 主要分为 CC-NBS-LRR 和
CC-NBS 两类。通过 Pfam 和 COILS 无法获取 N-端类型
的共 91个, 分为 NBS、NBS-NBS、NBS-LRR、NBS-NBS-
LRR和 NBS-X 6类, 占所有标准 NBS类型基因的 59%。
此外, 有一类在编码蛋白 N 端包含一个 TIR 结构的 NBS
抗病基因, 被称作为 TIR-NBS-LRR 类型, 它在双子叶植
物中广为报道, 单子叶植物中未见报道。在拟南芥 149条

表 1 玉米 B73基因组中 NBS抗病基因分类及数目
Table 1 Number and category of nucleotide-binding site (NBS)
disease-resistance genes in maize
基因类别
Type of gene
简写代号
Code abbreviation
基因数目
Numbers of genes
规则 NBS基因
Regular NBS gene
153
CC-NBS-LRR CNL 19
CC-NBS CN 40
NBS N 47
NBS-NBS NN 8
NBS-LRR NL 29
NBS-NBS-LRR NNL 3
NBS-X NX 4
X-NBS XN 3
非规则 NBS基因
Nonregular NBS gene
12
NBS NGN 8
NBS-LRR NGNL 4
NBS基因总计
Total NBS genes
165

NBS-LRR 基因中占有 94 条(约占 63.1%), 而在玉米所有
NBS-LRR 基因中未发现带有 TIR 结构, 这与同是单子叶
禾本科作物的水稻十分相似[19]。
2.3 NBS类型基因的系统发生分析
165 个 NBS 类型基因的结构域进化树呈现两个明显
分支(图 2), 且分支内抗病基因的数量差异较大。从图 2还
可以看出, 玉米基因组中NBS类型基因中含CC基序基因
的NBS区域存在于不同的进化分分支中, 不存在CC单独
分支, 说明这两类基因没有单独的进化模式, 这同与在拟
南芥[20]和水稻[21]上的分析结果类似。
2.4 NBS类型基因的复制
在 165 个 NBS 类型基因中共发现 63 个基因发生了
复制, 可分为 27 个基因家族, 其中最大家族的成员为 6
个, 平均家族成员数 2.33。通过比对 NBS 类型基因的复
制事件, 发现玉米与拟南芥较为相似, 但它们复制的多基
因数量、多基因所占的比率都明显少于水稻, 在水稻中一
半以上 NBS 抗病基因都发生了复制, 且基因家族多达 93
个[22]。
3 讨论
利用生物信息学方法, 在玉米自交系 B73 的全基因
组中发现 165 个含有 NBS 结构的基因, 约占基因总数的
0.3%, 而在拟南芥中这一比例约为 0.47%[23], 在水稻中约
为 1%[24]。无论从绝对数量上还是相对的比例上, 玉米基
因组中的 NBS 类型基因明显少于同是单子叶禾本科作物
的水稻。本研究结果显示玉米中 NBS 结构基因发生的复
制事件远远少于水稻, 水稻中一半以上 NBS 类型基因都
发生了复制, 也就是说虽然水稻 NBS 类型基因数量是增
多了, 但一半以上基因都是由于复制而产生的, 基因间的
同源性很高[25], 这可能是玉米 NBS 类型基因明显少于水
稻的一个重要原因之一。
蛋白 N端包含一个 TIR结构的 NBS抗病基因, 在双
子叶植物中广为报道, 而本研究在对搜索到的 165个玉米
NBS 抗病基因进行归类时, 却未能发现带有 TIR 结构的
基因, 这同水稻十分相似。目前含有 TIR 结构的 NBS 类
型抗病基因在单子叶植物中还未见报道 , 但是否所有单
子叶植物 NBS 类型抗病基因中都没有 TIR 结构, 有待进
一步研究。

表 2 玉米、拟南芥和水稻基因组 NBS类型抗病基因的基因复制比较
Table 2 Comparison of gene duplications of NBS-encoding R-genes in genomes of maize, Arabidopsis, and rice
NBS基因 NBS gene 基因家族 Gene family 物种
Species 总数
Total
单基因
SG
多基因
MG
多基因/单基因比值
SG/MG ratio
数目
No. of families
最大成员数
Maximal member
平均家族成员数
Average member
玉米 Maize 165 102 63 0.62 27 6 2.33
拟南芥 Arabidopsis 174 93 81 0.87 25 7 3.24
水稻 Rice 519 240 279 1.16 93 10 3.00
表中部分数据引自 Yang等[25]。
Partial data in the table are from Yang et al. [25]. SG: single gene; MG: multigene.

570 作 物 学 报 第 35卷

在对全基因组内 NBS类型抗病基因进行系统进化树
分析时, 发现明显的两大分支, 这与水稻的星状发散型分
布[26-27]有很大差异。虽然拟南芥中也存在两个明显的分枝,
但那是由于 TIR结构和 CC结构的分化造成的[28], 由于玉
米中并不含有 TIR 结构, 且其两个明显的分枝中都分别
含有 NL和 CNL等类型基因, 并没有其他显著的特点, 因
此两者也存在较大差异。
References
[1] Duan M-X(段民孝), Zhao J-R(赵久然), Wang Y-D(王元东).
Study progress in starch of corn Kerne. J Maize Sci (玉米科学),
2002, 10(1): 29–32 (in Chinese with English abstract)
[2] Richly E, Kurth J, Leister D. Mode of amplification and reor-
ganization of resistance genes during recent Arabidopsis thaliana
evolution. Mol Biol Evol, 2002, 19: 76–84
[3] Staskawicz B J, Ausubel F M, Baker B J, Ellis J G, Jones J D.
Molecular genetics of plant disease resistance. Science, 1995, 268:
661–667
[4] Holub E. Arms race is an ancient history in Arabidopsis, the wild-
flower. Nat Rev Genet, 2001, 2: 516–527
[5] Meyers B C, Kaushik S, Nandety R S. Evolving disease resis-
tance genes. Curr Opin Plant Biol, 2005, 8: 129–134
[6] Dangl L J, McDowell J M. Two modes of pathogen recognition
by plants. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103: 8575–8576
[7] Noutoshi Y, Ito T, Seki M, Nakashita H, Yoshida S, Marco Y,
Shirasu K, Shinozaki K. A single amino acid insertion in the
WRKY domain of the Arabidopsis TIR-NBS-LRR-WRKY-type
disease resistance protein SLH1 (sensitive to low humidity 1)
causes activation of defense responses and hypersensitive cell
death. Plant J, 2005, 43: 873–888
[8] Montesinos E, Bonaterra A, Badosa E, Francés J, Alemany J,
Llorente I, Moragrega C. Plant-microbe interactions and the new
biotechnological methods of plant disease control. Int Microbiol,
2002, 5: 169–175
[9] Lupas A, Van Dyke M, Stock J. Predicting coled coils from pro-
tein sequences. Science, 1991, 252: 1162–1164
[10] Xu J H, Messing J. Organization of the prolamin gene family
provides insight into the evolution of the maize genome and gene
duplications in grass species. Proc Natl Acad Sci USA, 2008,
23:105–138
[11] Tian D, Traw M B, Chen J Q, Kreitman M, Bergelson J. Fitness
cost of R-gene mediated resistance in Arabidopsis thaliana. Na-
ture, 2003, 423: 74–77
[12] Chen G, Pan D, Zhou Y, Lin S, Ke X. Diversity and evolutionary
relationship of nucleotide binding site-encoding disease-resistance
gene analogues in sweet potato (Ipomoea batatas Lam.). J Biosci,
2007, 32: 713–721
[13] Xu Q, Wen X, Deng X. Isolation of TIR and non-TIR NBS-LRR
resistance gene analogues and identification of molecular markers
linked to a powdery mildew resistance locus in chestnut rose
(Rosa roxburghii Tratt). Theor Appl Genet, 2005, 111: 819–830
[14] Plocik A, Layden J, Kesseli R. Comparative analysis of NBS
domain sequences of NBS-LRR disease resistance genes from
sunflower, lettuce, and chicory. Mol Phylogenet Evol, 2004, 31:
153–163
[15] Zhou T, Wang Y, Chen J Q, Araki H, Jing Z, Jiang K, Shen J, Tian
D C. Genome-wide identification of NBS genes in japonica rice
reveals significant expansion of divergent non-TIR NBS-LRR
genes. Mol Genet Genomics, 2004, 271: 402–415
[16] Bai J, Pennill L A, Ning J, Lee S W, Ramalingam J, Webb C A,
Zhao B, Sun Q, Nelson J C, Leach J E, Hulbert S H. Diversity in
nucleotide binding site-leucine-rich repeat genes in cereals. Ge-
nome Res, 2002, 12: 1871–1884
[17] Peng G-Z(彭贵子), Chen L-L(陈玲玲), Tian D-C(田大成). Pro-
gress in the study of gene duplication. Hereditas (遗传), 2006,
28(7): 886–892 (in Chinese with English abstract)
[18] Meyers B C, Morgante M, Michelmore R W. TIR-X and
TIR-NBS proteins: Two new families related to disease resistance
TIR-NBS-LRR proteins encoded in Arabidopsis and other plant
genomes. Plant J, 2002, 32: 77–92
[19] Meyers B C, Kozik A, Griego A, Kuang H, Michelmore R W.
Genome-wide analysis of NBS-LRR-encoding genes in Arabi-
dopsis. Plant Cell, 2003, 15: 809–834
[20] Noir S, Combes M C, Anthony F, Lashermes P. Origin, diversity
and evolution of NBS-type disease-resistance gene homologues
in coffee trees (Coffea L.). Mol Genet Genomic, 2001, 265:
654–662
[21] López C E, Zuluaga A P, Cooke R, Delseny M, Tohme J, Verdier
V. Isolation of resistance gene candidates (RGCs) and characteri-
zation of an RGC cluster in cassava. Mol Genet Genomic, 2003,
269: 658–671
[22] Tan X P, Meyers B C, Kozik A, West M A, Morgante M, St Clair
D A, Bent A F, Michelmore R W. Global expression analysis of
nucleotide binding site-leucine rich repeat-encoding and related
genes in Arabidopsis. BMC Plant Biol, 2007, 7: 56
[23] Mondragón-Palomino M, Meyers B C, Michelmore R W, Gaut B
S. Patterns of positive selection in the complete NBS-LRR gene
family of Arabidopsis thaliana. Genome Res, 2002, 12:
1305–1315
[24] Yaish M W, Sáenz de Miera L E, Pérez de la Vega M. Isolation of
a family of resistance gene analogue sequences of the nucleotide
binding site (NBS) type from Lens species. Genome, 2004, 47:
650–659
[25] Yang S H, Zhang X H, Yue J X, Tian D C, Chen J Q. Recent
duplications dominate NBS-encoding gene expansion in two
woody species. Mol Genet Genomics, 2008, 280: 187–198
[26] Kohler A, Rinaldi C, Duplessis S, Baucher M, Geelen D,
Duchaussoy F, Meyers B C, Boerjan W, Martin F. Genome-wide
identification of NBS resistance genes in Populus trichocarpa.
Plant Mol Biol, 2008, 66: 619–636
[27] Pan Q, Wendel J, Fluhr R. Divergent evolution of plant
NBS-LRR resistance gene homologues in dicot and cereal ge-
nomes. J Mol Evol, 2000, 50: 203–213
[28] Shirano Y, Kachroo P, Shah J, Klessig D F. A gain-of-function
mutation in an Arabidopsis Toll Interleukin receptor-nucleotide
binding site-leucine-rich repeat type R gene triggers defense re-
sponses and results in enhanced disease resistance. Plant Cell,
2002, 14: 3149–3162