全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(2): 184−191 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2003CB114302); 国家自然科学基金项目(3040228); 北京市科技新星项目(012010240240113);
北京市玉米育种创新平台项目(YZPT02-06)
作者简介: 邹华文(1973– ), 男, 讲师, 从事植物逆境分子生物学研究。E-mail: zouhuawen@sohu.com
* 通讯作者(Corresponding author): 黄丛林。Tel: 010-51503980; E-mail: huangconglin@hotmail.com
Received(收稿日期): 2007-06-19; Accepted(接受日期): 2007-08-27.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00184
玉米非生物逆境响应基因 ZmASK1的克隆及表达特性分析
邹华文1,2,** 吴忠义1,** 张秀海1 王永勤1 杨 清3 曹鸣庆1 黄丛林1,*
(1北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心, 北京 100097; 2长江大学农学院, 湖北荆州 434023; 3南京农业大学生命科学学院,
江苏南京 210095)
摘 要: 类 Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因在植物发育和逆境应答中起着十分重要的作用。通过 RT-PCR方法从玉米中
克隆了一个与 Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因同源的全长 cDNA, 命名为 ZmASK1(abiotic stress-induced kinase)(GenBank
accession No., AY722707)。推测 ZmASK1蛋白含有 426个氨基酸, 分子量为 48.5 kD, 等电点为 8.7。半定量 RT-PCR
分析表明, ZmASK1可以被甘露醇、高盐和脱落酸(ABA)诱导。另外, 在不同的组织中, ZmASK1的表达模式也不一样,
在子房中的表达量最高。这些结果表明, ZmASK1 可能在植物逆境反应及生殖生育过程中起多重作用。本文是玉米
类 Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因参与胁迫和发育过程的首次报道。
关键词: 玉米; Shaggy/GSK-3; 表达模式; 非生物胁迫
Cloning and Characterization of Maize ZmASK1, a Homologue to
Shaggy/GSK-3-like Gene, Involved in Plant Responses to Abiotic
Stresses
ZOU Hua-Wen1,2,**, WU Zhong-Yi1,**, ZHANG Xiu-Hai1, WANG Yong-Qin1, YANG Qing3, CAO Ming-Qing1,
and HUANG Cong-Lin1,*
(1 Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Beijing 100097; 2 College of Agronomy,
Yangtze University, Jingzhou 434023, Hubei; 3 College of Life Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China)
Abstract: Shaggy/GSK-3-like genes play important roles in plant development and stress responses. One full-length cDNA en-
coding a shaggy/GSK-3 homologue was isolated from maize (Zea mays L.) by RT-PCR and named as ZmASK1 (for abiotic
stress-induced kinase). The predicted ZmASK1 protein has 426 amino acids with an estimated molecular mass of 48.5 kD and an
isoelectric point of 8.7. RT-PCR analysis showed that the ZmASK1 expression was induced by mannitol, salt and abscisic acid
(ABA). Furthermore, in different tissues the ZmASK1 showed different expression patterns and was most abundant in ovaries.
These results suggest that ZmASK1 may play multiple roles in abiotic resistance pathways, as well as in plant reproductive de-
velopment. This is the first shaggy/GSK-3-like gene associated with stresses and development reported in maize.
Keywords: Zea mays L.; Shaggy/GSK-3; Expression pattern; Abiotic stress
糖原合酶激酶(GSK-3)是从哺乳动物中分离出
的一个细胞质丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 它既可以失
活糖原合酶又可以激活ATP-Mg-type 1 型蛋白磷酸
酶[1-2]。随后, 其它能被GSK-3 所磷酸化的底物先后
被发现, 例如微管结合蛋白tau, 一些转录因子以及
腺瘤性结肠息肉病蛋白[1,3-4]。同时, 作为Wnt信号通
路的一部分, GSK-3 还参与了不同动物中一些基本
的发育过程。Wnt信号通路决定着成熟组织中细胞的
增殖以及胚胎发育过程中细胞分化的方向[5]。在果
蝇中 , SHAGGY蛋白激酶与GSK-3 序列最相近。
第 2期 邹华文等: 玉米非生物逆境响应基因 ZmASK1的克隆及表达特性分析 185


Shaggy对于正常的细胞分裂以及果蝇胚胎发育过程
中细胞分化的方向也是必须的[5]。在酵母中, GSK-3
的同源蛋白MCK1 和MDS1 在染色体分离的过程中
起着重要的作用[7-8]。MCK1基因的突变体变的对温
度非常敏感, 并且在苯菌灵中培养时会发生染色体
丢失现象。在植物中, 与Shaggy/GSK-3 同源的一些
基因相继被克隆, 结果暗示在植物中它可能是一个
多基因家族。这些基因编码的蛋白属于蛋白激酶家
族中Shaggy/GSK-3 亚家族[9-15]。研究表明它们在植
物体中行使多种功能, 包括激素信号传导, 生长发
育以及对逆境的响应等。
BIN2 编码一个类GSK-3 蛋白激酶成员, 是植
物对油菜素内酯(BRs)反应和细胞伸长的一个负调
控子[16-17]。最近, He等[18]发现, BIN2蛋白可以直接
和一个BR反应的正效应子—BZR1 蛋白结合, 在体
外磷酸化BZR1 蛋白, 并且可以负调控BZR1 蛋白
的积累。由此, 他们认为BIN2 的作用机理可能是:
BIN2 结合并且磷酸化BZR1, 使其降解, 同时BR的
信号途径可以导致BZR1 的去磷酸化, 并且可以通
过抑制BIN2 蛋白激酶的活性来增加BZR1 蛋白的
积累。
与动物中的GSK-3 类似 , 植物中的类Shaggy/
GSK-3 蛋白激酶同样参与了发育过程的调控。拟南
芥中ASKα和ASKγ可以调节花在不同阶段的发育模
式。反义表达ASKα和ASKγ特异片段的植物, 其花被
数比正常的多了一片, 并且雌蕊群的发育也发生了
改变[19]。另外的研究表明, ASKζ在整个的胚胎发育
过程中表达, ASKη仅在胚柄中表达 [14], 而ASKβ和
ASKθ则主要在花粉中表达[13]。另外, 其他植物的类
Shaggy/GSK-3蛋白激酶也被证明在植物的发育过程
中起作用。例如, 在紫花苜蓿中, MsK基因在不同的
营养器官, 花发育的不同阶段都表现出不同的表达
模式[9]; 在矮牵牛中, PSK4 基因在营养生殖阶段和
雌性生殖阶段表达, 而PSK6基因则主要在雄性和雌
性生殖阶段表达[11]; 在烟草中, NtK-4基因在所有的
孢子体组织、配子体以及花粉粒中都表达[12]。
在拟南芥中, 一个类Shaggy/GSK-3 基因AtGSK1
可以互补对盐胁迫敏感的酵母突变体 , 并且这
个 基因的表达受NaCl和外源的ABA诱导 , 表明
AtGSK1 可能参与了渗透胁迫的反应 [20]。另外, 过
量表达AtGSK1 基因的拟南芥可以提高对NaCl胁迫
的抗性, 同时转基因植株的花青素苷的含量也显著
增加[21]。在紫花苜蓿中, 一个类Shaggy/GSK-3 基因
WIG可以被伤害迅速的诱导表达, WIG蛋白也可以
被伤害所激活, 随后证明这种激活是一个翻译后的
过程[15]。
作为一种重要的粮食作物, 玉米在全世界范围
内被大面积种植。然而与其他植物如拟南芥、烟草
以及苜蓿相比, 玉米中类 Shaggy/GSK-3基因的相关
信息所知甚少。本文报道了玉米中一个 Shaggy/
GSK-3 基因家族成员 ZmASK1(GenBank accession
No., AY722707)的克隆以及在不同组织中的表达模
式, 另外, 在玉米根受到干旱、高盐以及 ABA 处理
条件下的表达模式也做了分析。并根据实验结果对
ZmASK1可能的生物功能进行了讨论。
1 材料与方法
1.1 材料
玉米京玉 7号用 1%的次氯酸钠表面消毒 5 min,
蒸馏水充分冲洗, 最后浸泡在蒸馏水中 12 h。充分
吸水的种子在黑暗、28℃条件下发芽。发芽后的种
子播在铺有一层吸水棉的瓷盘中, 上面覆盖两层湿
的吸水纱布。当主根长至 1.5 cm时, 剪取主根和胚
芽鞘用来做RT-PCR。剩下的幼苗转移到一个温室内,
温室的条件是: 70%相对湿度、30℃/28℃昼夜温度、
16 h/8 h昼夜光照、300 μmol m−2 s−1 photon光强。培
养至二叶一心期时分别做以下处理。
用于ABA、甘露醇和NaCl处理的幼苗分别
被转移到含有 100 μmol L−1 ABA、600 mmol L−1甘露
醇和 150 mmol L−1 NaCl 的溶液中。对于ABA处理,
在转移到ABA溶液中的同时, 对幼苗的叶子喷洒相
同浓度的ABA溶液。以上处理分别于 2、6、12、24
h后剪取主根做试材, 未处理的幼苗主根作为对照(0
h)。
成熟的叶片、未成熟的雄花序、花丝和子房取
材于大田中的玉米。具体过程是: 在雄花序刚刚抽
出时, 剪取 4 cm到 5 cm长的未成熟雄花序, 几天后,
再剪取未吐丝的花丝、子房以及成熟的叶片。
以上所有取材完毕后立即放入液氮中, −80℃保
存备用。
1.2 ZmASK1 cDNA序列的克隆
以拟南芥AtGSK1基因的核酸序列为探针, 在玉
米的EST TUG数据库中进行同源比对, 结果得到了
一 个 高 度 同 源 的 玉 米 EST contig(ZMtuc03-08-
11.6352)。根据EST contig序列, 用 5-CCTACCACC
186 作 物 学 报 第 34卷

ACACAACGGGATAA-3(上游引物 )和 5-TGTCGC
CTTTGAGGTCGGAG-3(下游引物)为引物对扩增全
长的ZmASK1 cDNA序列。用TRIzol试剂(Invitrogen,
USA), 以 150 mmol L−1 NaCl处理 24 h的玉米根为材
料, 提取RNA。取此适量的RNA在 20 μL的反应体系
中, 通过反转录获得第一条cDNA链。RT-PCR的产物
回收后连接到pGEM-T载体(Promega, USA)后测序
(Sangon, China)。
1.3 RT-PCR分析
用半定量RT-PCR的方法来分析ZmASK1 基因的
表达谱。分别取不同组织来源的RNA 5 μg, 反转录
成 cDNA。根据 cDNA序列设计一对特异的引物 :
5-CAAGCCCGACACAGATGAT-3(上游引物)、5-G
GCATCCGCTGATTCATT-3(下游引物), 扩增片段长
度为 426 bp。PCR反应体系的总体积为 25 μL, 其中包
括 1 μL的第一链cDNA, 上、下游引物各 0.4 μmol L−1,
1倍PCR反应缓冲液, 0.2 mmol L−1的dNTP 以及 1个
单位的Taq DNA聚合酶。反应程序为: 94 ℃预变性 3
min, 然后 94℃变性 30 s、56℃退火 30 s、72 ℃延伸
45 s, 26 个循环后 72 ℃延伸 5 min。分别用
5-CCATAAACGATGCCGA-3和 5-CACCACCCATA
GAATCAAGA-3作为上、下游引物来扩增玉米
18S rRNA作为内标。PCR产物在1%凝胶上电泳后 定
量。
2 结果与分析
2.1 ZmASK1的克隆及序列分析
为了确认 EST contig(ZMtuc03-08-11.6352)是否
是一个全长基因 , 我们首先在 http://au.expasy.org/
tools/dna.html 中分析此序列。分析表明此序列可能
含有一个长度为 1 281 bp 的开放读码框。其全长
cDNA序列及其编码的蛋白质序列已经提交到NCBI,
序列接收号为 AY722707。进一步的分析表明在翻译
起始密码子 ATG的上游, 相同读码框内有一个终止
密码子 TGA, 下游有一个终止密码子 TAG, 表明此
序列是一个全长的基因。
盐处理玉米根的RT-PCR产物连接到pGEM-T后
测序。根据测序结果分析推测ZmASK1蛋白含有 426
个氨基酸 , 分子量为 48.5 kD, 等电点为 8.7。在
PlantsP数据库中分析[22], 发现从第 88到 372个氨基
酸之间是一个蛋白激酶催化结构域。在这个结构域
里 面 有 一 个 ATP- 结合 区 域 VGTGSFGVVYQAK
CRETGEIVAIKK, 一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性
位点 ICHRDIKPQNVLV, 还有一个可能的N-肉豆蔻
酰化位点GCVMAE。另外, 在蛋白激酶催化 结构 域
的上游还有三个可能的N-肉豆蔻酰化位点(图 1)。
2.2 ZmASK1与其他相关蛋白激酶的序列比较
推测的ZmASK1蛋白激酶序列包含 11个保守的
蛋白激酶典型亚结构域[23](图 2)。在NCBI数据库中
比对发现, ZmASK1 与紫花苜蓿中的MSK4 一致性
最高, 达到 79%。同时发现与其他物种的相关序列
也有较高的一致性 , 例如 , 与拟南芥中的ASKδ、
ASKκ具有 78%的一致性 , 与哺乳动物的HsGSK3b
有 66%的一致性, 与果蝇的DmSGG有 61%的一致性,
与酵母中的MDS1 有 56%的一致性。通过与以上序
列的多重比对, 我们发现所有这些序列在催化结构
域处有很高的一致性，但是在C-端序列上存在很大
的差异(图 2)。在图 2中我们还可以发现, 所有比对
的序列都存在一个保守的Tyr残基, 这个残基在哺乳
动物的GSK-3 上位于第 216 个氨基酸处, 处于激酶
VII和VIII亚结构域之间的DFG和APE两个保守基序
的中间, 在哺乳动物中, 这个残基对于保持激酶活
性是十分必要的[24]。另外, ZmASK1 在第Ⅹ个亚结
构域中也存在一个植物所特有的TREE基序(图 2)。
图 3表示ZmASK1与其他相关蛋白激酶序列(包
括拟南芥中的所有 10 个GSKs、紫花苜蓿中的
MSK4、水稻中的OSKγ、酵母中的MDS1、MCK1
和MRK1、人HsGSK3a和HsGSK3b以及果蝇中的
DmSGG)构建的进化树。根据蛋白激酶序列的同源
性, 植物的GSKs可以分为 4类(I~IV) [5]。从图 3我们
得知ZmASK1 与第IV类的关系最近, 表明它可能是
其中的一个成员。
2.3 ZmASK1表达特性分析
我们分别在营养器官和生殖器官中分析了
ZmASK1的表达模式。如图 4-A所示, ZmASK1在玉
米不同组织中表达量不同, 表明它可能对玉米器官
的发育起调控作用。在子房中表达最强, 胚芽鞘和
花丝次之 , 在根和成熟的叶中表达较弱 , 另外 , 在
试验中我们没有检测到雄蕊中 ZmASK1的表达(资料
未显示)。
用同样的试验方法来检测玉米根 ZmASK1 在不
同逆境条件下的表达情况。图 4-B~图 4-D的结果表
明, ZmASK1可以被 NaCl、甘露醇和 ABA诱导。然
而这 3种处理的诱导模式是不同的, 对于NaCl处理,
ZmASK1的表达水平可以在 2 h上升, 并且可以维持
到 12 h, 而后下降至正常水平 ; 对于甘露醇处理 ,
第 2期 邹华文等: 玉米非生物逆境响应基因 ZmASK1的克隆及表达特性分析 187


ZmASK1 的表达在处理 12 h 升高到较高水平, 并且
持续这种高水平的表达至 24 h; 对于 ABA处理, 在
处理 12 h 之前, 没有明显的升高, 但是在 24 h 时
ZmASK1的表达迅速上升。

TGACCTCAGCCTCACTCGCTCGCTCGCACCACCAGCTTTGCTCCAGAGTCCTGACTCCTCCTAGCCTTCTCCTCCCTCTCTCC
CCTACCACCACACAACGGGATAAACCCCAGCACGAGGCCGGAGTTGCTGCTGGAACCGTCAGGCCGTGAAGAGCCTGCGGTTCGATCTGC
TGCAAGAGCTCCTCGTCGATCTCTTCTCTGCGAGGTTTCGGTCTGAGGTATGGCGTATTCTGGACAAAGGCATGCTGGTGTTGGGAGCTC
* M A Y S G Q R H A G V G S S
CTCGAGGCCAGCGAATGGATTCAAGGGGGCAGCCAACTCGGTGGAGTTCCTGGGTAGGGAGATGCTGGGAATGCGACTGAGGGATGCCAA
S R P A N G F K G A A N S V E F L G R E M L G M R L R D A K
GCCCGACACAGATGATGAAAGGGAGATGTGGTCAAGTTCAGATGTGACTGATAGTTCTGGTAATGAAGCTGGTCATGTAATAGCGACTAC
P D T D D E R E M W S S S D V T D S S G N E A G H V I A T T
TGTTCACGGGCGCAACGGCCTGCCTAAACAGTCTGTCACATACATCGCTGAACATGTGGTTGGAACTGGTTCTTTTGGGGTTGTGTATCA
V H G R N G L P K Q S V T Y I A E H V V G T G S F G V V Y Q
GGCAAAATGCCGAGAAACAGGGGAAATTGTTGCCATAAAAAAGGTCCTTCAAGATAAGCGTTATAAGAACAGAGAGCTGCAAATCATGCA
A K C R E T G E I V A I K K V L Q D K R Y K N R E L Q I M H
TATGCTTGACCATCCTAACATCATCGGTCTTAAGCATTACTTCTTTTCAACAACTGAAAGGGATGAGCTTTATCTCAACCTTGTTCTTGA
M L D H P N I I G L K H Y F F S T T E R D E L Y L N L V L E
GTTTGTTCCAGAGACAGTAAACAGGATTGCAAGGCAGTACAATCGAATGAATCAGCGGATGCCCCTCATTTATGTCAAACTGTACACGTA
F V P E T V N R I A R Q Y N R M N Q R M P L I Y V K L Y T Y
TCAGATATGCCGAGCGCTTGCTTATATACATAACTGCATTGGCATCTGCCACCGTGATATCAAACCGCAGAATGTTCTTGTTAACCCACA
Q I C R A L A Y I H N C I G I C H R D I K P Q N V L V． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． N P H
TACACACCAACTCAAAATTTGCGATTTCGGAAGTGCTAAAGTATTGGTCAGAGGAGAGCCAAACATCTCCTACATATGCTCAGGGTATTA
T H Q L K I C D F G S A K V L V R G E P N I S Y I C S G Y Y
TCGAGCACCAGAGCTCATATTTGGTGCAACGGAATATACTACTGCTATTGATTTGTGGTCAACAGGCTGTGTCATGGCAGAGCTGCTTCT
R A P E L I F G A T E Y T T A I D L W S T G C V M A E L L L
AGGACAGGCCCTGTTTCCTGGAGAAAGTGGAGTCGACCAACTAGTTGAGATCATCAAGGTTTTGGGTACTCCAACAAGGGAAGAGATCAA
G Q A L F P G E S G V D Q L V E I I K V L G T P T R E E I K
GTGCATGAACCCAAACTATACGGAGTTCAAGTTCCCACAAATTAAAGCTCATCCGTGGCACAAGGTTTTTCAAAGAAGGCTTCCACCTGA
C M N P N Y T E F K F P Q I K A H P W H K V F Q R R L P P E
AGCAGTGGACCTTGTTAGCAGGTTTCTACAATACTCACCAAATCTACGGTGCACTGCTTTGGAGGCCTGTATGCACCCTTTCTTCGATGA
A V D L V S R F L Q Y S P N L R C T A L E A C M H P F F D E
GCTGAGAGACCCAAACACTCGTCTACCCAATGGTCGGCCTCTGCCGCCTCTCTTTAACTTCAGATCTCAAGAGCTAAAAGGCGTTCCCCC
L R D P N T R L P N G R P L P P L F N F R S Q E L K G V P P
AGAAGTCATCGATCGCCTTGTCCCAGAGCACTCAAGAAGGCAGAGTTTGTTCATGGCGCTAAGGACCTAGTTTTTGCCGTTCTTTTTGCC
E V I D R L V P E H S R R Q S L F M A L R T *
CCCTTTTTTTCCCACCGTTTGCCACCTTGAGGGAAGCTTGTAAAGCTATAGCTTCTCCTTTCCCCTCGTCCTTACTTTCCTCCCCTCTCT
CTTTCTTCCGAGCTTTGTTTGGATGAGAGATCCTTGAGATACACTGCTAGAGCTGTGAGTTCCAGGATGTGAGGTTCGAGTGTGTGTGAT
GTGCAGTTGTCGCCTTTGAGGTCGGAGATTTCAGTTGCAGTGTTGTGAGAGGCTTGTGAAACCTTTTTGTAAAAAAATCAGTGCTTCTCT

图 1 ZmASK1的核酸序列以及其编码的氨基酸序列序列
Fig. 1 Sequences of nucleotide acids and deduced amino acids of ZmASK1

字母下面“*”表示相同读码框内的终止密码子, 下划线的序列表示可能的 ATP结合区域, 氨基酸序列下的下划线表示丝氨酸/苏氨酸
蛋白激酶活性位点, 灰色的方框内的氨基酸代表推测的 N-肉豆蔻酰化位点, 黑斜体的核酸序列表示在 RT-PCR反应中用来克隆此序列
所用到的引物序列。
The in-frame stop codons are shown as asterisks in the amino acid translation. The underlined amino acids are protein kinase ATP-binding
region signature. Serine/Threonine protein kinase active-site signature is indicated by dots. The potential N-myristoylation sites are shown in
gray box. The nucleotide sequences shown in bold and italic type are primers used in RT-PCR.

188 作 物 学 报 第 34卷

ZmASK1 : MAYSGQRHAGVGSSSRPANGFK---GAANSVEFLGREMLGMRLR-----DAKPDTDDEREMWSSSDVTDSSGNEAGHVIATTVHGRNGLPKQSVT
ASKκ : MASSGLGNG-VGTS-RSAKGLK---SSSSSVDWLTRDLAETRIR------DKVETDDERD--SEPDIIDGAGAEPGHVIRTTLRGRNGQSRQTVS
ASKδ : -MESHLGNG-VGSS-RSAKNTK---NTSSSVDWLSRDMLEMKIR------DKTEADEERD--SEPDIIDGVGAEPGHVITTTLPGRNGQSRQTVS
MSK4 : MASASLGNGGIGSSSRSAAALRAASSTSSSVDWLGREMLHMNLNRDHDHDHDDDDDDARE--SEPDIIDGVGAETGHVIRTSIAARNGQSKQNVS
HsGSK3b : --MSGRPRT---TS--FAESCKP-------VQQPS-AFGSMKVS-----------RD--------KD----GSKVTTVVATPGQGPDRP--QEVS
MDS1 : --MNIQSNN---SP------------------NLSNNIVSKQVY--------------------------------YAHPPPTIDPNDP--VQIS
DmSGG : --MSGRPRT---SS--FAEGNK---------QSPSLVLGGVKTC-----------S---------RD----GSKITTVVATPGQGTDRV--QEVS
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
ZmASK1 : YIAEHVVGTGSFGVVYQAKCRETGEIVAIKKVLQDKRYKNRELQIMHMLDHPNIIGLKHYFFSTTER-DELYLNLVLEFVPETVNRIARQYNRMN
ASKκ : YISEHVVGTGSFGMVFQAKCRETGEVVAIKKVLQDKRYKNRELQIMQMLDHPNAVALKHSFFSRTDN-EEVYLNLVLEFVPETVNRVARSYSRTN
ASKδ : YIAEHVVGTGSFGMVFQAKCRETGEVVAIKKVLQDKRYKNRELQIMQMLDHPNVVCLKHSFYSRTEN-EEVYLNLVLEFVPETVNRTARSYSRMN
MSK4 : YIAEHVVGTGSFGTVFQAKCRETGEIVAIKKVLQDKRYKNRELQIMQMLDHPNIVALRHCFFSTTDK-EELYLNLVLEYVPETVNRIARNYSRIN
HsGSK3b : YTDTKVIGNGSFGVVYQAKLCDSGELVAIKKVLQDKRFKNRELQIMRKLDHCNIVRLRYFFYSSGEKKDEVYLNLVLDYVPETVYRVARHYSRAK
MDS1 : FPTTEVVGHGSFGVVFATIIQETNEKVAIKKVLQDKRFKNRELEIMKMLSHINIIDLKYFFYERDSQ-DEIYLNLILEYMPQSLYQRLRHFVHQR
DmSGG : YTDTKVIGNGSFGVVFQAKLCDTGELVAIKKVLQDRRFKNRELQIMRKLEHCNIVKLLYFFYSSGEKRDEVFLNLVLEYIPETVYKVARQYAKTK
Ⅵa Ⅵb Ⅶ Ⅷ Ⅸ
ZmASK1 : QRMPLIYVKLYTYQICRALAYIHNCIGICHRDIKPQNVLVNPHTHQLKICDFGSAKVLVRGEPNISYICSGYYRAPELIFGATEYTTAIDLWSTG
ASKκ : QLMPLIYVKLYTYQICRALAYIHNSFGLCHRDIKPQNLLVNPHTHQLKICDFGSAKVLVKGEPNVSYICSRYYRAPELIFGASEYTTAIDIWSTG
ASKδ : QLMPLIYVKLYTYQICRGLAYLHNCCGLCHRDIKPQNLLVNPHTHQLKICDFGSAKVLVKGEPNISYICSRYYRAPELIFGATEYTTAIDIWSTG
MSK4 : QRMPLIYVKLYTYQICRALAYIHNCIGICHRDIKPQNLLVNPHTHQLKLCDFGSAKVLVKGEPNVSYICSRYYRAPELIFGATEYTTAIDIWSTG
HsGSK3b : QTLPVIYVKLYMYQLFRSLAYIH-SFGICHRDIKPQNLLLDPDTAVLKLCDFGSAKQLVRGEPNVSYICSRYYRAPELIFGATDYTSSIDVWSAG
MDS1 : TPMSRLEIKYYMFQLFKSLNYLHHFANVCHRDIKPQNLLVDPETWSLKLCDFGSAKQLKPTEPNVSYICSRYYRAPELIFGATNYTNQIDIWSSG
DmSGG : QTIPINFIRLYMYQLFRSLAYIH-SLGICHRDIKPQNLLLDPETAVLKLCDFGSAKQLLHGEPNVSYICSRYYRAPELIFGAINYTTKIDVWSAG
----------------△---------
Ⅹ Ⅺ
ZmASK1 : CVMAELLLGQALFPGESGVDQLVEIIKVLGTPTREEIKCMNPNYTEFKFPQIKAHPWHKVFQRRLPPEAVDLVSRFLQYSPNLRCTALEACMHPF
ASKκ : CVMAELLLGQPLFPGESGVDQLVEIIKVLGTPTREEIKCMNPNYTEFKFPQIKPHPWHKVFQKRLPPEAVDLLCRFFQYSPNLRCTALEACIHPL
ASKδ : CVMAELLLGQPLFPGESGVDQLVEIIKVLGTPTREEIKCMNPNYTEFKFPQIKPHPWHKVFQKRLPPEAVDLLCRFFQYSPNLRCTAVEACIHPF
MSK4 : CVMAELLLGQPLFPGESGVDQLVEIIKVLGTPTREEIKCMNPNYTEFKFPQIKPHPWHKVFQKRLPPEAVDLVCRFFQYSPNLRCTALEACIHPF
HsGSK3b : CVLAELLLGQPIFPGDSGVDQLVEIIKVLGTPTREQIREMNPNYTEFKFPQIKAHPWTKVFRPRTPPEAIALCSRLLEYTPTARLTPLEACAHSF
MDS1 : CVMAELLLGQPMFPGESGIDQLVEIIKILGTPSKQEICSMNPNYMEHKFPQIKPIPLSRVFKK-EDDQTVEFLADVLKYDPLERFNALQCLCSPY
DmSGG : CILAELLLGQPIFPGDSGVDQLVEVIKVLGTPTREQIREMNPNYTEFKFPQIKSHPWQKVFRIRTPTEAINLVSLLLEYTPSARITPLKACAHPF

ZmASK1 : FDELRDP-NTRLPNGRPLPPLFNFRS-QELKGVPPEVIDRLVPEHSR----------------------------------------RQSLFMAL
ASKκ : FDELRDP-NTRLPNGRPLPPLFNFKP-QELSGIPPEIVNRLVPEHAR----------------------------------------KQNLFMAL
ASKδ : FDELRDP-NARLPNGRPLPPLFNFKP-QELSGIPPETVDRLVPEHAR----------------------------------------KQNHFMAL
MSK4 : FDELRDP-NTRLPNGRPLPPLFNFKP-QELSGIPPDVINRLIPEHAR----------------------------------------KQNLFMAL
HsGSK3b : FDELRDP-NVKHPNGRDTPALFNFTT-QELS-SNPPLATILIPPHAR----------------------------------IQAAASTPTNATAA
MDS1 : FDELKLD-DGKINQITTDLKLLGFDENVELGHLSPDELSSVKKKLYP-----------------------------------------KSK----
DmSGG : FDELRMEGNHTLPNGRDMPPLFNFTE-HELS-IQPSLVPQLLPKHLQNASGPGGNRPSAGGAASIAASGSASVSSTGSGASVEGSAQPQSQGTAA

ZmASK1 : RT----------------------------------------------------------------------------------
ASKκ : HS----------------------------------------------------------------------------------
ASKδ : HS----------------------------------------------------------------------------------
MSK4 : HT----------------------------------------------------------------------------------
HsGSK3b : SD-------------ANTGDRGQTNNAASASASNST------------------------------------------------
MDS1 : ------------------------------------------------------------------------------------
DmSGG : AAGSGSGGATAGTGGASAGGPGSGNNSSSGGASGAPSAVAAGGANAAVAGGAGGGGGAGAATAAATATGAIGATNAGGANVTDS
图 2 ZmASK1的氨基酸序列与其他相关序列的多重比对
Fig. 2 Alignment of amino acid sequence of ZmASK1 with that of other related sequences
相关序列为: 拟南芥的ASKκ、ASKδ (GenBank accession No., X79279、AC079732), 紫花苜蓿的MSK4 (GenBank accession No.,
AF432225), 人的HsGSK3b (GenBank accession No., L33801), 酵母的MDS1(GenBank accession No., U03280) 以及果蝇的DmSGG
(GenBank accession No., X53332)。用罗马数字表示蛋白激酶的亚结构域位置, 黑色表示相同的碱基, 灰色代表同源的碱基, DFG和
APE保守基序用下划线“---”来表示, 其中的保守酪氨酸用“ ”△ 来表示, 在第X个亚结构域中的植物特有的TREE基序用上划线来表示。
序列比对通过Clustal X 1.8和GeneDoc软件完成。
Arabidopsis ASKκ and ASKδ (GenBank accession No.: X79279 and AC079732), alfalfa MSK4 (GenBank accession No.: AF432225), Homo
sapiens HsGSK3b (GenBank accession No.: L33801), Saccharomyces cerevisiae MDS1 (GenBank accession No.: U03280), and Drosophila
melanogaster DmSGG (GenBank accession No.: X53332). The positions of the catalytic subdomains according to Hanks and Quinn are indi-
cated above the sequences with roman numerals. In the consensus sequence, Black boxes indicate positions at which the residues are identical
and gray boxes highlight residues that are similar. DFG and APE conserved motifs are indicated by discontinuous line‘---’, and the conserved
Tyrosine (Y) between these motifs is indicated by‘△’. The plant specific TREE motif in kinase domain X is lined above the sequences.
Sequences were aligned using Clustal X 1.8 and GeneDoc.
第 2期 邹华文等: 玉米非生物逆境响应基因 ZmASK1的克隆及表达特性分析 189



图 3 玉米 ZmASK1与其他相关序列的进化树分析
Fig. 3 Phylogenetic tree based on an alignment of maize
ZmASK1 with other related sequences
相关序列为: 拟南芥 ASKκ、ASKδ、ASKα、ASKγ、ASKε、ASKι、
ASKζ、ASKη、ASKβ及 ASKθ (GenBank accession No., X79279,
AC079732, X75432, X75431, AL163792, X99696, X94938,
X94939, AJ002280及 Y07822), 水稻 OSKγ (GenBank accession
No., AB59612), 紫花苜蓿 MSK4, 人 HsGSK3a、HsGSK3b
(GenBank accession No., L40027、L33801), 酵母MDS1、MCK1及
MRK1 (GenBank accession No., U03280、M55984及 U22348), 果蝇
DmSGG。进化树的绘制通过 Clustal W和 TreeView软件来完成。
Arabidopsis ASKκ, ASKδ, ASKα, ASKγ, ASKε, ASKι, ASKζ,
ASKη, ASKβ, and ASKθ (GenBank accession No.: X79279,
AC079732, X75432, X75431, AL163792, X99696, X94938,
X94939, AJ002280, and Y07822, respectively), rice OSKγ (Gen-
Bank accession No. AB59612), alfalfa MSK4, Homo sapiens
HsGSK3a and HsGSK3b (GenBank accession No.: L40027 and
L33801), Saccharomyces cerevisiae MDS1, MCK1, and MRK1
(GenBank accession No.: U03280, M55984, and U22348, respec-
tively) and Drosophila melanogaster DmSGG. The phylogenetic
tree was created with Clustal W and TreeView programs.
3 讨论
本研究中, 我们从玉米中克隆并鉴定了一个命
名为ZmASK1的cDNA。通过NCBI-BLAST的同源性
比对 , 发现其氨基酸序列与植物类GSK3/Shaggy蛋
白激酶的第IV类有最高的相似性。随后的进化树分
析进一步表明ZmASK1 是这个组的成员。分别从植
物、人、果蝇、酵母基因组中挑选与ZmASK1 同源
性序列最高的序列, 并进行多序列比对。结果发现,
这些蛋白激酶的催化区序列非常保守。而在N-端和
C-端的序列则差异较大, 同源性较低, 表明不同的
GSKs可能通过不同的末端序列调节不同的生物过
程。在激酶催化结构域中, 我们还发现在T-loop中存
在一个保守的Tyr残基, 其位置与哺乳动物GSK-3的
Tyr216 相对应。GSK-3 的T-loop中Tyr216 的磷酸化
对于GSK-3 行使生物学功能是必需的。这似乎暗示
了ZmASK1 中这个位置的Tyr残基也可能起到类似
的作用。另外, 在激酶的第Ⅹ亚结构域中, 还存在一
个TREE基序。TREE是植物中特有的保守基序, 在这
个基序中有两个保守的Glu残基 , 这两个氨基酸残
基可以帮助其临近的Thr残基被磷酸 化(图 2)。以
前的研究表明, 拟南芥中这些保守的 Glu残基的突
变可以引起植物严重的形态和生理的改变 [17,25-26],
表明其功能的重要性。
在 PlantsP数据库中分析, 发现蛋白激酶序列含
有一个催化结构域和一个丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶
活性位点, 表明 ZmASK1是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白
激酶。以前的研究表明 N-肉豆蔻酰化在蛋白的膜定

图 4 ZmASK1基因在不同组织器官、不同非生物逆境条件下的表达模式
Fig. 4 Expression patterns of the ZmASK1 gene in various tissues and in response to various treatments
A, ZmASK1在不同组织器官中的表达模式: (1)根, (2)胚芽鞘(3)成熟叶, (4)花丝, (5)子房。B-D, 分别受到 NaCl、甘露醇和 ABA处理时
玉米根中 ZmASK1的表达模式。
A: expression patterns of ZmASK1 in various tissues: roots (lane 1), coleoptiles (lane 2), mature leaves (lane 3), silks (lane 4), and ovaries
(lane 5). B–D: time-course of ZmASK1 expression in maize roots upon NaCl, mannitol, and ABA treatment, respectively.

190 作 物 学 报 第 34卷

位, 以及植物响应环境胁迫的信号传导过程中起到
了很大的作用, 并且这种修饰作用对于介导蛋白质
之间的相互作用也是非常必要的[27-28]。通过PlantsP
数据库分析, 发现在ZmASK1 催化结构域的上游有
3个可能的N-肉豆蔻酰化位点, 在催化结构域内有 1
个N-肉豆蔻酰化位点。这说明ZmASK1 很有可能与
膜系统或(和)其他的蛋白质相互作用, 共同参与了
逆境信号传导。然而, 其确切功能及亚细胞定位还
需要进一步鉴定。
在不同组织中ZmASK1 的表达量不同 , 暗示
ZmASK1 可能参与了植物器官发育的调控。有趣的
是, ZmASK1在生殖器官子房中表达量最高, 这也暗
示了它很有可能在玉米的生殖发育和生殖生理过程
中发挥作用。植物对逆境的适应有ABA依赖和ABA
非依赖两条途径[29]。在本研究中, 我们发现ZmASK1
基因不但可以被高盐和甘露醇诱导, 还可以被ABA
诱导表达, 说明ABA依赖的途径参与ZmASK1 对逆
境的反应调节。Piao等[20-21]研究表明, 拟南芥中一个
ZmASK1的同源基因AtGSK1可以被高盐和ABA所诱
导。同时在拟南芥中过量表达AtGSK1 基因 明显
提高了转基因拟南芥的抗盐性。最近, Charrier等[30]
发现在拟南芥中Shaggy-like家族中, 有 4 个成员可
以被渗透胁迫和高盐所诱导表达, 这 4 个基因分别
是: AtSK13(ASKε), AtSK31(ASKβ), AtSK42(ASKδ)以
及AtSK22(ASKι, AtGSK1)。以上分析表明, ZmASK1有
可能与参与AtGSK1 一样可以响应或者抵抗高 盐
处理。然而, 还需要进一步的工作来确证其生化特
性、在逆境信号传导以及植物发育中的确切作用。
4 结论
通过 RT-PCR 方法克隆了玉米 ZmASK1 的全长
cDNA 片段, 此片段包含一个 1 281 bp 的开放读码
框。序列分析表明 ZmASK1 编码的蛋白含有一个蛋
白激酶催化结构域, 在催化结构域中有一个蛋白激
酶 ATP结合位点、一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性
位点以及一个可能的 N-肉豆蔻酰化位点。ZmASK1
可以被 NaCl、甘露醇以及 ABA诱导。然而, 以上这
3种处理的诱导模式是不同的。ZmASK1在玉米不同
组织中的表达水平也不一样 , 在子房中表达最强 ,
胚芽鞘和花丝次之 , 在根和成熟的叶中表达较弱 ,
另外, 在试验中我们没有检测到雄蕊中 ZmASK1 的
表达。
References
[1] Plyte S E, Hughes K, Nikolakaki E, Pulverer B J, Woodgett J
R. Glycogen synthase kinase-3: functions in oncogenesis and
development. Biochem Biophys Acta, 1992, 111: 147−162
[2] Yang S D, Song J S, Hsieh Y T, Liu H W, Chan W H. Identi-
fication of the ATP·Mg—dependent protein phosphatase acti-
vator (Fa) as a synapsin I kinase that inhibits cross-linking of
synapsin Ⅰ with brain microtubules. J Protein Chem, 1992,
11: 539−546
[3] Mandelkow E M, Drewes G, Biernat J, Gustke N, van Lint J,
Vandenheede J R, Mandelkow E. Glycogen synthase kinase-3
and the alzheimer-like state of microtubule-associated protein
tau. FEBS Lett, 1992, 314: 315−321
[4] Rubinfeld B, Albert I, Porfiri E, Fiol C, Munemitsu S, Polakis
P. Binding of GSK3βto the APC-β-catenin complex and regu-
lation of complex assembly. Science, 1996, 272: 1023−1026
[5] Jonak C, Hirt H. Glycogen synthase kinase 3/SHAGGY-like
kinases in plants: an emerging family with novel functions.
Trends Plant Sci, 2002, 7: 457−461
[6] Bourouis M, Heitzler P, Messal M, Simpson P. Mutant Dro-
sophila embryos in which all cells adopt a neural fate. Nature,
1989, 341: 442−444
[7] Neigeborn L, Mitchell A P. The yeast MCK1 gene encodes a
protein kinase homolog that activates rarly meiotic gene ex-
pression. Genes Dev, 1991, 5: 533−548
[8] Puziss J W, Hardy T A, Johnson R B, Roach P J, Hieter P.
MDS1, a dosage suppressor of an mck1 mutant, encodes a
putative yeast homolog of glycogen synthase kinase 3. Mol
Cell Biol, 1994, 14: 831−839
[9] Pay A, Jonak C, Bögre L, Meskiene I, Mairinger T, Szalay A,
Heberle-Bors E, Hirt H. The MsK family of alfalfa protein
kinase genes encodes homologues of shaggy/glycogen syn-
thase kinase-3 and shows differential expression patterns in
plant organs and development. Plant J, 1993, 3: 847−856
[10] Bianchi, M W, Guivarćh D, Thomas M, Woodgett J R, Kreis
M. Arabidopsis homologs of the shaggy and GSK-3 protein
kinases: molecular cloning and functional expression in Es-
cherichia coli. Mol Gen Genet, 1994, 242: 337−345
[11] Decroocq-Ferrant V Van, Went J, Bianchi M W, Vries S C,
Kreis M. Petunia hybrida homologues of shaggy/zeste-white 3
expressed in female and male reproductive organs. Plant J,
1995, 7: 897−911
[12] Einzenberger E, Eller N, Heberle-Bors E, Vicente O. Isolation
and expression during pollen development of a tobacco cDNA
clone encoding a protein kinase homologous to shaggy/glycogen
synthase kinase-3. Biochim Biophys Acta, 1995, 1260: 315−319
[13] Tichtinsky G, Tavares R, Takvorian A, Schwebel-Dugue N,
Twell D, Kreis M. An evolutionary conserved group of plant
GSK-3/shaggy-like protein kinase genes preferentially ex-
pressed in developing pollen. Biochim Biophys Acta, 1998,
1442: 261−273
[14] Dornelas M C, Wittich P, von Recklinghausen I, van Lam-
meren A A, Kreis M. Characterization of three novel members
of the Arabidopsis SHAGGY-related protein kinase (ASK)
multigene family. Plant Mol Biol, 1999, 39: 137−147
第 2期 邹华文等: 玉米非生物逆境响应基因 ZmASK1的克隆及表达特性分析 191


1, 127: 14−22
[15] Jonak C, Beisteiner D, Beyerly J, Hirt H. Wound-induced
expression and activation of WIG, a novel glycogen synthase
kinase 3. Plant Cell, 2000, 12: 1467−1476
[16] Li J, Nam K H, Vafeados D, Chory J. BIN2, a new
brassinosteroid-insensitive locus in Arabidopsis. Plant
Physiol, 200
[17] Li J, Nam K H. Regulation of brassinosteroid signaling by a
GSK3/SHAGGY-like kinase. Science, 2002, 295: 1299−1301
[18] He J X, Gendron J M, Yang Y, Li J, Wang Z Y. The GSK3-like
kinase BIN2 phosphorylates and destabilizes BZR1, a positive
regulator of the brassinosteroid signaling pathway in Arabi-
dopsis. Proc Nat Acad Sci USA, 2002, 99: 10185−10190
[19] Dornelas M C, van Lammeren A A, Kreis M. Arabidopsis
thaliana SHAGGY-related protein kinases (AtSK11 and 12)
function in perianth and gynoecium development. Plant J,
2000, 21: 419−429
[20] Piao H L, Pih K T, Lim J H, Kang S G, Jin J B, Kim S H,
Hwang I. An Arabidopsis GSK3/shaggy-like gene that com-
plements yeast salt stress-sensitive mutants is induced by
NaCl and abscisic acid. Plant Physiol, 1999, 119: 1527−1534
[21] Piao H L, Lim J, Kim S, Cheong G W, Hwang I. Constitutive
over-expression of AtGSK1 induces NaCl stress and results in
enhanced NaCl tolerance in Arabidopsis. Plant J, 2001, 7:
305−314
[22] Gribskov M, Fana F, Harper J, Hope D A, Harmon A C, Smith
D W, Tax F E, Zhang G F. PlantsP: A functional genomics
database for plant phosphorylation. Nucleic Acids Res, 2001,
29: 111−113
[23] Hanks S K, Quinn A M, Hunter T. The protein kinase family:
conserved features and deduced phylogeny of the catalytic
domains. Science, 1998, 241: 42−52
[24] Hughes K, Nikolakaki E, Plyte S E, Totty N F, Woodgett J R.
Modulation of the glycogen synthase kinase-3 family by tyro-
sine phosphorylation. EMBO J, 1993, 12: 803−808
[25] Perez-Perez J M, Ponce M R, Micol J L. The UCU1 Arabi-
dopsis gene encodes a SHAGGY/GSK3-like kinase required
for cell expansion along the proximodistal axis. Dev Biol,
2002, 242: 161−173
[26] Choe S, Schmitz R J, Fujioka S, Takatsuto S, Lee M-O, Yo-
shida S, Feldmann K A, Tax F E. Arabidopsis brassinoster-
oid-insensitive dwarf12 mutants are semidominant and defec-
tive in a glycogen synthase kinase 3β-like kinase. Plant
Physiol, 2002, 130: 1506−1515
[27] Podel S, Gribskov M. Predicting N-terminal myristoylation
sites in plant proteins. BMC Genomics, 2004, 5: 37−51
[28] Ishitani M, Liu J P, Halfter U, Kim C S, Shi W M, Zhu J K.
SOS3 function in plant salt tolerance requires N-myristoylation
and calcium binding. Plant Cell, 2000, 12: 1667−1677
[29] Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Molecular responses to
dehydration and low temperature: differences and cross-talk
between two stress signaling pathways. Curr Opin Plant Biol,
1996, 3: 217−223
[30] Bénédicte C, Anthony C, Yves H, Martin K. Expression pro-
filing of the whole Arabidopsis shaggy-like kinase multigene
family by real-time reverse transcriptase-polymerase chain
reaction. Plant Physiol, 2002, 130: 577−590